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Einstein (São Paulo)

Print version ISSN 1679-4508

Einstein (São Paulo) vol.10 no.2 São Paulo Apr./June 2012

http://dx.doi.org/10.1590/S1679-45082012000200012 

ARTIGO ORIGINAL

 

Estudo de internalização e viabilidade de nanopartículas multimodal para marcação de células-tronco mesenquimais de cordão umbilical humano

 

 

Liza Aya Mabuchi MiyakiI; Tatiana Tais SibovII; Lorena Favaro PavonII; Javier Bustamante MamaniII; Lionel Fernel GamarraII

IInstituto do Cérebro – InCe, Hospital Israelita Albert Einstein – HIAE, São Paulo (SP), Brasil; Faculdade de Enfermagem do Hospital Israelita Albert Einstein – HIAE, São Paulo (SP), Brasil
IIInstituto do Cérebro – InCe, Hospital Israelita Albert Einstein – HIAE, São Paulo (SP), Brasil

Autor correspondente

 

 


RESUMO

OBJETIVO: Analisar a estabilidade das nanopartículas magnéticas multimodais-Rhodamine B em meios de cultura para marcação celular e, consequentemente, estabelecer o estudo de detecção intracelular de nanopartículas magnéticas multimodais-Rhodamine B nas células marcadas, avaliando a viabilidade celular nas concentrações de 10µg Fe/mL e 100µg Fe/mL.
MÉTODOS: Foram realizados: análise da estabilidade das nanopartículas magnéticas multimodais-Rhodamine B em meios de cultura diferentes; marcação das células-tronco mesenquimais com nanopartículas magnéticas multimodais-Rhodamine B; detecção intracelular das nanopartículas magnéticas multimodais-Rhodamine B nas células-tronco mesenquimais e avaliação da viabilidade das células marcadas por meio da cinética de proliferação.
RESULTADOS: A análise de estabilidade determinou que as nanopartículas magnéticas multimodais-Rhodamine B presentes nos meios de cultura Dulbecco's Modified Eagle's-Low Glucose e RPMI Medium 1640 apresentaram boa estabilidade. A marcação das células-tronco mesenquimais com nanopartículas magnéticas multimodais-Rhodamine B descreveu localização intracelular das nanopartículas, as quais se mostraram como grânulos azulados colocalizados nos grumos fluorescentes, caracterizando, assim, as propriedades magnéticas e fluorescentes das nanopartículas magnéticas multimodais-Rhodamine B.
CONCLUSÃO: A estabilidade das nanopartículas magnéticas multimodais-Rhodamine B, presentes nos meios de cultura Dulbecco's Modified Eagle's-Low Glucose e RPMI Medium 1640, garantiu a eficiente marcação intracelular das células-tronco mesenquimais. Esse tipo de marcação não afetou viabilidade das células-tronco mesenquimais marcadas, já que as mesmas continuaram proliferando ao longo de 5 dias.

Descritores: Células-tronco mesenquimais; Nanopartículas; Rodaminas; Cordão umbilical


 

 

INTRODUÇÃO

As células-tronco mesenquimais (CTM) são células multipotentes que apresentam capacidade de originar outros tipos celulares de forma limitada, como, por exemplo, adipócitos, osteoblastos e condrócitos(1-4). Além disso, a importância da utilização dessas células em terapia celular se deve ao fato das CTM apresentarem outras características importantes como, por exemplo, facilidade no isolamento, expansão, manipulação e propriedades imunossupressoras(4-8).

As CTM, quando comparadas a outros tipos de células-tronco(9), apresentam algumas vantagens clínicas como, por exemplo, serem prontamente adquiridas de pacientes, facilmente expandidas ex vivo, bem como autotransfundidas sem risco de rejeição imunológica e livre de preocupações éticas(10,11).

A medula óssea (MO) é a principal e mais estudada fonte de obtenção de CTM utilizada em aplicações clínicas e experimentais. No entanto, estudos mostram que as CTM de parede de cordão umbilical humano (PCUh) apresentam características morfológicas, imunofenotípicas e capacidade de diferenciação em células de linhagens mesodérmicas, similares as CTM de MO(2,4,12-14).

Dessa forma, as CTM representam uma importante e promissora ferramenta terapêutica no tratamento de doenças neuro-cardiovasculares, neurodegenerativas, hematológicas e imunodeficiências, para as quais ainda não há tratamento específico ou efetivo disponível(15-18). Entretanto, o acompanhamento do comportamento dessas células in vivo ainda é um dos obstáculos para sua utilização em terapia celular. A possibilidade de estabelecer uma marcação eficiente dessas células com nanopartículas de óxido de ferro (NOF), sem a perda de viabilidade, poderia disponibilizar métodos não invasivos para o acompanhamento dessas células in vivo. Assim, a inovação nanobiotecnológica promove o estudo de novas ferramentas para o avanço biomédico.

Materiais nanoestruturados são sistemas constituídos de partículas de dimensões nanométricas. O interesse nanobiotecnológico por esses materiais reside no fato de apresentarem propriedades biofísicas especiais, quando comparadas aos mesmos materiais constituídos por partículas grosseiras(19). Por meio do controle das condições de síntese, podem-se obter suspensões de nanopartículas monodispersas utilizadas na preparação de suspensões coloidais biocompatíveis. Nesse contexto, as NOF têm despontado como um recurso nanobiotecnológico inovador no processo de marcação de células e seu posterior estudo por imagem molecular(20,21).

Um dos processos utilizados atualmente para acompanhar a migração ou homing das CTM é a marcação dessas células com NOF(20). Esse processo permite acompanhar a distribuição e o destino das CTM, bem como maximizar seu benefício terapêutico(20-22).

Alguns estudos(23,24) demonstraram a utilização de nanopartículas magnéticas multimodais (NPMM), ou seja, nanopartículas que apresentam propriedades magnéticas e fluorescentes (Rhodamine B – RhB, BioPAL, Worcester, MA, USA) podendo ser demonstradas em imagem por ressonância magnética (IRM) e microscopia de fluorescência.

As NPMM possuem característica fluorescente devido ao fato de serem conjugadas com elementos fluorescentes como, por exemplo, a NOF conjugada com RhB (dois fluoróforos por partícula), na qual o comprimento de onda de excitação da RhB é 555nm e o comprimento de onda de emissão é 565 a 620nm. Essa NPMM (RhB) tem um núcleo magnético de 8nm, com um tamanho hidrodinâmico de 35nm, potencial zeta de -31mV e concentração de 2mg de Fe/mL (BioPAL, Worcester, MA, USA).

Assim, neste estudo, estabelecemos a detecção intracelular de NPMM (RhB), avaliando a viabilidade celular dessa marcação nas CTM de PCUh em diferentes concentrações das nanopartículas (10µg Fe/mL e 100µg Fe/mL) e sua estabilidade em meios de cultura diferentes.

 

OBJETIVO

O presente trabalho visa analisar a estabilidade das NPMM (RhB) em meios de cultura para marcação celular e, consequentemente, estabelecer o estudo de detecção intracelular de NPMM (RhB) nas células marcadas, avaliando a viabilidade celular nas concentrações de 10µg Fe/mL e 100µg Fe/mL.

 

MÉTODOS

Coleta e processamento das amostras de cordão umbilical

As amostras de PCUh foram coletadas após consentimento informado da mãe (doadora) de acordo com o Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do Instituto Israelita de Ensino e Pesquisa Albert Einstein (IIEPAE) – SGPP: 683-09; CEP: 1059. Essas amostras foram coletadas por meio da secção do cordão umbilical no momento do parto e conservadas em Phosphate Buffered Saline 1x (PBS, Sigma-Aldrich) com 100mM de anticoagulante EDTA e, logo depois, processadas em até 6 horas após a coleta. Após duas lavagens com PBS 1x (Sigma-Aldrich) da veia do cordão umbilical, as CTM foram retiradas da amostra por digestão enzimática utilizando colagenase tipo I (Sigma-Aldrich) por 30 minutos a 37ºC em 5% de CO2. Em seguida, a enzima foi inativada com Soro Fetal Bovino (Gibco®, Invitrogen Corporation), e as células isoladas foram mantidas em meio Dulbecco's Modified Eagle's-low glucose (DMEM-LG, Gibco®, Invitrogen Corporation).

Cultura das CTM de PCUh

As CTM isoladas foram plaqueadas em placas de 25cm2 em uma densidade celular de 107 células/cm2 contendo meio DMEM-LG (Gibco®, Invitrogen Corporation) suplementado com 200mM de L-Glutamina, Antibiótico/Antimicótico 10.000U/mL de penicilina sódica, 10.000µg/mL de sulfato de estreptomicina, 25µg/mL de anfotericina B (Gibco®, Invitrogen Corporation) e 10% Soro Fetal Bovino (Gibco®, Invitrogen Corporation). As culturas de CTM foram mantidas em incubadora (Thermo Fisher Scientific Inc 3110, Waltham, MA) a 37ºC em 5% de CO2 e as células não aderentes foram removidas da placa de cultura após 24 horas. Os experimentos foram realizados na quarta passagem celular, com aproximadamente 80% de confluência.

Caracterização imunofenotípica das CTM de PCUh

As CTM isoladas foram caracterizadas por imunofenotipagem realizada por citometria de fluxo. A técnica de marcação utilizada estava de acordo com as instruções técnicas do fabricante. As células foram marcadas com os anticorpos monoclonais e incubadas no escuro por 30 minutos a temperatura ambiente; após a incubação, as células foram lavadas e fixadas com paraformoldeído 1%. Os anticorpos monoclonais utilizados foram: CD14 FITC clone:M5E2 (BD Pharmingen, San Diego, CA); CD29 PE clone:MAR4 (BD Pharmingen, San Diego, CA); CD31 PE clone:WM59 (BD Pharmingen, San Diego, CA); CD45 PerCP CY5.5 clone:2D1 (BD Biosciences, San Jose, CA); CD73 PE clone:AD2 (BD Pharmingen, San Diego, CA); CD105 PE clone:43A3 (Biolegend, San Diego, CA); CD90 APC clone:5E10 (BD Pharmingen, San Diego, CA); HLA-A,B e C FITC clone:G46-2.6 (BD Pharmingen, San Diego, CA); CD106 FITC clone:51-10C9 (BD Pharmingen, San Diego, CA); CD133 APC clone:293C3 (Myltenyi Biotec, Germany); e os isotipos controles relacionados. A aquisição dos dados foi realizada no equipamento de citometria de fluxo FACSARIA (BD Biosciences, San Jose, CA) e os resultados analisados com o software FACSDIVA (BD Biosciences) e FLOWJO (Tree Star, Ashland, OR).

Análise da estabilidade das NPMM (RhB) em meios de cultura

A análise da estabilidade de NPMM foi realizada em meios de cultura DMEM-LG (Gibco®, Invitrogen Corporation) e RPMI Medium 1640 (Gibco®, Invitrogen Corporation), com o intuito de avaliar o meio adequado para o estudo da marcação com NPMM (RhB) nas CTM, dado que, na literatura, esses meios de cultura são os mais utilizados no processo de marcação destas células(25-28). O estudo da estabilidade foi realizado mediante a técnica de Dynamic Light Scattering (DLS), com medidas temporais da distribuição do tamanho hidrodinâmico das NPMM (RhB) utilizando um Malvern Zetasizer NanoS (Malvern, UK). A distribuição do tamanho hidrodinâmico ponderada em número foi obtida em um ângulo de 173º em modo manual, com número de médias de 20 e tempo de medida de 5 segundos por média. As medidas foram realizadas em modo de posição fixa. As medidas foram realizadas na temperatura de 37ºC, com tempo de equilíbrio de 60 segundos. Utilizaram-se 2mL de cada meio de cultura em uma concentração de 10 e 100µg Fe/mL e 2mL de água Milli-Q com concentração de 100µg Fe/mL como amostra controle. As medidas do tamanho hidrodinâmico foram realizadas em diferentes tempos em um intervalo de 0 até 20 horas. A análise da distribuição do tamanho foi determinada mediante o ajuste da função de correlação das intensidades da luz espalhada com o algoritmo CONTIN.

Marcação de CTM com as NPMM (RhB)

Aproximadamente 1x105 CTM foram plaqueadas em placas de 24 wells e mantidas overnight em incubadora (Thermo Fisher Scientific Inc 3110, Waltham, MA) a 37ºC em 5% de CO2, em uma suspensão de NPMM (RhB) nas concentrações de 10µg Fe/mL e 100µg Fe/mL em condição de triplicata. Após o período de incubação, a solução NPMM (RhB)-meio de cultura foi retirada por aspiração e as CTM foram lavadas duas vezes com PBS (1x) para remover as NPMM (RhB) extracelulares. As células controle foram processadas só com meio de cultura, mas nas mesmas condições que as células marcadas.

Detecção intracelular das NPMM (RhB)

As CTM marcadas foram lavadas com PBS 1x (Sigma-Aldrich) para a retirada do excesso de partículas e, em seguida, fixadas com paraformaldeído 4%. Em seguida, foi realizado o ensaio citoquímico de azul da Prússia 5%, solução de 5% ferrocianeto de potássio (Sigma-Aldrich)/solução de 5% de HCl 37% (Merck, Germany) e fucsina básica (Sigma-Aldrich), para verificar a internalização das partículas nas CTM. A análise foi realizada no microscópio de fluorescência (IX51 Olympus), primeiramente por meio de microscopia comum e, em paralelo, utilizando o filtro Rhodamine (530nm e 550nm).

Cinética de proliferação

Aproximadamente 5x104 CTM foram incubadas com NPMM (RhB), nas concentrações de 10µg Fe/mL e 100µg Fe/mL e em triplicata, em seguida lavadas duas vezes com PBS 1x (Sigma-Aldrich) e mantidas em incubadora (Thermo Fisher Scientific Inc 3110, Waltham, MA) a 37ºC em 5% de CO2. Ao longo de 5 dias, a triplicata de cada uma das concentrações foi lavada com PBS (1x) (Sigma-Aldrich) e as CTM marcadas foram retiradas por digestão enzimática por meio da utilização de Trypsin 0,25% EDTA (Gibco®, Invitrogen Corporation) por 3 minutos a 37ºC em 5% de CO2. A inativação enzimática foi realizada por meio do meio DMEM-LG 10%, Soro Fetal Bovino (Gibco®, Invitrogen Corporation). As células ressuspendidas foram quantificadas por meio da câmara de Newbauer. O número de células de cada ponto da curva foi representado pela média do número de células das triplicatas.

 

RESULTADOS

Caracterização morfológica e imunofenotípica das CTM de PCUh

As CTM de PCUh apresentaram morfologia fibroblástica e atingiram a confluência entre 80 e 90% em 7 dias em cultura (Figura 1). O perfil imunofenotípico das CTM de PCUh isoladas já se encontra publicado em outros artigos do grupo(2,4).

 

 

Estabilidade NPMM (RhB) nos meios de cultura DMEM-LG e RPMI

As variações no tamanho hidrodinâmico ao longo do tempo (resultado da aglomeração de NPMM dispersas em meio líquido) determinam a instabilidade da NPMM e consequentemente diminuem a eficiência na captação de NPMM (RhB) pelas CTM. Assim, foram realizadas medidas de DLS para determinar a variabilidade do tamanho hidrodinâmico das NPMM (RhB) dispersas em meio de cultura DMEM e RPMI nas concentrações de 10 e 100µg/mL e da amostra controle nos diferentes tempos, como é mostrado na figura 2.

 


 

Detecção intracelular das NPMM (RhB) em CTM

A avaliação da distribuição intracelular das nanopartículas com propriedades magnéticas e fluorescentes, utilizadas para a marcação das CTM, foi realizada por meio dos ensaios citoquímicos de azul de Prússia e fucsina básica, por meio de microscopia óptica comum e de fluorescência.

Nos ensaios citoquímicos, a internalização das NPMM (RhB) foi observada como granulações azuladas de localização intracelular (Figuras 3B a 3D, 3H a 3J). Esse processo não foi observado no controle negativo, ou seja, CTM não marcadas (Figuras 3A e 3G).

 





 

A detecção intracelular das NPMM (RhB) também pôde ser observada nas marcações utilizando o recurso da microscopia de fluorescência (Figuras 3E, 3F, 3L a 3N), na qual as partículas apresentaram-se como pequenos grumos fluorescentes de colocalização com os grânulos azuis revelados pelos testes citoquímicos (Figuras 3H e 3L).

Viabilidade das CTM marcadas

A viabilidade das CTM marcadas com NPMM (RhB) foi avaliada por meio de ensaio de cinética de proliferação celular (Figura 4). A capacidade proliferativa das CTM marcadas revelou que não houve alteração significativa entre os dias que compreenderam o plaqueamento (5,0x104 células/well), marcação com NPMM (RhB) (4,93x104 células/well) e o primeiro dia (5,0x104 células/well), estabelecido na curva nas concentrações C10 (4,92x104 células/well), C100 (4,80x104 células/well) e controle (5,32x104 células/well).

 

 

DISCUSSÃO

As CTM também, definidas como células progenitoras multipotentes, apresentam capacidade de se diferenciarem em algumas linhagens de origem mesodérmica, tais como células adipocíticas, osteoblásticas e condrocíticas(29-31). Além disso, alguns dados da literatura sugerem que as CTM podem originar outros tipos celulares como, por exemplo, cardiomiócitos(32-34), células endoteliais(35) e, até mesmo, células de origem não mesodérmica, como hepatócitos(36), células neurais(37) e células epiteliais(38,39). Com isso, o potencial uso das CTM de PCUh em terapia celular tem gerado um importante interesse em uma ampla variedade de disciplinas biomédicas, incluindo campos emergentes aplicáveis à nanobiotecnologia, estreitando novos recursos para o estudo de imagem molecular in vitro e in vivo.

Dessa forma, este estudo avaliou a estabilidade das NPMM (RhB) em dois diferentes meios de cultura para a marcação das CTM, já que, na literatura, pode ser encontrada a utilização de diversos meios de cultura. Assim, neste estudo, demonstramos o melhor meio para ser utilizado. Para tal, foi realizado um estudo de detecção intracelular das CTM marcadas com NPMM (RhB) e a viabilidade dessa marcação por meio de uma cinética de proliferação celular.

Os resultados obtidos no estudo de estabilidade das NPMM (RhB) nos meios de cultura DMEM-LG e RPMI revelaram que as nanopartículas são estáveis nos dois meios de cultura, sendo que o meio DMEM-LG foi o escolhido para o presente estudo, por ser o mais utilizado segundo referências da literatura como o meio mais utilizado na cultura de CTM(25,26,40,41).

A estabilidade das NPMM (RhB) em meio líquido foi analisada mediante gráficos de diâmetro hidrodinâmico das partículas em função do tempo mostrados na figura 2. Na figura 2A, apresentamos a estabilidade de NPMM (RhB) suspensas em água, em uma concentração C100=100µg Fe/mL, denominada amostra controle. Nesta figura, observa-se que, considerando a margem de incerteza, o diâmetro hidrodinâmico permanece constante no tempo, excluindo a formação de agregados de NPMM (RhB). A medida foi realizada com o intuito de determinar experimentalmente o diâmetro hidrodinâmico e a dispersibilidade das NPMM (RhB). A estabilidade das NPMM (RhB) em água depende da dimensão da partícula para evitar a precipitação devido às forças gravitacionais e da química de troca na superfície da partícula, que resulta no aumento das repulsões estéricas e de Coulomb. A estabilidade decorre de um equilíbrio muito delicado das interações atrativas e repulsivas entre as NPMM (RhB). A interação dipolar magnética e a de Van der Waals são atrativas, mas as interações repulsivas mais importantes são a estérica e a eletrostática. O equilíbrio entre interações de naturezas opostas e presentes em uma suspensão coloidal de NPMM (RhB) é modulado pelo movimento browniano associado às nanopartículas dispersas na água(42).

As figuras 2B e 2C mostraram o comportamento do diâmetro hidrodinâmico ao longo do tempo das NPMM dispersas em meios de cultura DMEM-LG e RPMI nas concentrações de C10=10 e C100=100µg Fe/mL, respectivamente. Analisando o diâmetro hidrodinâmico, apresentando-se como um valor constante no tempo levando em conta as incertezas das medidas, podemos afirmar que NPMM (RhB) são estáveis nas concentrações estudadas e que não houve influência do meio de cultura utilizado na estabilidade nem na formação de agregados das NPMM (RhB). A característica mais importante para marcação intracelular com NPMM (RhB) dispersas em meio de cultura é sua estabilidade, ou seja, a propriedade dessas nanopartículas de permanecerem em suspensão na forma de entidades isoladas (monodomínios), evitando a aglomeração das nanopartículas e subsequente precipitação. Nesse caso, podemos inferir que, devido à dispersão de NPMM (RhB) em meio de cultura, existe um leve desequilíbrio das forças que interagem entre essas nanopartículas, tais como as forças atrativas e repulsivas de Van der Waals, forças eletrostáticas e forças que resultam de polímeros adsorvidos(43) que têm pouca influência na estabilidade de NPMM (RhB) em meio de cultura, o que garante uma eficiente marcação intracelular. Portanto, NPMM (RhB) são ideais para uma efetiva marcação intracelular nos meios de cultura utilizados, já que a ausência de aglomerados de NPMM (RhB) indica uma boa estabilidade para incubação por períodos de tempo superiores a 20 horas.

Dessa forma, utilizando meios de cultura que conferem estabilidade das NPMM (RhB), a marcação das CTM com essas nanopartículas foi detectada por ensaios citoquímicos (azul de Prússia e fucsina básica) e microscopia de fluorescência, que descreveram localização intracelular das nanopartículas distribuídas pelo citoplasma celular, principalmente ao redor do núcleo como grânulos azulados colocalizados aos grumos fluorescentes, caracterizando, assim, as propriedades magnéticas e fluorescentes das NPMM (RhB). Descreveu-se também que condição de estudo utilizando a concentração C100=100µg Fe/mL revelou uma distribuição de nanopartículas discretamente mais acentuada comparado a C10=10µg Fe/mL.

As CTM marcadas não foram afetadas quanto à viabilidade, já que a curva de proliferação das mesmas demonstrou que as células continuaram proliferando ao longo de 5 dias em cultura, em 2 concentrações diferentes (C10 e C100). Tais resultados corroboram dados obtidos por Addicott et al.(23), quanto à viabilidade técnica do processo de marcação das CTMs in vitro. Porém, esses mesmos autores relataram que, em concentrações acima de 30µg Fe/mL, houve um decréscimo da viabilidade das CTM de até 78,8% para C100, o que não ocorreu em nossos ensaios (Figura 4).

Desse modo, este estudo determinou resultados básicos de fundamental importância para a padronização de um protocolo de marcação eficiente das CTM com as NPMM (RhB), já demonstrando a não citotoxicidade desse tipo de marcação por meio do crescimento da curva de proliferação das CTM marcadas.

 

CONCLUSÃO

Um dos fatores importantes para a internalização das NPMM (RhB) nas células é a estabilidade destas no meio de cultura. Assim, a análise de estabilidade, realizada mediante a técnica de ELD, determinou que as NPMM (RhB) presentes tanto no meio de cultura RPMI quanto no meio DMEM-LG, apresentaram boa estabilidade garantindo, assim, uma adequada marcação intracelular nas CTM.

Uma excelente vantagem de utilização das NPMM (RhB) decorre de sua propriedade multimodal, ou seja, tais nanopartículas possuem caráter magnético e fluorescente. Considerando que tais nanopartículas são NOFs, estudos de imagem molecular in vivo poderiam ser utilizados como ferramenta para análises em RM, no processo de investigação da distribuição e destino de células marcadas. Esse recurso poderia se associar a ensaios ex vivo utilizando testes de microscopia de fluorescência, a fim de validar os achados de RM no estudo da localização das NPMM (RhB), maximizando, com isso, possíveis benefícios terapêuticos vinculados a CTMs.

 

AGRADECIMENTOS

Fontes de auxílio à pesquisa: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), processo 2011/17644-2, Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

 

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Autor correspondente:
Tatiana Tais Sibov
Instituto do Cérebro – InCe, Hospital Israelita Albert Einstein
Avenida Albert Einstein, 627/701, Piso Chinuch, 2º Subsolo – Morumbi
CEP: 05651-901 – São Paulo (SP), Brasil
Tel.: (11) 2151-3727
E-mail: tatianats@einstein.br

Data de submissão: 1/3/2012
Data de aceite: 13/6/2012
Conflitos de interesse: não há.

 

 

Trabalho realizado no Instituto Israelita de Ensino e Pesquisa Albert Einstein, Hospital Israelita Albert Einstein – HIAE, São Paulo (SP), Brasil.