Frequência de polimorfismo de nucleotídeo único de alguns genes da resposta imune em amostra populacional da cidade de São Paulo, Brasil

RESUMO

Objetivo:

Apresentar a frequência de polimorfismo de nucleotídeo único de alguns genes da resposta imune em amostra populacional da cidade de São Paulo (SP).

Métodos:

Foram apresentadas as frequências de alelos de conhecidos polimorfismos de genes de imunidade inata e adquirida, a maioria com impacto funcional comprovado. Os dados foram coletados a partir de amostras de indivíduos saudáveis, irmãos não-HLA idênticos, de receptores de transplante de medula óssea do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, obtidos entre 1998 e 2005. O número de amostras variou para cada polimorfismo de nucleotídeo único analisado por reação em cadeia pela polimerase seguida de clivagem com enzimas de restrição.

Resultados:

Apresentou-se a distribuição de alelos e genótipos de 41 polimorfismos genéticos, a maioria de genes para citocinas, mas também incluindo outros genes de resposta imune.

Conclusão:

Acreditamos que os dados apresentados aqui possam ser de grande valor para definir quais os polimorfismos presentes em frequências relevantes, para estudos caso-controle e para avaliar alvos de intervenção terapêutica nas doenças poligênicas com componente de resposta imune ou inflamatória.

Descritores:
Polimorfismo genético; Imunidade inata; Citocinas

ABSTRACT

Objective:

To present the frequency of single nucleotide polymorphisms of a few immune response genes in a population sample from São Paulo City (SP), Brazil.

Methods:

Data on allele frequencies of known polymorphisms of innate and acquired immunity genes were presented, the majority with proven impact on gene function. Data were gathered from a sample of healthy individuals, non-HLA identical siblings of bone marrow transplant recipients from the Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, obtained between 1998 and 2005. The number of samples varied for each single nucleotide polymorphism analyzed by polymerase chain reaction followed by restriction enzyme cleavage.

Results:

Allele and genotype distribution of 41 different gene polymorphisms, mostly cytokines, but also including other immune response genes, were presented.

Conclusion:

We believe that the data presented here can be of great value for case-control studies, to define which polymorphisms are present in biologically relevant frequencies and to assess targets for therapeutic intervention in polygenic diseases with a component of immune and inflammatory responses.

Keywords:
Polymorphism, genetic; Immunity, innate; Cytokines

INTRODUÇÃO

Ao longo dos últimos anos, tornou-se cada vez mais evidente que a variação genética individual é um componente essencial de respostas imunes em geral, que contribui para suscetibilidade, evolução, e desfecho de doenças infecciosas e autoimunes, além de câncer. Inúmeros estudos revelaram a extensão da variação genética humana enquanto tentavam mapear seu papel em doenças multifatoriais e poligênicas. Esses estudos demonstraram que há tipos diferentes de variantes, que abrangem desde polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs, do inglês single nucleotide polymorphism), com uma só alteração de base, até sequências repetitivas curtas e médias, além de variações no número de cópias, que podem se estender ao longo de grande segmentos de cromossomos. Atualmente, no estudo 1000 Genomes Project, genomas individuais estão sendo analisados com a finalidade de catalogar toda a extensão da variação genética humana. Iniciativas anteriores, como o HapMap, abordaram os SNPs para mapear variantes de genes que afetam saúde, doença, e respostas individuais a medicações e fatores ambientais. Hoje, o número de SNPs conhecidos está na faixa de 10 milhões e estimase que o HapMap contenha 80% de todas as SNPs com frequências de > 10%(¹) (os links úteis de Internet estão alistados no ^{Anexo 1}). Esses projetos têm uma característica comum: o mapeamento de centenas de milhares de variantes alélicos. As variantes úteis para esses estudos de associação do genoma (GWAS, do inglês genome-wide association study) exibem tipicamente frequências entre 0,5 e 5% e um grande número de casos e controles é necessário para obter um poder satisfatório. Por exemplo, um poder de 90% para detectar um alelo com uma frequência de 1%, com um fator de risco de 2 GWAS, demanda cerca de 20.000 amostras individuais(²). Esse número pode ser consideravelmente menor (~300) para uma frequência alélica rara de aproximadamente 10%. Um bom exemplo são os estudos conduzidos pelo Wellcome Trust Case Control Consortium, que analisou vários milhares de indivíduos em varreduras genômicas a fim de mapear o risco genético para diabetes tipo 2, artrite reumatoide, e doença de Crohn, entre outras doenças-alvo estudadas(³).

Por outro lado, o agrupamento de amostras também pode criar problemas. A heterogeneidade de doenças e diferenças populacionais agem como fatores de confusão, prejudicando a identificação de genes relevantes por causa do pequeno efeito que muitas das variantes têm sobre a doença em si.

O estudo do histórico genético de populações brasileiras sempre foi um tópico desafiador. Não há apenas um alto grau de miscigenação, mas também os dados colhidos de diferentes correntes migratórias diferem de uma região para a outra. As etnias ameríndia, caucasiana e africana contribuíram para essa verdadeira “mistura” desde o início da colonização pelos portugueses, há cinco séculos. Estudos que visam avaliar a relativa contribuição das três raças que formam o pool genético da população brasileira por meio de descendências matrilinear(⁴) e patrilinear(⁵), usando mtDNA e métodos baseados no cromossomo Y, confirmam os dados históricos de entrecruzamentos entre homens europeus e mulheres ameríndias e africanas(⁶,⁷).

Na Região Sudeste do Brasil, onde se localiza a cidade de São Paulo (SP), a composição da mistura inclui maioria de italianos, espanhóis e alemães. Entretanto, essa região também recebeu contribuição significante de africanos e povos indígenas. Além disso, como a cidade mais populosa da América do Sul, São Paulo sempre foi um importante destino de migrantes de outros locais do Brasil e de países vizinhos. Para justificar a mistura genética existente, alguns marcadores substitutos, tais como cor de pele, são empregados em muitos estudos. Todavia, Parra et al.(⁶) demonstraram que, em brasileiros, essa é uma substituição inadequada para ancestrais individuais. Escolhemos analisar indivíduos saudáveis, do mesmo nível socioeconômico que os pacientes atendidos no maior hospital de São Paulo. Esses indivíduos espelham a grande diversidade presente na população de São Paulo e, embora marcadores de ancestrais não tenham sido analisados, achamos que a informação deve ser relatada para ficar disponível para outros pesquisadores de campo, em sua busca por genes candidatos a estudos caso-controle dos muitos tipos diferentes de doenças que afligem os 19 milhões de habitantes da região metropolitana estendida de São Paulo.

Os dados mostrados neste trabalho incluem frequências de alelos de genes polimórficos em imunidade inata e adquirida, na maioria com impacto comprovado sobre a função gênica. A maioria dos polimorfismos mostrados aqui tem um impacto sobre os níveis de transcrição. Outros levam a alterações na força de ligação a seus ligantes correspondentes e/ou na transdução do sinal intracelular, e mesmo na meia-vida dos RNAs mensageiros.

O escopo deste trabalho não inclui informações detalhadas sobre os genes ou seus polimorfismos, que podem ser acessados em bons livros-texto(⁸).

Genes imunes inatos

O sistema imune inato depende da presença de padrões moleculares associados ao patógeno (PAMPs, do inglês pathogen-associated molecular patterns) em superfícies microbianas, o que resulta na ativação de células efetoras capazes de eliminar infecção e induzir inflamação nesse processo. Essas moléculas de reconhecimento tipo padrão podem ser associadas a células, como é o caso dos receptores Toll-like (TLRs)(⁹,¹⁰), ou solúveis, como no caso da família de proteínas lectinas que se ligam a manose(¹¹).

TLRs são expressos predominantemente em células apresentadoras de antígenos, na superfície (TLR 1, 2, 4, 6) ou no interior (TLR 3, 7, 9). Cada uma reconhece um PAMP específico, como o lipopolissacarídeo bacteriano Gram-negativo (TLR-4), flagelina (TLR-5), RNA viral de hélice única (TLR-7) ou dupla (TLR-3), DNA CpG derivado de bactéria (TLR-9). O TLR-4 é o principal representante da família, e é conhecido por responder a ligantes exógenos e endógenos, participando de respostas inflamatórias e locais do tecido a ferimentos, hipóxia ou outras formas de estresse. A resposta diminuída a lipopolissacarídeos foi mapeada para substituições de aminoácidos no gene TLR4(¹²).

O sistema do complemento pode ser ativado de formas diferentes: uma das quais é a via da lectina, iniciada pela lectina ligadora-de-manose (MBL), revisado com detalhes por Dommett et al.(¹³)). A MBL é um reagente de fase aguda que se liga à manose, açúcares e outros compostos microbianos por meio do domínio lectina. Uma vez ativada, a cascata começa com a clivagem de C4 e C2, por meio de MASP-1 e −2 ativado por MBL. É intrigante que MBL-2, a forma funcional de MBL em seres humanos, contém polimorfismos em regiões de codificação que levam a substituições de aminoácidos não preservadas. Além disso, existem polimorfismos promotores com forte desequilíbrio de ligação, o que resulta em haplótipos estendidos. Observa-se que a frequência desses alelos varia muito ao redor do mundo, e muitas doenças diferentes, infecciosas ou não, já foram estudadas(¹³).

Interleucina 10 e genes receptores

A interleucina (IL) 10 é a citocina efetora de regulação negativa prototípica na resposta imune. Sua ação é essencial para o controle da inflamação que acompanha respostas imunes. A ausência de IL-10 em modelos animais de doença leva a dano tissular, autoimunidade, ou infecção crônica. IL-10 é produzida por muitas células imunes diferentes, como macrófagos e células dendríticas, e linfócitos TH1, TH2 e TH17. Age contra a produção de interferon gama pró-inflamatório e aumenta a diferenciação de células T regulatórias(¹⁴). O gene que codifica IL-10 é altamente polimórfico, apresentando diferentes variantes na região 5′, e promotora com impacto sobre a produção in vitro e in vivo(¹⁵,¹⁶). IL-10 exerce suas ações por meio do receptor heterodimérico específico IL-10, em que a cadeia 1 é responsável pela alta afinidade de ligação(¹⁷).

Genes imunomoduladores na região de MHC classe III

Vários genes imunomoduladores se localizam na região de MHC (do inglês major histocompatibility complex) classe III. Além das bem conhecidas citocinas inflamatórias fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e linfotoxina alfa (LT-α), polimorfismos funcionais estão sendo estudados em genes descritos recentemente, como HLA-B associated transcript 1 (BAT1), nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor-like 1 (NFKBIL1) e leukocyte-specific transcript 1 (LST1)(¹⁸). O papel funcional exato desses três genes ainda não está claro.

BAT1, o mais telomérico dos três genes, é uma helicase RNA DEAD-box, um dos vários genes dessa região envolvidos no processamento de RNA(¹⁹) e um alvo importante para evasão imunológica por citomegalovírus(²⁰). NFKBIL1, uma proteína com certo grau de homologia com a família IκB, foi sugerida como participante no controle do nuclear transcription factor-kappa B (NF-κB) citosólico, uma molécula importante que governa a transcrição de mais de 200 diferentes genes de resposta imunológica(²¹). Um trabalho detalhado(²²) mostrou recentemente que NFKBIL1 é expresso em todos os tecidos, e que a proteína está presente em macrófagos e células T na sinóvia de pacientes com artrite reumatoide. Ademais, a despeito da aparente homologia, esse produto se liga ao mRNA e parece funcionar no processamento de RNA. Finalmente, LST1 é traduzido para múltiplas isoformas com expressão que varia de acordo com o tipo celular e a forma de indução. A expressão em células imunes é ampla e, como regra, leva a uma proliferação linfocitária diminuída.

IL-4, 5, 13 e genes receptores

IL-4 é uma citocina pleiotrópica essencial para a síntese de IgE em células B e para a diferenciação de células T no fenótipo TH2(²³). As células Th2 secretam IL-4, IL-13 e IL-5. Os mastócitos também secretam IL-5, e essa IL ativa eosinófilos. IL-5, juntamente de IL-4 e IL-13, está intensamente envolvida na indução e na manutenção de processos alérgicos. As funções de IL-13 na vigilância imunológica e na resposta imunológica tipo TH2 se sobrepõem com IL-4, mas IL-13 também tem um impacto sobre a eosinofilia tissular, além de remodelamento do tecido e desenvolvimento de fibrose(²⁴). Tanto o gene IL-4 como o IL-13 alojam polimorfismos com relevância funcional. A atividade biológica dessas duas citocinas ocorre por meio de ligação em células-alvo ao seu receptor específico. IL-13, que compartilha várias funções biológicas com IL-4, opera por meio do receptor IL-13, um heterodímero formado pelo compartilhamento das cadeias IL-4Rα e IL-13Rα.

Outros genes de citocinas e quimiocinas

Uma grande variedade de citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, e outras moléculas é produzida no início ou durante a expansão de respostas imunes inatas e adquiridas. O tipo de desencadeamento, o local do tecido e a combinação da contribuição de diferentes moléculas modelam a resposta imune nascente, definindo o tipo predominante de célula e o portifólio de moléculas efetoras produzidas, conforme Amsen et al. (23) e Pulendran et al.(²⁵). A cascata de eventos pró-inflamatórios é bem conhecida, e duas das moléculas efetoras clássicas envolvidas são IL-12 e interferon gama (IFN-γ). Ademais, proteína quimiotática de monócitos-1 (MCP-1, do inglês monocyte chemoattractant protein 1) e receptor de quimiocina 5 (CCR5, do inglês chemokine C-C motif receptor 5) são, respectivamente, quimiocina e receptor de quimiocina que desempenham importantes papéis em eventos pró-inflamatórios(⁸). CTLA-4 (do inglês cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) é um ligante essencial que governa a atividade de linfócitos T. Assim, os polimorfismos funcionais que modificam níveis ou a eficiência de quaisquer dessas moléculas poderão ter um impacto sobre o desfecho da resposta imune em função do desvio do equilíbrio de respostas inflamatórias e regulatórias. Os polimorfismos apresentados aqui foram amplamente estudados, e demonstraram desempenhar um papel em várias doenças infecciosas e autoimunes.

OBJETIVO

Apresentar a frequência de SNPs de alguns genes de resposta imune em uma amostra populacional da cidade de São Paulo.

MÉTODOS

Sujeitos

Os dados neste estudo foram colhidos de uma amostra de indivíduos sadios, irmãos idênticos não-HLA de receptores de transplante de medula óssea atendidos no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, obtidos entre 1998 e 2005. Esses indivíduos foram selecionados, de forma clínica e laboratorial, como possíveis doadores, e considerados aptos para a doação, mas foram dispensados em função de incompatibilidade MHC com os respectivos receptores. As amostras foram obtidas após o consentimento informado e a permissão do Comitê de Ética do hospital. Como o número da amostra variou para cada SNP analisado, os números (n) são mostrados nas tabelas 1–5.

Tabela 1
Genótipos e frequências de alelos de polimorfismos de genes imunes inatos em uma amostra de indivíduos sadios

SNP	Alelos	Genotipos (%)	FA
TLR4 +896, n = 255	AA	223 (87.4)	0.94
	AG	31 (12.2)
	GG	1 (0.4)	0.06
TLR5 +1 174, n = 279	CC	261 (93.5)	0.97
	CT	17 (6.1)
	TT	1 (0.4)	0.03
MBL-550, n = 281	CC	117 (41 .5)	0.65
	CG	134 (48)
	GG	30 (10.5)	0.35
MBL-221, n = 281	CC	10 (4,0)	0.16
	CG	69 (24)
	GG	202 (72)	0.84
MBL +4, n = 281	CC	158 (56)	0.74
	CT	101 (36)
	TT	22 (8,0)	0.26
MBL 52*, n = 281	CC	259 (92.1)	0.96
	CT	21 (7,5)
	TT	1 (0.4)	0.04
MBL 54*, n = 281	AA	6 (2)	0.14
	GA	64 (23)
	GG	210 (75)	0.86
MBL 57*, n = 281	GG	262 (93)	0.96
	GA	19 (7)
	AA	0	0.04
MBL A/O**, n = 281	A/A	176 (63)	0.80
	A/C	91 (32)
	O/C	14 (5)	0.20
MASP2 120. n= 281	GG	269 (96)	0.98
	GA	12(4)
	AA	0	0.02

• SNP: polimorfismo de nucleotídeo único; FA: frequência de alelos;
• ^*
  códon;
• ^**
  C+D+E, que corresponde a variantes nas posições 52,54,57.

Tabela 2
Genótipos e frequências de alelos de IL-10 e polimorf smos do gene receptor de IL-10 em uma amostra de indivíduos sadios

SNP	Alelos	Genotipos (%)	FA
IL-10 −592, n = 278	AA	38 (14)	0.35
	AC	119 (43)
	CC	121 (43)	0.65
IL-10 −819 , n = 278	CC	120 (43)	0,65
	TC	120 (43)
	TT	38 (14)	0.35
IL-10 −1082, n = 278	AA	137 (49.3)	0.7
	AC	115 (41.4)
	CC	26 (9.3)	0.3
IL10 −2763, n = 278	AA	29 (10)	0.25
	AC	83 (30)
	CC	166 (60)	0.75
IL-10 −2849 , n = 278	AA	15 (5.4)	0.18
	AG	68 (24.5)
	GG	195 (70.1)	0.82
IL-10 −3575 , n = 278	TT	163 (59)	0.76
	TA	98 (35)
	AA	17 (6)	0.24
IL10R 138*, n = 265	AA	211 (80)	0,9
	AG	49 (18)
	GG	5 (2)	0.1
IL10R 330* , n = 259	GG	151 (58.3)	0.76
	AG	94 (36.3)
	AA	14 (5.4)	0.24

• SNP: polimorf smo de nucleotídeo único; FA: frequência de alelos:
• ^*
  códon.

Tabela 3
Genótipos e frequências de alelos (FA) de polimorfismos do gene receptor de MHC III em uma amostra de indivíduos sadios

SNP	Alelos	Genotipos (%)	FA
TNFA −238, n = 281	AA	1 (0.4)	0.04
	AG	18 (6.4)
	GG	262 (93.2)	0.96
TNFA −308, n = 281	AA	4(1)	0.1
	AG	45 (16)
	GG	232 (83)	0.9
LTA +80, n = 273	CC	116 (42)	0.6
	AC	114 (42)
	AA	43 (16)	0.4
LTA +252, n = 279	AA	132 (47.3)	0.7
	AG	118 (42.3)
	GG	29 (10.4)	0.3
NFKBIL1 −63, n = 276	AA	38 (14)	0.35
	AT	118 (43)
	TT	120 (43)	0.65
BAT1 −22, n = 265	GG	127 (48)	0.7
	CG	1 10 (41 .5)
	CC	28 (10.5)	0.3
BAT1 −348, n = 266	CC	192 (72)	0.85
	CT	68 (26)
	TT	6(2)	0.15
LST1 +290, n = 141	AA	7(5)	0.09
	AG	10 (7)
	GG	124 (88)	0.91

• SNP: polimorfismo de nucleotídeo único; FA: frequência de alelos.

Tabela 4
Genótipos e frequências de alelos de IL4, IL5, IL13 e polimorfismos do gene receptor em uma amostra de indivíduos sadios

SNP	Alelos	Genotipos (%)	FA
IL5 - 746, n = 128	CC	20 (16)	0.43
	CT	71 (55)
	TT	37 (29)	0.57
IL4 −589, n = 180	TT	21 (11)	0.31
	CT	68 (38)
	CC	91 (51)	0.6S
IL4 +33, n = 220	TT	30 (14)	0.31
	CT	77 (35)
	CC	113 (51)	0.6S
L4 +3017, n = 86	GG	15 (17.4)	0.51
	GT	58 (67.4)
	TT	13 (15.2)	0.4S
IL13 +2044, n = 160	AA	6 (4.0)	0.2
	AG	60 (37.0)
	GG	94 (59.0)	0.8
IL4R +223, n = 212	A/A	49 (19)	0.5C
	A/G	129 (61)
	G/G	43 (20)	0.5C
IL13RA1 +1398, n = 85	AA	57 (67)	0.76
	AG	16(19)
	GG	12 (14)	0.24

• SNP: polimorfismo de nucleotídeo único; FA: frequência de alelos.

Tabela 5
Genótipos e frequências de alelos de vários polimorfismos do gene de resposta imune em uma amostra de indivíduos sadios

SNP	Alelos	Genotipos (%)	FA
IL6 −174, n = 264	GG	168 (64)	0.8
	CG	83 (31)
	CC	13 (5)	0,2
INFG +874, n = 273	AA	95 (35)	0.6
	AT	129 (47)
	TT	49 (18)	0.4
IL12B + 1188, n = 266	AA	134 (50)	0.7
	AC	109 (41)
	CC	23 (9)	0.3
CCR5Δ32, n = 278	WT*/VVT	252 (90)	0,95
	DEL**/VVT	24 (9)
	DEL/DEL	2 (1)	0.05
MCP1 - 2518, n = 256	AA	122 (48)	0.7
	AG	103 (40)
	GG	31 (12)	0.3
CTLA4-318. n - 217	CC	191 (88)	0.93
	CT	23 (11)
	TT	3 (1)	0.07
CTLA4 +49, n = 228	AA	94 (41)	0,66
	AG	113 (50)
	GG	21 (9)	0.34
CTLA4 CT60, n = 181	AA	42 (23)	0.47
	AG	87 (48)
	GG	52 (29)	0,53

• SNP: polimorfismo de nucleotídeo único; FA: frequência de alelos;
• ^*
  tipo selvagem;
• ^**
  deleção.

Extração e genotipagem de DNA

Foram colhidas amostras de sangue; o DNA foi extraído por brometo de dodeciltrimetilamonio/brometo de cetiltrimetilamonio (DTAB/CTAB)(²⁶) ou, como alternativa, por métodos salting-out(²⁷).

Genotipagem com RFLP-PCR

Não houve desvio das proporções esperadas de Hardy-Weinberg em quaisquer dos genes analisados. Para a genotipagem de todos os SNPs, foi usado DNA genômico 100 ng. Os polimorfismos foram tipados por PCR-RFLP, conforme descrição em outra publicação (informações adicionais sobre os SNPs apresentados estão disponíveis no ^{Anexo 2} e mediante solicitação). Em suma, os PCRs foram realizados em um volume final de 25 µL contendo 100 ng de DNA genômico, 40 uM de dNTP e 0,2 U de Taq polimerase, 1,5 mM de MgCl₂, 0,25 pM de cada primer. Em alguns casos, os protocolos empregaram 2,0 mM de MgCl₂ e 0,5 pM de cada primer. Em geral, o PCR foi conduzido com um passo inicial de desnaturação por 5 minutos a 95ºC, seguido por 35 ciclos a 95ºC por 20 segundos, anelamento por 30 segundos, seguido de uma extensão a 72ºC por 20 segundos, e um passo final de extensão de 5a 7 minutos a 72ºC. Uma alíquota de 10 uL do produto PCR foi digerido por 3 horas com a enzima de restrição específica (New England Biolabs) em um volume total de 20 uL na temperatura especificada pelo fabricante. Os produtos digeridos foram separados por eletroforese em gel de agarose a 2 a 4%, tingidos com brometo de etídio e visualizados sob luz ultravioleta (UV).

RESULTADOS

A distribuição de alelos e genótipos de 41 diferentes polimorfismos de genes, a maioria citocinas, mas também incluindo outros genes de resposta imune, é mostrada nas tabelas 1 a 5.

DISCUSSÃO

Neste trabalho apresentamos uma série de frequências de alelos e genótipos de genes de respostas imunes conhecidos e novos. Embora esses genes demonstrem uma modesta contribuição ao fenótipo geral, é importante detalhar os efeitos de cada gene no desenvolvimento e evolução de uma determinada doença. A soma de múltiplos fatores genéticos e ambientais leva a diferentes apresentações clínicas e respostas terapêuticas em cada paciente(²⁸). Assim, o estudo de números significantes de pacientes portadores da mesma doença, além da comparação entre doenças similares (por exemplo, doenças autoimunes), abre caminho para identificação de relevantes mecanismos em sua fisiopatologia. Polimorfismos genéticos, como aqueles mostrados neste trabalho, foram associados a uma variedade de doenças autoimunes, inflamatórias e infecciosas, que abrangem desde doença celíaca e artrite reumatoide, a infarto agudo do miocárdio, doença de Chagas e hepatite viral.

A maioria de sítios polimórficos no genoma é mundialmente comum em populações, e as variantes exibem moderada frequência(²⁹), sugerindo que boa parte deve ter passado por uma seleção de equilíbrio, isto é, que tem sido preservada porque, além de conceder suscetibilidade a certas doenças, também desempenham um papel benéfico segundo o histórico ambiental das populações. Dois importantes pontos devem ser destacados a respeito de alguns dos polimorfismos que estudamos, os quais mostraram frequências muito baixas (por exemplo, TNF-a238 e TLR5 +1174). Baixas frequências causam um impacto sobre o poder estatístico, e um número de amostras bem maior precisa ser examinado para alcançar significância em estudos de associação. Quando o impacto da variante sobre um fenótipo é baixo, a questão se complica ainda mais. Em estudos com genes candidatos, em que casos e controles tipicamente somam apenas algumas centenas, esta é uma questão importante e deve ser levada em consideração na escolha de genes-alvo. Por outro lado, genes com efeitos maiores podem ser analisados com confiança.

Algumas considerações poderão ajudar a contornar ou amenizar o impacto das questões apontadas anteriormente: em primeiro lugar, é necessário haver uma hipótese robusta com base em evidência clínica. Deve ser destacado que, enquanto a triagem de estudos de associação do genoma não emprega hipóteses a priori, estudos caso-controle serão beneficiados da correlação com dados obtidos por meio de um cuidadoso seguimento clínico e dados laboratoriais detalhados. As escolhas de marcadores opcionais no mesmo gene ou região cromossômica, a análise em amostras subsequentes independentes, o uso de duas a quatro vezes mais amostras de controles do que de pacientes, e o cuidado de evitar estruturas populacionais ocultas, que podem resultar em falsas diferenças, são pontos adicionais a serem considerados. Embora muitas declarações de associações tenham sido publicadas, poucas são subsequentemente replicadas, e esse é um problema que afeta igualmente estudos GWAS(²,³⁰).

Todavia, como salientado por Eric Lander et al.(²), ainda há um papel para estudos de associação. O principal valor do mapeamento genético não é a previsão de risco, mas o fornecimento de novos insights sobre os mecanismos de doença. O conhecimento das vias da doença pode sugerir estratégias para prevenção, diagnóstico e terapia.

CONCLUSÃO

Finalmente, embora os ancestrais não tenham sido definidos na nossa população de estudo, cremos que os dados apresentados aqui possam ser de grande valor para estudos caso-controle, para definir quais polimorfismos estão presentes com frequências biologicamente relevantes, e para avaliar alvos para intervenção terapêutica em doenças poligênicas com um componente de resposta imune e inflamatória.

AGRADECIMENTOS

Este trabalho teve o suporte financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), bolsas 2001/09850-0 e 2005/00553-3, e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), bolsa 0062/2001-0. ACG e JK são receptores de doações pessoais do CNPq.

Anexo 1 Links úteis

• Projeto Internacional Hapmap (http://snp.cshl.org/)

• Projeto 1000 Genomas (http://www.1000genomes.org/page.php)

• Banco de dados de variantes genômicas, um banco de dados sobre variações de

• número de cópias em humanos (http://projects.tcag.ca/variation/)

• Entrez SNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)

• Consórcio de casos-controle da Wellcome Trust (http://www.wtccc.org.uk/)

Anexo 2 Identificação de polimorfismo de nucleotídeo único e referências

Genes rs SNP Referências IL-6 −174 rs1800795 G/C Sainz J, Pérez E, Gómez-Lopera S, López-Fernández E, Moratalla L, Oyonarte S,Jurado M. Genetic variants of IL6 gene promoter influence on C-reactive protein levels but are not associated with susceptibility to invasive pulmonary aspergillosis in haematological patients Cytokine. 2008;(3):268-78. IL-10R 138 rs 4252272 A/G Gasche C, Grundtner P, Zwirn P, Reinisch W, Shaw SH, Zdanov A, et al. Novel variants of the IL-10 receptor 1 affect inhibition of monocyte TNF-alpha production. J Immunol. 2003;170(11):5578-82 IL-10R 330 rs2229113 G/A Gasche C, Grundtner P, Zwirn P, Reinisch W, Shaw SH, Zdanov A, et al. Novel variants of the IL-10 receptor 1 affect inhibition of monocyte TNF-alpha production. J Immunol. 2003;170(11):5578-82 IL-10 −592 rs1800872 C/A Lech-Maranda E, Baseggio L, Bienvenu J, Charlot C, Berger F, Rigal D, et al. Interleukin-10 gene promoter polymorphisms influence the clinical outcome of diffuse large B-cell lymphoma. 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Immunogenetics. 2003;54(12):896-9. IL-10 −3575 rs1800890 T/A Moraes MO, Santos AR, Schonkeren JJ, Vanderborght PR, Ottenhoff TH, Moraes ME, et al. Interleukin-10 promoter haplotypes are differently distributed in the Brazilian versus the Dutch population. Immunogenetics. 2003;54(12):896-9. INFG +874 rs2430561 A/T Pravica V, Perrey C, Stevens A, Lee JH, Hutchinson IV. A single nucleotide polymorphism in the first intron of the human IFNgamma gene: absolute correlation with a polymorphic CA microsatellite marker of high IFN-gamma production. Hum Immunol. 2000;61(9):863-6. IL-12B 1188 rs3212227 A/C van Veen et al., Genes and Immunity. 2000;1:219-24 CCR5[delta]32 rs333 del Shahbazi M, Ebadi H, Fathi D, Roshandel D, Mahamadhoseeni M, Rashidbaghan A, et al. CCR5-delta 32 allele is associated with the risk of developing multiple sclerosis in the Iranian population. Cell Mol Neurobiol. 2009;29(8):1205-9. 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Association of CCR5, TLR2, TLR4 and MBL genetic variations with genital tract infections and tubal factor infertility. J Reprod Immunol. 2010; Jul 1. [Epub ahead of print] MBL +4 P/Q rs7095891 C/T Laisk T, Peters M, Saare M, Haller-Kikkatalo K, Karro H, Salumets A. Association of CCR5, TLR2, TLR4 and MBL genetic variations with genital tract infections and tubal factor infertility. J Reprod Immunol. 2010; Jul 1. [Epub ahead of print] MASP2 120D/G rs72550870 A/G Ramasawmy R, Spina GS, Fae KC, Pereira AC, Nisihara R, Messias Reason IJ, et al. Association of mannose-binding lectin gene polymorphism but not of mannose-binding serine protease 2 with chronic severe aortic regurgitation of rheumatic etiology. Clin Vaccine Immunol. 2008;15(6):932-6. NOD2 3020insC 1007fs rs2066847 insC Ghandil P, Chelala C, Dubois-Laforgue D, Senée V, Caillat-Zucman S, Kockum I,et al. Crohn's disease associated CARD15 (NOD2) variants are not involved in the susceptibility to type 1 diabetes. 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MBL54 Gly/Asp	rs1800450	G/A	Ramasawmy R, Spina GS, Fae KC, Pereira AC, Nisihara R, Messias Reason IJ, et al. Association of mannose-binding lectin gene polymorphism but not of mannose-binding serine protease 2 with chronic severe aortic regurgitation of rheumatic etiology. Clin Vaccine Immunol. 2008;15(6):932-6.
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• SNP: polimorfismo de nucleotídeo único.

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• Estudo realizado no Instituto do Coração da Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo – USP São Paulo (SP), Brasil; Instituto Israelita de Ensino e Pesquisa Albert Einstein – IIEPAE, São Paulo (SP), Brasil; Instituto de Investigação em Imunologia dos Institutos Nacionais de Ciência e Tecnologia – INCT, São Paulo (SP), Brasil

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Jul-Sep 2011

Histórico

• Recebido
  26 Ago 2010
• Aceito
  22 Jun 2011