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Epilepsia e neuroproteção: o papel do agonista adenosinérgico A1(RPia) na modulação da crise induzida por pilocarpina

Epilepsy and neuroprotection: employment of the RPia during status epilepticus induced by pilocarpine

Resumos

OBJETIVO: O objetivo desse estudo foi caracterizar a neuroproteção do RPia em ratos submetidos ao status epilepticus (SE) induzido pela pilocarpina (Pilo). MÉTODOS: Avaliou-se o balanço entre utilização local da glicose cerebral (ULGC) e fluxo sanguíneo cerebral local (FSCL) após 4 horas de SE, e a marcação por Fluoro Jade-B (FJB), 24 horas e 90 dias após SE. Quatro grupos foram avaliados: Salina, Pilo, RPia+Salina e RPia+Pilo. RESULTADOS E CONCLUSÃO: Aumentos significantes na ULGC foram observados na maioria das regiões avaliadas nos grupos Pilo e RPia+Pilo quando comparados ao controle. Entretanto, redução significante na ULGC ocorreu na substância negra pars reticulata e giro denteado do grupo RPia+Pilo versus Pilo. Houve aumento significante do FSCL em todas as áreas estudadas, comparando-se os grupos Pilo e RPia+Pilo com o controle. Foi observado um aumento significante do FSCL durante SE em CA2, CA3, giro denteado, córtex entorrinal, corpo mamilar, núcleos talâmicos, núcleo rubro, zona incerta, núcleo oral da ponte e córtex visual, no grupo pré-tratado com RPia comparado ao tratado somente com Pilo. Grande número de células marcadas com FJB foi observado no grupo Pilo e o pré-tratamento com RPia reduziu essa marcação na formação hipocampal, córtex piriforme, amígdala basolateral e substância negra pars compacta.

Pilocarpina; neuroproteção; adenosina; metabolismo de glicose; fluxo sanguíneo cerebral


OBJECTIVE: The aim of this study was to characterize the neuroprotection of the RPia in rats subjected to status epilepticus (SE) induced by pilocarpine (Pilo). METHODS: We evaluated the mismatch between local cerebral glucose utilisation (LCGU) and local cerebral blood flow (LCBF) 4 hours after SE induction. Neuronal loss was evaluated by Fluoro Jade-B (FJB) 24 hours and 90 days after SE. Four groups were studied: Saline, Pilo, RPia+Saline and RPia+Pilo. RESULTS AND CONCLUSIONS: Significant increases in the LCGU were observed in the almost all brain regions of Pilo and RPia+Pilo groups compared to control. However, significant reduction in the LCGU occurred in the substantia nigra pars reticulata and hippocampal formation of RPia+Pilo group versus Pilo. There was significant increase of the LCBF in all the studied areas, comparing the Pilo and RPia+Pilo groups with the control. The increases of LCBF was more intense in rats from RPia+Pilo compared to Pilo, and located mainly in CA2, CA3, dentate gyrus, entorhinal cortex, thalamic nuclei, mammillary body, red nucleus, zone incerta, pontine nucleus and visual cortex. A great number FJB stained cells was observed in the Pilo group and RPia pretreatment reduced the staining in the hippocampal formation, piriform cortex, basolateral amygdala and substantia nigra pars compacta.

Pilocarpine; neuroprotection; adenosine; glucose metabolism; cerebral blood flow


AWARDS WORKS: EXPANDED ABSTRACT

Epilepsia e neuroproteção: o papel do agonista adenosinérgico A1(RPia) na modulação da crise induzida por pilocarpina* Endereço para correspondência: Maria José da Silva Fernandes Rua Pedro de Toledo, 781 - 6º andar CEP: 04039-032, São Paulo, SP, Brasil E-mail: fernandes.nexp@epm.br

Epilepsy and neuroprotection: employment of the RPia during status epilepticus induced by pilocarpine

Iara Ribeiro SilvaI; Astrid NehligII; Fernanda Elisa RosimI; Thiago VignoliI; Daniele Suzete PersikeI; João Paulo BliniI; Esper Abrão CavalheiroI; Rita Sinigaglia-CoimbraIII; Maria José da Silva FernandesI

IDepartamento de Neurologia e Neurocirurgia - Disciplina de Neurologia Experimental - UNIFESP - São Paulo, SP

IIUniversité Louis Pasteur - INSERM Unité 465 - Estrasburgo, França

IIICentro de Microscopia Eletrônica - UNIFESP - São Paulo, SP

Endereço para correspondência Endereço para correspondência: Maria José da Silva Fernandes Rua Pedro de Toledo, 781 - 6º andar CEP: 04039-032, São Paulo, SP, Brasil E-mail: fernandes.nexp@epm.br

RESUMO

OBJETIVO: O objetivo desse estudo foi caracterizar a neuroproteção do RPia em ratos submetidos ao status epilepticus (SE) induzido pela pilocarpina (Pilo).

MÉTODOS: Avaliou-se o balanço entre utilização local da glicose cerebral (ULGC) e fluxo sanguíneo cerebral local (FSCL) após 4 horas de SE, e a marcação por Fluoro Jade-B (FJB), 24 horas e 90 dias após SE. Quatro grupos foram avaliados: Salina, Pilo, RPia+Salina e RPia+Pilo.

RESULTADOS E CONCLUSÃO: Aumentos significantes na ULGC foram observados na maioria das regiões avaliadas nos grupos Pilo e RPia+Pilo quando comparados ao controle. Entretanto, redução significante na ULGC ocorreu na substância negra pars reticulata e giro denteado do grupo RPia+Pilo versus Pilo. Houve aumento significante do FSCL em todas as áreas estudadas, comparando-se os grupos Pilo e RPia+Pilo com o controle. Foi observado um aumento significante do FSCL durante SE em CA2, CA3, giro denteado, córtex entorrinal, corpo mamilar, núcleos talâmicos, núcleo rubro, zona incerta, núcleo oral da ponte e córtex visual, no grupo pré-tratado com RPia comparado ao tratado somente com Pilo. Grande número de células marcadas com FJB foi observado no grupo Pilo e o pré-tratamento com RPia reduziu essa marcação na formação hipocampal, córtex piriforme, amígdala basolateral e substância negra pars compacta.

Unitermos: Pilocarpina; neuroproteção; adenosina; metabolismo de glicose; fluxo sanguíneo cerebral.

ABSTRACT

OBJECTIVE: The aim of this study was to characterize the neuroprotection of the RPia in rats subjected to status epilepticus (SE) induced by pilocarpine (Pilo).

METHODS: We evaluated the mismatch between local cerebral glucose utilisation (LCGU) and local cerebral blood flow (LCBF) 4 hours after SE induction. Neuronal loss was evaluated by Fluoro Jade-B (FJB) 24 hours and 90 days after SE. Four groups were studied: Saline, Pilo, RPia+Saline and RPia+Pilo.

RESULTS AND CONCLUSIONS: Significant increases in the LCGU were observed in the almost all brain regions of Pilo and RPia+Pilo groups compared to control. However, significant reduction in the LCGU occurred in the substantia nigra pars reticulata and hippocampal formation of RPia+Pilo group versus Pilo. There was significant increase of the LCBF in all the studied areas, comparing the Pilo and RPia+Pilo groups with the control. The increases of LCBF was more intense in rats from RPia+Pilo compared to Pilo, and located mainly in CA2, CA3, dentate gyrus, entorhinal cortex, thalamic nuclei, mammillary body, red nucleus, zone incerta, pontine nucleus and visual cortex. A great number FJB stained cells was observed in the Pilo group and RPia pretreatment reduced the staining in the hippocampal formation, piriform cortex, basolateral amygdala and substantia nigra pars compacta.

Key words: Pilocarpine; neuroprotection; adenosine; glucose metabolism; cerebral blood flow.

INTRODUÇÃO

A epilepsia é uma desordem neurológica caracterizada pelo aparecimento de crises espontâneas devido à hiperatividade neuronal.12 A epilepsia do lobo temporal (ELT) é uma forma comum dentre as epilepsias, compreendendo cerca de 40% de todos os casos.5,17 O modelo da pilocarpina vem sendo extensamente utilizado por reproduzir as principais características da epilepsia do lobo temporal (ELT) humana".10 Este modelo consiste na administração (i.p.) de altas doses de pilocarpina (300-380mg/kg), desencadeando uma seqüência de alterações comportamentais e eletrencefalográficas que incluem crises límbicas e estado de mal epiléptico podendo durar até 12 horas (fase aguda), seguido por um período de normalização de aproximadamente 14 dias que caracteriza a fase latente, e o aparecimento de crises espontâneas e recorrentes marca o início da fase crônica do modelo.1

O uso desse modelo vem contribuindo para uma melhor compreensão da fisiopatologia da ELT, bem como possibilitando o estudo de novas terapias para amenizar os efeitos deletérios da crise. Nesse contexto, Vianna e colaboradores21 demonstraram que o uso de agonista adenosinérgico A1 promove neuroproteção no hipocampo de ratos submetidos ao modelo da pilocarpina.

A adenosina é um neuromodulador com potente efeito depressor na transmissão sináptica excitatória, especialmente por ativar receptores A1, e desempenha uma importante ação neuroprotetora contra os efeitos excito-tóxicos desencadeados pela alta liberação de glutamato durante a atividade ictal.2,3,4,6,11,21 Além da propriedade neuromodulatória, estudos apontam a vasodilatação e o aumento na produção de energia através do transporte de glicose como efeitos benéficos da adenosina.14

Alguns autores sugerem que o desequilíbrio entre o consumo de glicose cerebral local e o aporte sanguíneo durante SE pode ser um dos fatores envolvidos no processo lesional.7,8,13,20 Fernandes e colaboradores5 em um estudo do metabolismo da glicose utilizando a técnica da [C14]-2DG18 em ratos adultos tratados com lítio-pilocarpina, demonstraram uma correlação entre hipermetabolismo e morte neuronal em algumas regiões envolvidas com a circuitaria da crise. Estudos auto-radiográficos envolvendo a relação entre fluxo e metabolismo em animais adultos submetidos a crises severas ou SE confirmam que a morte neuronal pode ser resultado de um desequilíbrio entre esses dois sistemas.9,20

Estudos prévios demonstraram potente efeito neuroprotetor do agonista adenosinérgico A1, RPia, no modelo lesional induzido por pilocarpina.21 Sendo assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar o balanço entre a utilização local de glicose cerebral e o fluxo sanguíneo cerebral local durante SE induzido por pilocarpina em ratos pré-tratados com RPia, a fim de mapear possíveis alterações nesses sistemas e associá-las ao processo de neuroproteção.

MÉTODOS

Ratos machos da linhagem Wistar, pesando de 250g a 300g mantidos sob ciclo claro/escuro de 12 horas e com livre acesso a água e a ração, foram submetidos à aplicação de cloridrato de pilocarpina (4% - Sigma), na dose de 360mg/kg, i.p., 30 minutos após tratamento com metilescopolamina (1mg/kg, s.c. - Sigma), utilizada para minimizar os efeitos periféricos da pilocarpina(19).

O agonista adenosinérgico A1 RPia (R(-)N6-(2-fenilisopropil)adenosina, Sigma), foi administrado na dose de 25µg/kg (i.p.), 15 minutos antes da injeção de pilocarpina ou de salina. De acordo com o tratamento, foram obtidos os seguintes grupos (n=18/grupo, sendo 5 para estudo do metabolismo, 5 para estudo do fluxo e 8 para o estudo do FJB): Salina: animais tratados com salina e DMSO; Pilo: animais tratados com pilocarpina, após pré-tratamento com salina e dimetilsulfóxido (DMSO - Sigma); RPia+Salina: animais tratados com salina, após pré-tratamento com RPia; RPia+Pilo: animais tratados com pilocarpina, após pré-tratamento com RPia. Os grupos que foram submetidos à aplicação de RPia foram tratados com 1,5mg/kg de 8pSPT (8-p-sulfofenil)teofilina (i.p.), um antagonista adenosinérgico que minimiza os efeitos periféricos da adenosina. As drogas foram dissolvidas em DMSO e solução salina, na proporção de 1:5 (v/v).

Aproximadamente 24 horas antes da injeção de [C14]-2DG ou [C14]-IAP os animais foram submetidos ao procedimento cirúrgico para implantação dos cateteres (PE-50, Clay Adams) na artéria e veia femoral. A ULGC foi mensurada através do método de Sokoloff.18 A [C14]-2DG (300-350mCi/mmol - PerkinElmer) foi injetada por via intravenosa em concentração traço de 100µCi/kg, 4 horas após o início do SE (grupos experimentais) ou da aplicação de salina (grupos controles). Durante a administração de [C14]-2DG, amostras de sangue foram coletadas pelo cateter arterial para a obtenção do pico da concentração plasmática do radioisótopo e para análise da glicose sangüínea plasmática (Kit Glicose enzimática Liquida - Wiener). Após 45 minutos do início da administração de [C14]-2DG, os animais foram decapitados, os cérebros retirados, congelados em metilbutano (Sigma) à -25ºC e estocados em -80ºC até procedimentos seguintes.

A medida do fluxo sanguíneo cerebral local foi realizada através do método de Sakurada.16 Um volume de 1,0mL de IAP (56mCi/mmol; Amersham; 25mCi/mL) foi infundido por via intravenosa durante 1 minuto. Amostras de sangue arterial foram recolhidas e tratadas com 0,5 mL de solubilizador de tecido e 0,5 mL de peróxido de hidrogênio 30%, antes de ser submetido à contagem do C14 pelo equipamento contador de cintilação beta. Ao final do procedimento (1min), os ratos foram decapitados, seus cérebros retirados e congelados em metilbutano a -25°C e estocados a -80°C até serem processados. Cortes coronais (20µm) foram feitos em criostato a -20°C e recuperados em lamínulas para montagem dos filmes auto-radiográficos. Os padrões de C14 (Amersham) foram usados para a construção da curva de densidade óptica no momento da leitura dos filmes no sistema de análise de imagens. As concentrações das regiões cerebrais foram estimadas de acordo com o nível de cinza em relação à curva padrão.

Animais experimentais, 24 horas ou 3 meses após o insulto, e seus respectivos controles foram anestesiados e perfundidos por via transcardíaca com solução fixadora de formaldeído tamponado a 4%. Após, os cérebros foram fatiados em vibrátomo em cortes coronais de 40µm. As secções foram montadas em lâminas gelatinizadas e secas a temperatura ambiente. A reação foi feita em imersões consecutivas de álcool (80 e 70%), água destilada, permanganato de potássio 0.06% (15min), seguido de lavagens com água destilada, imersão em solução de FJB a 0.01% em ácido acético 0.1% sob leve agitação por 30min e sucessivas lavagens em água destilada. As lâminas foram secas em placa aquecida (50°C -10min), desidratadas em álcool, diafanizadas em xileno e montadas com "Vecta Mount" (Vector).

RESULTADOS

Não foram observadas diferenças significantes nos níveis de pressão arterial, glicose arterial, pH, pCO2 e pO2 entre os grupos estudados durante o experimento (Tabela 1).

Aumentos significantes na ULGC foram observados em 38 das 44 regiões cerebrais de ratos do grupo Pilo comparados ao grupo controle e em 43 das 44 regiões do grupo RPia+Pilo quando comparado ao controle (ANOVA pós-teste de Bonferroni). A comparação entre os grupos experimentais Pilo e RPia+Pilo revelou diminuição significante na ULGC do giro denteado (-54,01%; p<0.001) e da substância negra pars reticulata (-67,96%; p<0.001) nos animais do grupo RPia+Pilo (Figura 1).


Foram observados aumentos significantes dos valores de FSCL em todas as áreas avaliadas, quando comparados os grupos experimentais Pilo e RPia+Pilo com seus respectivos controles. Durante SE houve aumento significante do FSCL em CA2 (27,68%, p<0,05); CA3 (27,43%, p<0,01); giro denteado (27,53%, p<0,05); córtex entorrinal (29,46%, p<0,05); corpo mamilar (31,25%, p<0,05); tálamo médio-dorsal (38,57%, p<0,01); tálamo ventro-póstero medial (30,07%, p<0,05); núcleo rubro (14,72%, p<0,05); tálamo posterior (34,82%, p<0,05); corpo geniculado medial (30,71%, p<0,05); zona incerta (31,87%, p<0,01); núcleo oral da ponte (34,82%, p<0,05); córtex visual (40,41%, p<0,05) no grupo pré-tratado com RPia em relação ao grupo tratado somente com pilocarpina (Figura 2).


O pré-tratamento com RPia reduziu a intensidade da marcação por FJB na formação hipocampal e no córtex piriforme 24 horas após início do SE (Figura 3). Além dessas áreas, 90 dias após o insulto, observou-se neuroproteção na amígdala basolateral e substância negra pars compacta. A reação foi negativa nos animais controles (Figura 4).



CONCLUSÕES

O pré-tratamento com RPia em ratos submetidos ao modelo da pilocarpina promoveu hipometabolismo durante o SE em regiões envolvidas na circuitaria da crise, como por exemplo, o giro denteado e a substância negra pars reticulata. Concomitantemente, detectou-se hiperfluxo em áreas como CA2; CA3; giro denteado; córtex entorrinal; corpo mamilar; núcleos médio-dorsal, ventro-póstero medial e posterior do tálamo; corpo geniculado medial; núcleo rubro; zona incerta; núcleo oral da ponte e córtex visual. O resultado indica modulação desses sistemas pelo RPia favorecendo processos de neuroproteção que foi demonstrada pela redução na densidade de células marcadas pelo FJB no hipocampo, córtex piriforme, amígdala basolateral e substância negra pars compacta de ratos pré-tratados.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem o apoio financeiro do CnPq, Capes, Fapesp e Fap-Unifesp.

Received June 16, 2008; accepted July 18, 2008.

Departamento de Neurologia e Neurocirurgia - Disciplina de Neurologia Experimental - UNIFESP - São Paulo, SP

* Trabalho premiado com o Prêmio Aristides Leão durante o XXXII Congresso Brasileiro de Eplepsia.

  • 1. Cavalheiro EA. The pilocarpine model of epilepsy. Ital J Neurol Sci. 1995; 16(1-2):33-7.
  • 2. Dunwiddie TV. Adenosine and Supression of Seizures. Advances in Neurology 1999; 3:1001-10.
  • 3. Dunwiddie TV, Fredholm BB. Adenosine A1 receptors inhibit adenylate cyclase activity and neurotransmitter release and hyperpolarize pyramidal neurons in rat hippocampus. J Pharmacol Exp Ther 1989; 249:31-7.
  • 4. Dunwiddie TV, Masino SA. The role and regulation of adenosine in the central nervous system. Ann Rev Neurosci 2001; 24: 31-55.
  • 5. Fernandes MJS, Dube C, Boyet S e col. Correlation between hypermetabolism and neuronal damage during status epilepticus induced by lithium and pilocarpine in immature and adult rats. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 1999; 19(2):195-9.
  • 6. Gouder N, Fritschy JM, Boison D. Seizure suppression by adenosine A1 receptor activation in a mouse model of pharmacoresistant epilepsy. Epilepsia 2003; 44(7):877-85.
  • 7. Handforth A, Treiman DM. Functional mapping of the early stages of status epilepticus: a 14C-deoxyglucose study in the lithium-pilocarpine model in rat. Neuroscience 1995; 64: 1057-73.
  • 8. Ingvar M. Cerebral blood flow and metabolic rate during seizures: relationship to epileptic brain damage. Ann NY Acad Sci 1986; 462:207-23.
  • 9. Ingvar M. Siesjö BK. Local blood flow and glucose consumption in the rat brain during sustained bicuculine-indeced seizures. Acta Neurol Scand 1983; 68:129-44.
  • 10. Leite JP, Garcia-Cairasco N, Cavalheiro EA. New insights from the use of pilocarpine and kainate models. Epilepsy Research 2002; 50:93-103.
  • 11. MacGregor DG, Stones TW. Inhibition by adenosine analogue, (R)-N6- phenylisopropiladenosine, of kainic acid neurotoxicity in rat hippocampus after systemic administration. Br J Pharmacol 1993; 109:316-21.
  • 12. McNamara J.O. Emerging insights into the Genesis of epilepsy. Nature 1999; 399:A15-22.
  • 13. Meldrum, BS. Metabolic factors during prolonged seizures and their relation to nerve cell death. Adv Neurol 1983; 34:261-75.
  • 14. Ramkumar V, Nie Z, Rybak L, Maggirwar SB. Adenosine, antioxidant enzymes and cytoprotection. TiPS 1995; 16:283-5.
  • 15. Regesta G, Tanganelli P. Clinical aspects and biological bases of drug-resistant epilepsies. Epilepsy Res 1999; 34(2-3):109-22.
  • 16. Sakurada O, Kennedy C, Jehle J e col. Mensurement of local cerebral blood flow [14C] iodoantipyrine. Am J Physiol 1978; 234: H59-66.
  • 17. Sloviter RS. The neurobiology of temporal lobe epilepsy: too much information, not enough knowledge. Comptes Rendus Biologies 2005; 328:143-53.
  • 18. Sokoloff L, Reivich M, Kennedy C e col. The [14C] deoxyglucose method for the measurement of local cerebral glucose utilization: theory, procedure, and normal values in the conscious and anesthetized albino rat. Journal of Neurochemistry 1977; 28:897-916.
  • 19. Turski WA, Czuczwar SJ, Kleinrok Z e col. Cholinomimetics produce seizures and brain damage in rats. Experientia 1983; 9(12):1408-11.
  • 20. Vasconcelos, A P. Local Cerebral Blood flow during lithium-pilocarpine seizures in the developing and adult rat: role of coupling between blood flow and metabolism in the genesis of neuronal damage. Journal of Cerebral Blood Flow &Metabolism 2002; 22:196-205.
  • 21. Vianna EPM, Ferreira AT, Dona F e cols. Modulation of seizures and synaptic plasticity by adenosinergic receptors in an experimental model of temporal lobe epilepsy induced by pilocarpine in rats. Epilepsia 2005; 46(5):166-73.
  • Endereço para correspondência:
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  • Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      05 Jan 2009
    • Data do Fascículo
      Set 2008

    Histórico

    • Aceito
      18 Jul 2008
    • Recebido
      16 Jun 2008
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