Estudos genéticos e moleculares em um grande grupo de pacientes com malformações do córtex cerebral

Genetics and molecular study in group of patients with malformations of cerebral cortex

AWARDS WORKS: EXPANDED ABSTRACT

Estudos genéticos e moleculares em um grande grupo de pacientes com malformações do córtex cerebral^*

Genetics and molecular study in group of patients with malformations of cerebral cortex

Fábio Rossi Torres; Daniela Aguiar de Souza-Kols; Simone Sayuri Tsuneda; Rodrigo Secolin; Iara Leda Brandão de Almeida; Camila Fernanda Lopes; Maria do Carmo Sousa Rodrigues; Maria Augusta Montenegro; Antonia Paula Marques-de-Faria; Marilisa Mantovani Guerreiro; Juan Clinton Llerena Jr; Fernando Cendes; Iscia Lopes-Cendes

Departamento de Neurologia, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas; Departamento de Genética, Fundação Instituto Oswaldo Cruz

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

OBJETIVOS: As malformações do córtex cerebral (MCC) são uma causa importante de epilepsia. Nossas metas foram: triagem de mutações em genes associados às MCC (FLN1, LIS1, DCX e EMX2), investigar funcionalmente as mutações e mapear o locus para polimicrogiria perisylviana familiar.

MÉTODOS: A triagem de mutações foi realizada por PCR, DHPLC e sequênciamento. Estudo funcional foi realizado por RT-PCR, PCR em tempo real e HUMARA. O estudo de ligação foi realizado por PCR e análise com programas Fragment Profiler^® e MLINK^®.

RESULTADOS: Mutações deletérias foram identificadas em 3/108 pacientes. Uma mutação de splicing (G987C) em FLN1 foi identificada em duas pacientes aparentadas com heterotopia nodular periventricular. Mudança no padrão de inativação do cromossomo X é responsável pelas diferenças clínicas entre as pacientes. Uma substituição A1385C (H277P) foi identificada em LIS1 em um indivíduo com lissencefalia. Alterações neutras foram identificadas em DCX e EMX2. A análise de ligação identificou um locus em Xq27.2-Xq27.3 para polimicrogiria familiar.

CONCLUSÃO: Mosaicismo, mutações em regiões não codificantes, deleções, rearranjos e casos atípicos podem estar contribuindo para a baixa freqüência de mutações identificadas. Esquizencefalia e polimicrogiria parecem não ter base genética relacionada com o gene EMX2. Um novo locus candidato em Xq27.2-Xq27.3 foi identificado para polimicrogiria perisylviana familiar.

Unitermos: Sistema nervoso central, desenvolvimento, malformações corticais, genética.

ABSTRACT

OBJECTIVES: Malformations of cerebral cortex (MCC) are an important cause of epilepsy. Our main goals were: to search for mutations in genes responsible for MCC (FLN1, LIS1, DCX and EMX2), to map the locus for familial perisylvian polymicrogyria and to investigate the molecular mechanisms of the mutations identified. Methods: Mutation screening was performed by PCR, DHPLC and sequencing. HUMARA and Real Time PCR were performed to study the molecular mechanisms of mutations. Linkage analysis was carried out by PCR, Fragment profiler^® and MLINK^® software.

RESULTS: Deleterious mutations were identified in 3/108 patients. We found a G987C splicing mutation in the FLN1 in two related patients with periventricular nodular heterotopia. Skewed X-chromosome inactivation was detected as the possible mechanism responsible for clinical differences observed in the two patients. An A1385C transversion (H277P) in LIS1 was identified in one patient with lisencephaly. Only neutral variants were identified in DCX and EMX2. Linkage analysis has detected a locus in Xq27.2-Xq27.3 for familial polymicrogyria.

CONCLUSION: We believe that the low frequency of mutations identified may be due to mosaicism, mutations in non-coding regions, deletions and patients with atypical neuroimaging findings. Deleterious mutations in EMX2 were not found in patients with schizencephaly and polymicrogyria. We found a locus for familial perisylvian polymicrogyria in Xq27.2-Xq27.3.

Key words: Central Nervous System, development, cortical malformations, genetics.

INTRODUÇÃO

As malformações do córtex cerebral (MCC) são uma importante causa de epilepsia.⁷ A etiologia das MCC, geralmente, está relacionada a insultos pré-natais.^9,20 No entanto avanços nos estudos dos mecanismos moleculares de desenvolvimento do córtex cerebral e uma maior disponibilidade de exames de ressonância magnética (RM) têm demonstrado que as MCC também podem ser conseqüências de fatores genéticos. Vários genes foram identificados responsáveis por MCC: FLN1 para heterotopia nodular periventricular (HNP)⁴, LIS1 e DCX para o espectro da lissencefalia-heterotopia subcortical em banda (LIS-HSB)^11,2EMX2 para a esquizencefalia¹ e possivelmente polimicrogiria, embora ainda haja controvérsias sobre este último. Desta forma, os principais objetivos deste trabalho foram: 1) realizar uma triagem de mutações nos quatro principais genes responsáveis por MCC (FLN1, LIS1, DCX e EMX2) em um grande grupo de pacientes acometidos por estas malformações, 2) investigar o mecanismo molecular das mutações identificadas, 3) mapear o locus candidato para polimicrogiria perisylviana bilateral (PPB) familiar através da técnica de análise de ligação.

MÉTODOS

Pacientes

Todos os pacientes participantes deste trabalho foram analisados por um médico neurologista. O diagnóstico e classificação das malformações corticais foram realizados através de exames de ressonância magnética e, quando está não era disponível por alguma razão, por tomografia computadorizada (usada em apenas 19 pacientes com esquizencefalia e dois com LIS-HSB não seguidos em nosso serviço). A classificação do gradiente de severidade do espectro LIS-HSB foi realizada segundo um sistema anteriormente descrito³. Um questionário semi-estruturado foi utilizado para se obter informações sobre a história clinica e familiar dos pacientes, incluindo antecedentes de epilepsia ou outras condições neurológicas em parentes de primeiro, segundo e terceiro grau e também de antecedentes pré-natais. Todos os pacientes participantes deste projeto assinaram um termo de consentimento aprovado pelo comitê de ética em pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP (CEP/FCM) e pela comissão nacional de ética em pesquisa (CONEP).

Triagem de Mutações

O DNA genômico dos pacientes foi extraído de linfócitos provenientes do sangue periférico pela técnica de fenol-clorofórmio. A amplificação das regiões codificantes dos genes candidatos foi realizada pela técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR). Para o gene FLN1 somente os cinco primeiros exons codificantes foram analisados. Os pacientes com HNP foram testados para o gene FLN1, os indivíduos com o espectro LIS-HSB foram analisados para os genes LIS1 e DCX, enquanto os pacientes acometidos por esquizencefalia e PPB foram testados para o gene EMX2. Os produtos amplificados foram submetidos à técnica de denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) em um cromatógrafo WAVE 4500^® (Transgenomic, San Jose, CA) e, quando apresentavam padrões de eluição diferentes dos controles normais, foram seqüenciados com Big Dye Terminator Sequencing kit^® (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) para seqüenciador Megabace 1000^® (GE Healthcare, Buckinghamshine, UK). As alterações identificadas foram testadas in silico, com os programas de computador Polyphen e SIFT, além da escala Grantham⁵, para aferir se as mesmas eram patogênicas.

Estudos Funcionais da Mutação 987G>C no gene FLN1

O RNA total dos pacientes analisados foi extraído de linfócitos do sangue periférico pelo método de Trizol. A reação de RT-PCR foi realizada com o kit Improm II^TMReverse Transcriptase System (Promega, Madison, WI, USA) seguindo recomendações do fabricante. O cDNA resultante foi amplificado por PCR com primers específicos flanqueando a região exon 6, intron 6, exon 7. Os produtos de PCR foram submetidos a eletroforese em gel de agarose e, em seguida, purificados e clonados em células de E. coli DH5α através de um vetor pGEM^TM (Promega, Madison, WI, USA) sendo posteriormente seqüenciados.

Os experimentos de inativação do cromossomo X foram realizados pela técnica de HUMARA (human androgen receptor gene), utilizando primers marcados com fluoróforos e DNA genômico. Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel e quantificados pelo programa ImageQuantTL^TM em um aparelho Typhoon^TM (GE Health-care, Chalfont St. Giles, United Kingdom). Os estudos de expressão foram realizados em um aparelho de Real Time PCR (7500 Real Time PCR system da Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) com o sistema TaqMan^TM (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) seguindo recomendações do fabricante. Os primers e a sonda foram obtidos da Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) e o gene 18S foi utilizado como controle endógeno. Todos os experimentos de quantificação relativa foram realizados em triplicata e o teste do X2 foi utilizado para medir as diferenças entre a expressão gênica das duas pacientes com mutação.

Análise de Ligação

O estudo de ligação foi realizado em uma família com PPB composta de um total de 15 indivíduos. Amostras de DNA dos participantes foram genotipadas para 18 marcadores microsatélites flanqueando um intervalo de 42.3cM no cromossomo Xq27-q28. A reação de PCR foi realizada com primers marcados com fluoróforos FAM, VIC^TM ou NED (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os produtos de PCR marcados com fluorocromo foram analisados em um seqüenciador automático MegaBACE 1000^TM e a análise dos alelos foi realizada com os programas Fragment Profiler^® (GE Heathcare). Os dados obtidos pelo programa Fragment Profiler^® foram processados com o programa LINKGEN. A análise de ligação de dois pontos e múltiplos pontos foi calculada com os programas MLINK^© e LINMAP^© (versão 5.2) (CEPH, University of Utah, Columbia University, 1990). O programa GENEHUNTER^© foi utilizado para construção do haplótipo.⁶ Valores de lod score (Z) iguais ou maiores que 2.00 são indicativos de ligação entre o marcador e a doença.¹⁴

RESULTADOS

Pacientes

Um total de 108 pacientes com diferentes formas de MCC foi inicialmente analisado por DHPLC para a presença de mutações em genes candidatos. Treze pacientes possuem HNP (10 mulheres e três homens); sendo que quatro apresentam o padrão clássico (nódulos neuronais bilaterais nas margens dos ventrículos laterais sem nenhuma malformação do córtex adjacente) e nove padrões atípicos (nódulos neuronais unilaterais, altamente assimétricos ou localizados focalmente, nódulos localizados da superfície do córtex até os ventrículos e associação de outras malformações corticais). Foram identificados 19 pacientes portadores do espectro LIS-HSB (11 mulheres e oito homens), sendo que 10 apresentam LIS (três mulheres e sete homens) enquanto outros nove são afetados por HSB (oito mulheres e um homem). Também foram estudados 46 pacientes com esquizencefalia (23 mulheres e 23 homens) e 30 com PPB (oito mulheres e 22 homens). Dentro desta casuística foram identificados dois casos familiares de HNP (mãe e filha), nenhum caso familiar do espectro LIS-HSB, dois casos familiares de esquizencefalia (duas irmãs) e 20 casos familiares de PPB (distribuídos em seis famílias). Dentre os casos familiares de PPB, foi identificada uma grande família com padrão de herança autossômico dominante ligado ao cromossomo X e poder estatístico suficiente para estudos de ligação genética.

Triagem de Mutações

A análise por DHPLC identificou padrões de eluição alterados para todos os genes estudados. O sequênciamento dos produtos de amplificação para o gene FLN1 identificou dois SNPs (single nucleotide polymorphism) não patogênicos já descritos na base de dados do NCBI (National Center Biotecnology Information), IVSV + 519C>G (NCBI, rs4898478) e IVSV + 506C>T (NCBI, rs4898479), além de uma substituição G987C (NCBI, NM 001456) presente em dois pacientes relacionados (mãe e filha) e ausente em 50 indivíduos controles (ver figura na ref. 17). Para o gene LIS1 foram detectadas alterações neutras C1805T (NCBI, rs6628) e IVSVI+ 27C>T (NCBI, rs3213696), além de outras substituições como G1670C (NCBI, NM_000430) que supostamente levaria a troca de uma troca de cisteina para serina na posição 372 da proteína (C372S), G1368C (NCBI, NM_000430) e G1383C (NCBI, NM_000430) que trocam respectivamente um glutamato para um aspartato nas posições 271 (E271D) e 276 (E276D) da proteína, sendo todas as alterações também identificadas em um grupo controle. Uma alteração A1385C, (NCBI, NM 0004300) foi identificada no gene LIS1 em um paciente com lissencefalia grave grau 3a (ver figura na ref. 16). A ausência da alteração em um grupo controle e a confirmação de sua patogenicidade através da escala Grantham⁵ e dos programas SIFT e Polyphen sugerem que a mesma se trata de uma mutação deletéria. A análise do gene DCX revelou apenas duas variantes neutras não descritas na base de dados do NCBI: IVSII+28G>A e IVSV+19G>A. Para o gene EMX2 foi identificada uma alteração neutra C796A (NCBI; NM_004098) que não altera a arginina na posição 156 da proteína em quatro pacientes com esquizencefalia, esta mesma alteração foi identificada no grupo controle. A análise por DHPLC não identificou nenhum padrão de eluição alterado no gene EMX2 em pacientes com PPB.

Estudos Funcionais da Mutação 987G>C no gene FLN1

Através de análise em gel de eletroforese foi demonstrado que o produto de PCR do cDNA da mãe e filha possuíam tamanhos moleculares diferentes (maiores) quando comparados com controles normais. O sequênciamento dos produtos de PCR mostrou a presença da seqüência completa do intron 6 no cDNA dos pacientes (ver figura na ref. 17). Análises com programas de bioinformática mostraram que a manutenção do intron insere um codon de parada prematuro na matriz de leitura do RNAm do gene FLN1.¹⁷

Estudos de inativação do cromossomo X realizados com DNA proveniente de sangue periférico revelaram um padrão de inativação não randômico no probando (filha).¹⁷ O PCR quantitativo em tempo real mostrou uma expressão aumentada do alelo mutante no probando quando comparado com a mãe (ver figura na ref. 17).

Análise de Ligação

Valores significativos de lod score de dois pontos foram obtidos para dois marcadores (DXS1205 e DXS1227) com Zmax = 2.06 a θ = 0.0 (13). O calculo de lod score de múltiplos pontos indicou uma região candidata de 13 cM entre os marcadores DXS1205 e DXS8043, localizados no cromossomo Xq27.2-Xq27.3.¹³

DISCUSSÃO

Alterações deletérias foram identificadas em apenas 3/108 pacientes estudados. Acreditamos que a presença de mosaicismo somático, mutações em regiões não codificantes, grandes deleções e rearranjos estruturais, além da presença de um significativo número de casos com padrões de neuroimagem atípicos, são fatores que podem estar influenciando na baixa freqüência de mutações encontradas no nosso grupo de pacientes, especialmente os portadores de HNP e do espectro LIS-HSB. A única mutação encontrada no gene FLN1, em duas pacientes aparentadas com a forma clássica e bilateral de HNP, confirma a alta freqüência de alterações deletérias em casos familiares de HNP.¹⁰ A mutação G987C no gene FLN1, devido a sua posição, poderia atuar como mutação de sentido trocado ou como de sitio de splicing, é importante ressaltar que mutações de sentido trocado (ganho de função) localizadas nos primeiros exons do gene FLN1 levam as síndromes otopalatodigital tipo 1 e 2, displasia frontometafiseal e síndrome de Melnick-Needles¹², distintas da HNP. Nossos resultados demonstraram que o efeito da mutação é a destruição do sitio de splicing do sexto intron do gene FLN1, confirmando que mutações de perda de função localizadas nos primeiros exons deste gene estão associadas com HNP. Além do mais, há uma diferença de manifestação clínica evidente entre as duas pacientes portando esta mutação, os nódulos assim como a refratariedade das crises e déficits neurológicos são muito mais proeminentes na filha do que na mãe. Estas diferenças poderiam ser explicadas por mecanismos de inativação não randômica do cromossomo X favorecendo uma maior expressão do alelo mutante, nossos experimentos de HUMARA e PCR em tempo real confirmam esta hipótese. Em relação à mutação identificada no gene LIS1 pudemos confirmar que mutações de sentido trocado são raras em pacientes com LIS-HSB¹⁸ e que a localização destas mutações em regiões carboxi-terminais da proteína LIS1 não está relacionada a fenótipos menos severos como relatado anteriormente,⁸ sendo necessários maiores estudos para uma correlação mais precisa entre a natureza da mutação e grau de malformação do espectro LIS-HSB. Para o grupo de pacientes com esquizencefalia e PPB, os resultados negativos para o gene EMX2 eram até certo ponto esperados, já que trabalhos recentes pesquisando mutações neste gene em pacientes com esquizencefalia não identificaram mutações patogênicas no mesmo,¹⁵ portanto nosso trabalho exclui o EMX2 da etiologia da maioria dos casos de esquizencefalia e PPB. Após os experimentos de triagem de mutações, estudamos por análise de ligação uma grande família segregando PPB. A análise de marcadores microsatélites revelou um novo locus candidato em Xq27.2-Xq27.3 de localização mais centromérica ao descrito por outro grupo,¹⁹ evidenciando a presença de heterogeneidade genética para PPB familiar. Uma triagem de mutações nos genes candidatos localizados dentro da região Xq27.2-Xq27.3 está sendo realizada no momento com o objetivo de identificar o gene responsável por PPB.

AGRADECIMENTOS

Gostaríamos de agradecer a todos pacientes e seus familiares, pois sem a boa vontade dos mesmos este trabalho não seria possível. Agradecemos também à CAPES e à FAPESP pelo apoio financeiro.

Received June 16, 2008; accepted July 18, 2008.

* Trabalho premiado com o Prêmio Aristides Leão durante o XXXII Congresso Brasileiro de Eplepsia 2008.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  05 Jan 2009
• Data do Fascículo
  Set 2008

Histórico

• Aceito
  18 Jul 2008
• Recebido
  16 Jun 2008