SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.10 issue2Isolation, cultivation and characterization of CD133+ stem cells from human glioblastomaSPEM: a state-of-the-art instrument for high resolution molecular imaging of small animal organs author indexsubject indexarticles search
Home Pagealphabetic serial listing  

Services on Demand

Article

Indicators

Related links

  • Have no similar articlesSimilars in SciELO

Share


Einstein (São Paulo)

Print version ISSN 1679-4508

Einstein (São Paulo) vol.10 no.2 São Paulo Apr./June 2012

http://dx.doi.org/10.1590/S1679-45082012000200014 

ARTIGO ORIGINAL

 

Determinação de um método de extração de coenzima Q10 em plasma humano: otimização do uso de surfactantes e outras variáveis

 

 

Claudia Cristina Ferreiro-BarrosI; Eduardo Kinio SugawaraII; Livia Rentas SanchesII

IInstituto do Cérebro – InCe, Hospital Israelita Albert Einstein – HIAE, São Paulo (SP), Brasil
IILaboratório Clínico/ Química Especial, Hospital Israelita Albert Einstein – HIAE, São Paulo (SP), Brasil

Autor correspondente

 

 


RESUMO

OBJETIVO: Estabelecer uma rotina de extração dos níveis totais de CoQ10 em plasma humano por meio da análise por Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência (UHPLC).
MÉTODOS: foram testados dois protocolos de extração: a) metanol:hexano e b) 1-propanol. Os seguintes parâmetros foram analisados: temperatura de extração (19ºC e 4ºC), tubos de extração (vidro e polipropileno), surfactantes (SDS, Triton X-100, Tween-20) em diferentes concentrações 1%, 3%, 5% e 10%.
RESULTADOS: Os resultados mostraram que o método de extração de CoQ10 em amostra de plasma humano, a 4ºC, utilizando-se os solventes metanol:hexano (85:15, v/v) na presença do surfactante Tween-20 a 3% e tubos de polipropileno apresentou melhor eficiência e reprodutibilidade quando comparado ao método com 1-propanol.
CONCLUSÃO: A adição do surfactante Tween-20 no processo de preparação de amostra promoveu um aumento na recuperação da CoQ10 pelo método de extração metanol:hexano observada pela boa reprodutibilidade das prelicatas, pelo baixo coeficiente de variação e alta sensibilidade uma vez que a CoQ10 foi detectada em amostras de plasma de um indivíduo controle utilizando-se um detector do tipo UV. Além disso, a utilização de um equipamento de UHPLC proporcionou a obtenção de uma análise com tempo total de corrida de 3,5 minutos, o que viabiliza a obtenção rápida de resultados, considerado mandatório para rotinas laboratoriais.

Descritores: Coenzimas; Surfactantes; Cromatografia líquida


 

 

INTRODUÇÃO

Coenzima Q10 (CoQ10), também conhecida como ubiquinona, é uma molécula lipídica essencial para os organismos aeróbicos. Participa da produção de ATP pela fosforilação oxidativa transferindo elétrons dos complexos respiratórios I e II para o complexo III na membrana interna mitocondrial. Além disso, a CoQ10 participa de muitas outras funções vitais dentro da célula: atua como antioxidante de lipoproteínas e membranas celulares; sua participação é necessária na biossíntese de pirimidinas, afetando assim os processos de replicação e reparo de DNA; modula o processo de apoptose por meio da regulação dos poros de transição da membrana e auxilia na manutenção da temperatura corpórea decorrente de sua função em proteínas desacopladoras(1).

A CoQ10 é composta por um anel de benzoquinona associada a uma cadeia poliprenil derivada da via do mevalonato, a mesma via da síntese do colesterol. O tamanho dessa cadeia poliprenil varia entre os organismos, a espécie humana apresenta 10 repetições (CoQ10), enquanto camundongos apresentam 9 (CoQ9) e Saccharomyces cerevisiae 6 (CoQ6).

A síntese endógena da CoQ10 ocorre na mitocôndria(1). É expressa em todos os tecidos, porém, em maior concentração no coração, rins, fígado e músculo, pois são órgãos que necessitam de maior quantidade de energia (ATP) para seu funcionamento, ocorrendo diminuição da sua expressão durante o processo de envelhecimento celular(2).

Clinicamente, pacientes com deficiência de CoQ10 são muito heterogêneos, com alta variação fenotípica principalmente em relação às manifestações neurológicas(3). Entretanto, alguns subtipos de apresentação clínica parecem ser mais comuns: (1) encefalomiopatia, com miopatia mitocondrial e mioglobinúria recorrente(4); (2) envolvimento infantil multissistêmico; (3) síndrome de Leigh; (4) forma miopática(5); (5) forma atáxica, provavelmente a mais comum dentre as cinco formas(6); (6) síndrome nefrótica resistente a esteroides(7). Sua associação com outros fenótipos clínicos como convulsões, fraqueza muscular, retardo mental, oftalmoplegia, neuropatia periférica, sinais piramidais e escoliose é bastante frequente. O hipogonadismo hipergonadotrófico parece ser mais comum em pacientes com início tardio da doença(8).

A deficiência primária da CoQ10 é autossômica recessiva e está inserida no grupo de Doenças Mitocondriais. É causada por um defeito na via biossintética da ubiquinona a qual ainda não está completamente elucidada (6). Dentre as doenças mitocondriais descritas, a deficiência de CoQ10 é a única, até o momento, que apresenta chances de tratamento efetivo por meio da administração de CoQ10 exógena(9).

Grande parte do que se conhece sobre a biossíntese de coenzima Q advém de estudos realizados em Escherichia coli e S. cerevisiae (10). Há pelo menos uma dezena de genes nomeados como COQ1, COQ2, COQ3... COQ10 em S. cerevisiae, necessários para a função respiratória da coenzima Q(10-13).

Na espécie humana, já foram descritos pacientes com mutações nos genes COQ2, COQ4, COQ6, COQ8, COQ9, PDSS1 e PDSS2 (14-20).

A deficiência secundária no metabolismo da CoQ10 tem sido discutida na patofisiologia de miopatia por estatina, toxicidade por antraciclina e doença de Parkinson, porém ainda não se conhece a relativa contribuição da CoQ10 no desencadeamento dessas doenças(21,22).

No entanto, a suplementação com CoQ10 é amplamente recomendada em altas doses (30mg/kg em crianças e no mínimo 600mg diariamente em adultos) para todos os pacientes com doenças mitocondriais, pois é um suplemento que não tem efeitos colaterais e traz muitos benefícios para o metabolismo celular(23,24). Por ser lipofílica, a CoQ10 é transportada na circulação por partículas de lipoproteínas e sua concentração no plasma tem sido correlacionada aos níveis totais de colesterol, principalmente aos de LDL, em pacientes que fazem uso de estatinas(25,26).

Dada essa possibilidade efetiva de tratamento, o interesse em dosar os níveis de CoQ10 em plasma e outros tipos celulares ou tecidos tem sido alvo de vários estudos. O diagnóstico de deficiência de CoQ10 é realizado por meio da análise da atividade enzimática dos complexos mitocondriais I+II e II+III(1) e também da quantificação dos níveis totais da enzima diretamente no músculo ou fibroblastos. Os níveis de CoQ10 dosados no sangue não são utilizados para diagnóstico, pois a CoQ10 está presente em certos alimentos e é absorvida por meio da dieta. Porém, é utilizada para monitoramento terapêutico em pacientes com comprovada deficiência da coenzima.

Há vários métodos para quantificação de CoQ10 em plasma, células e tecidos descritos na literatura científica. O uso de equipamentos de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) em fase reversa acoplados a detectores do tipo eletroquímico ou ultravioleta (UV) é bastante frequente. Atualmente, a maioria dos métodos envolve preparação de amostra utilizando-se uma etapa única de diluição com 1-propanol, seguida de injeção direta da amostra em sistema de HPLC(27,28). Porém, esse método é mais comumente utilizado em detectores do tipo eletroquímico, que apresentam maior sensibilidade permitindo a detecção de concentrações mínimas de CoQ10. Devido à menor sensibilidade dos detectores ultravioleta, o seu uso requer preparo de amostra mais elaborado, com etapas de extração utilizando solventes orgânicos como hexano(29,30), hexano/metanol(31,32) ou etanol(33), seguido de concentração da amostra para então posterior injeção em HPLC.

Neste trabalho, foram testados dois métodos de extração de CoQ10 em plasma humano: metanol:hexano e 1-propanol, ambos com detecção UV. Na tentativa de aperfeiçoar os métodos de extração da CoQ10 por detecção UV, foi testada a adição de alguns surfactantes como o SDS (dodecil sulfato de sódio), Triton X-100 e Tween-20 quanto à possibilidade de obter uma melhor recuperação ao final do processo de extração. Outras variáveis que podem influenciar diretamente no resultado da quantificação da CoQ10 também foram estudadas: temperatura (4°C e 19°C) e tipos de tubos (vidro e polipropileno).

 

OBJETIVO

Estabelecer uma rotina de extração dos níveis totais de CoQ10 em plasma humano por meio da análise por Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência (UHPLC).

 

MÉTODOS ANALÍTICOS

Reagentes e Solventes

Solventes de grau cromatográfico, metanol, hexano e 1-propanol foram obtidos da Merck (Darmstadt, Alemanha) e Sigma-Aldrich (Missouri, EUA), respectivamente. Reagentes como SDS (dodecil sulfato de sódio), Triton X-100 e padrão de CoQ10 (> 98% de pureza) foram obtidos da Sigma-Aldrich (Missouri, EUA) e Tween 20 foi obtido da Amresco (Solon, EUA). Solução de albumina humana 20% (Grifols Brasil Ltda).

Solução padrão

A solução padrão de CoQ10 foi preparada na concentração de 1mg/mL utilizando-se 1-propanol como solvente de diluição, e armazenada a -20ºC protegida da luz.

Preparo da amostra

Para estudos iniciais de otimização e padronização do processo de extração da CoQ10, utilizamos uma solução de albumina humana a 4% com o objetivo de simular amostras de plasma, que foi então, adicionada de solução padrão de CoQ10 resultando na concentração final de 1000mg/mL. Após definição do melhor método de extração, seguiu-se com o protocolo de coleta de sangue conforme descrito a seguir.

Amostras de sangue foram coletadas de um mesmo indivíduo controle por meio de punção venosa periférica em tubos de vidro contendo anticoagulante ácido cítrico, citrato de sódio e dextrose, e mantidas a 4°C. O plasma foi obtido após centrifugação a 894,2g por 10 minutos a 4°C, transferidos para tubos tipo eppendorf e estocados a -80°C para posterior análise. A coleta da amostra foi realizada após obtenção de assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Israelita Albert Einstein (nº10/1465).

Métodos de extração de CoQ10

Extração de CoQ10 com metanol:hexano

Utilizou-se o protocolo inicial(34), com as seguintes modificações: em tubo de polipropileno e em tubo de vidro foram adicionados 700mL de plasma, 100mL de detergentes (SDS, Triton X-100 e Tween-20) nas concentrações de 1%, 3%, 5% e 10% separadamente, 1400mL de metanol e 1500mL de hexano. As amostras foram submetidas à agitação mecânica por 1 minuto e centrifugadas a 1752,8g por 10 minutos a 10°C. Os sobrenadantes foram transferidos para um novo tubo e evaporados sem aquecimento sob fluxo de nitrogênio por 20 minutos. Em seguida, os resíduos foram ressuspendidos em 60mL de fase móvel metanol:hexano (85:15, v/v), homogeneizados sob agitação mecânica em vórtex por 15 segundos e agitação orbital por 15 minutos. Foram utilizados 20mL para análise cromatográfica. As extrações foram realizadas em triplicatas a 19°C (temperatura controlada) e a 4°C (banho de gelo).

Extração de CoQ10 com 1-propanol

Utilizou-se o protocolo inicial(27) com as seguintes modificações: em tubo de polipropileno e em tubo de vidro, foram adicionados 700mL de plasma, 100mL de detergentes (SDS, Triton X-100 e Tween 20) nas concentrações de 1%, 3%, 5% e 10% separadamente, 1400mL de 1-propanol. As amostras foram submetidas à agitação por 1 minuto e centrifugadas a 894,2g por 10 minutos a 10°C, e transferidas para "vial ambar" com o auxílio de unidade filtrante de 0,22mm, 13 mm. A análise cromatográfica foi realizada por meio da injeção de 20mL de amostra. As extrações foram realizadas em triplicatas a 19°C (temperatura controlada) e a 4°C (banho de gelo).

Análise cromatográfica e detecção de CoQ10

Utilizou-se um equipamento para Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência (UHPLC) HP1290 (Hewlett-Packard) constituído por amostrador automático, bomba binária e detector UV com comprimento de onda variável. A detecção foi feita em 275nm. Para a separação cromatográfica empregou-se coluna analítica Zorbax Eclipsy C18® (50 x 2,1mm, 1,8µm), com coluna-guarda equivalente, ambas obtidas da Hewlett-Packard e mantidas a 45°C durante a análise. A CoQ10 apresentou tempo de retenção de 1,5 minutos e o tempo total de análise cromatográfica foi de 3,5 minutos. A fase móvel utilizada foi metanol-hexano (85:15; v/v) com vazão de 0,45mL/min.

 

RESULTADOS

Estabelecimento do protocolo de extração de CoQ10

Para o estabelecimento do protocolo de extração de CoQ10 foram realizados, inicialmente, testes utilizando-se solução de albumina humana a 4% adicionada de solução de CoQ10 a 1000mg/mL. Os métodos de extração metanol:hexano e 1-propanol foram testados na presença e ausência de surfactantes como SDS (aniônico), Triton X-100 (não iônico) e Tween-20 (não iônico) nas concentrações de 1%, 3%, 5% e 10%, a 4°C e 19°C. Nos primeiros resultados foi possível observar que o método de extração utilizando-se metanol:hexano na presença dos surfactantes Triton X-100 e Tween-20 apresentou melhores taxas de recuperação de CoQ10, enquanto que com uso de SDS, apresentou menor reprodutibilidade e eficiência (dados não mostrados).

O mesmo protocolo de extração utilizado nos testes com albumina adicionada de CoQ10, foi aplicado em amostras de plasma de indivíduos controle sem adição de CoQ10 para verificar a reprodutibilidade do método em amostras reais. As amostras foram analisadas quanto a temperatura de extração (controlada a 19°C e a 4°C, banho de gelo) e quanto a constituição dos tubos utilizados para a extração (polipropileno e vidro), conforme tabela 1.

Os resultados demonstram que as extrações realizadas em amostras reais de plasma apresentaram resposta similar a encontrada em solução de albumina, sendo que o uso do detergente Tween-20 a 3%, a 4°C utilizando-se metanol:hexano, resultou na melhor resposta obtida para detecção de CoQ10 (Figura 1). Além de apresentar a melhor recuperação, também foi observada boa reprodutibilidade entre as replicatas com coeficiente de variação (CV) de 4,3%. Assim, a opção em fazer uso de surfactante como o Tween-20 resultou em uma melhora de (51,2%) de eficiência.

 

 

Os cromatogramas demonstram a qualidade cromatográfica obtida com a fase móvel composta de metanol:hexano (85:15, v/v) com fluxo de 0,45mL/min. (Figura 2). O tempo de retenção de CoQ10 foi de 1,45 minutos e a pureza do pico (99%) foi obtida por meio da análise de seu espetro (ChemStation, Agilent).

 

 

DISCUSSÃO

A aplicação de técnicas cromatográficas tem sido muito utilizada em estudos de dosagem enzimática e farmacocinética para monitoramento terapêutico. Recentemente, o interesse em dosar os níveis de CoQ10 em plasma e outros tipos celulares ou tecidos tem sido alvo de vários estudos dada a possibilidade de tratamento efetivo em pacientes neurológicos e doenças metabólicas por meio da sua suplementação via oral(35).

A CoQ10 está presente no plasma circulante associada a lipoproteínas, sendo que sua concentração está diretamente relacionada à concentração de colesterol presente no plasma(36). Devido a essa ligação característica da CoQ10 a moléculas de caráter lipofílico, optamos por fazer uso de surfactantes como auxiliares no processo de extração com o intuito de promover o rompimento desse tipo de ligação e assim aumentar os níveis de detecção da coenzima. Alguns autores demonstraram que a ação do SDS em plasma aumenta significativamente a recuperação da CoQ10 após processo de extração(37). Já a ação do Triton X-100 na solubilização de membranas foi observada tanto em proteínas quanto em lipídeos(38). De fato, ao iniciar os primeiros experimentos, baixas taxas de detecção de CoQ10 foram obtidas sem adição de surfactantes durante o processo de extração, observadas pela pequena área do pico cromatográfico (mUA).

Neste trabalho, os melhores resultados foram obtidos com o método de extração metanol:hexano quando comparado a 1-propanol. Alguns autores utilizam o 1-propanol como solvente de precipitação de proteínas devido ao seu maior caráter lipofílico, porém o sucesso do uso dessa técnica ocorre somente quando utilizada em detectores do tipo eletroquímico, uma vez que esse é mais sensível do que o utilizado neste estudo (UV). Isso ocorre porque essa técnica não permite concentrar a amostra no processo de extração, assim a adição de 1-propanol apenas atua precipitando as proteínas e diluindo a amostra, tornando mais difícil a quantificação da CoQ10 utilizando detectores UV. Observou-se também que a utilização dos surfactantes Triton X-100 e Tween-20 resultaram em melhores taxas de recuperação de CoQ10 enquanto o uso de SDS apresentou menor reprodutibilidade e eficiência. Além disso, mesmo utilizado em baixas concentrações, o SDS promoveu a formação de "ponto de nuvem" que prejudicou a separação das fazes orgânica e aquosa.

Quando o protocolo estabelecido utilizando-se solução de albumina humana foi aplicado para extração de CoQ10 em amostras reais de plasma, observou-se resposta similar com o uso do surfactante Tween 20 a 3%, a 4°C em metanol:hexano, resultando em melhor recuperação, boa reprodutibilidade entre as replicatas, CV de 4,3% e um aumento de 51,2% de eficiência no processo de extração.

A temperatura também é um parâmetro relevante a ser avaliado quando a substância estudada é uma enzima, que por ser termolábil, pode facilmente sofrer desnaturação a temperaturas mais elevadas.

Os melhores resultados deste trabalho mostraram que o controle da temperatura (4°C) é de primordial importância durante o processo de extração. Observou-se também que houve uma melhor separação das fases orgânica e aquosa quando utilizados tubos de polipropileno contribuindo, de fato, para uma melhora na eficiência de extração.

 

CONCLUSÃO

Pelas análises realizadas foi possível observar que a adição do surfactante Tween-20 promoveu um aumento na recuperação da CoQ10 pelo método de extração metanol:hexano. Este método mostrou boa reprodutibilidade, apresentando um CV baixo e sensibilidade alta, uma vez que a CoQ10 foi detectada em amostras de plasma de um indivíduo controle utilizando-se um detector do tipo UV.

A utilização de um equipamento de UHPLC proporcionou a obtenção de uma análise com tempo total de corrida de 3,5 minutos, o que viabiliza a obtenção rápida de resultados, considerado mandatório para rotinas laboratoriais.

Terminada esta etapa de otimização do método, este protocolo de extração está em fase de validação o que possibilitará sua aplicabilidade para futuros exames clínicos com garantia de resultados confiáveis.

 

AGRADECIMENTOS

Ao pesquisador Lionel F. Gamarra, Instituto do Cérebro, pelo auxílio no início do trabalho, à Marta J. Diniz pelo apoio técnico laboratorial, à Dra. Anna Carla Goldberg por permitir o desenvolvimento deste trabalho no Centro de Pesquisa Experimental do Hospital Israelita Albert Einstein. Ao Dr. Edson Amaro Júnior pela confiança depositada para o desenvolvimento deste trabalho. À FAPESP pelo apoio financeiro (10/51924-0).

 

REFERÊNCIAS

1. Rahman S, Clarke C., Hirano M. 176th ENMC International Workshop: Diagnosis and treatment of coenzyme Q10 deficiency. Neuromus Disord. 2012;22(1):76-86.         [ Links ]

2. Turunen M, Olsson J, Dallner G. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochim Biophys Acta. 2004;1660(1-2):171-99. Review.         [ Links ]

3. Quinzii CM, DiMauro S, Hirano M. Human coenzyme Q10 deficiency. Neurochem Res. 2007;32(4-5):723-7.         [ Links ]

4. Ogasahara S, Engel AG, Frens D, Mack D. Muscle coenzyme Q deficiency in familial mitochondrial encephalomyopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989; 86(7):2379-82.         [ Links ]

5. Musumeci O, Naini A, Slonim AE, Skavin N, Hadjigeorgiou GL, Krawiecki N, ET al. Familial cerebellar ataxia with muscle coenzyme Q10 deficiency. Neurology. 2001;56(7):849-55.         [ Links ]

6. Montero R, Pineda M, Aracil A, Vilaseca MA, Briones P, Sánchez-Alcázar JA, ET al. Clinical, biochemical and molecular aspects of cerebellar ataxia and Coenzyme Q10 deficiency. Cerebellum. 2007;6(2):118-22.         [ Links ]

7. Salviati L, Sacconi S, Murer L, Zacchello G, Franceschini L, Laverda AM, et al.Infantile encephalomyopathy and nephropathy with CoQ10 deficiency: a CoQ10-responsive condition. Neurology. 2005;65(4):606-8.         [ Links ]

8. Gironi M, Lamperti C, Nemni R, Moggio M, Comi G, Guerini FR, et al. Late-onset cerebellar ataxia with hypogonadism and muscle coenzyme Q10 deficiency. Neurology. 2004;62(5):818-20.         [ Links ]

9. Lagier-Tourenne C, Tazir M, López LC, Quinzii CM, Assoum M, Drouot N, et al. ADCK3, an ancestral kinase, is mutated in a form of recessive ataxia associated with coenzyme Q10 deficiency. Am J Hum Genet. 2008;82(3):661-72.         [ Links ]

10. Gin P, Clarke CF. Genetic evidence for a multi-subunit complex in coenzyme Q biosynthesis in yeast and the role of the Coq1 hexaprenyl diphosphate synthase. J Biol Chem. 2005;280(4):2676-81.         [ Links ]

11. Tzagoloff A, Dieckmann CL. PET genes of Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Rev. 1990;54(3):211-25.         [ Links ]

12. Johnson A, Gin P, Marbois BN, Hsieh EJ, Wu M, Barros MH, et al. COQ9, a new gene required for the biosynthesis of coenzyme Q in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 2005;280(36):31397-404.         [ Links ]

13. Barros MH, Johnson A, Gin P, Marbois BN, Clarke CF, Tzagoloff A. The Saccharomyces cerevisiae COQ10 gene encodes a START domain protein required for function of coenzyme Q in respiration. Biol Chem. 2005;280(52): 42627-35.         [ Links ]

14. Quinzii C, Naini A, Salviati L, Trevisson E, Navas P, Dimauro S, et al. A mutation in para-hydroxybenzoate-polyprenyl transferase (COQ2) causes primary coenzyme Q10 deficiency. Am J Hum Genet. 2006;78(2):345-9.         [ Links ]

15. Salviati L, Trevisson E, Rodriguez Hernandez MA, Casarin A, Pertegato V, Doimo M, et al. Haploinsufficiency of COQ4 causes coenzyme Q10 deficiency. J Med Genet. 2012;49(3):187-91.         [ Links ]

16. Heeringa SF, Chernin G, Chaki M, Zhou W, Sloan AJ, Ji Z, et al. COQ6 mutations in human patients produce nephrotic syndrome with sensorineural deafness. J Clin Invest. 2011;121(5):2013-24.         [ Links ]

17. Mollet J, Delahodde A, Serre V, Chretien D, Schlemmer D, Lombes A, et al. CABC1 gene mutations cause ubiquinone deficiency with cerebellar ataxia and seizures. Am J Hum Genet. 2008;82(3):623-30.         [ Links ]

18. Duncan AJ, Bitner-Glindzicz M, Meunier B, Costello H, Hargreaves IP, López LC, et al. A nonsense mutation in COQ9 causes autosomal-recessive neonatal-onset primary coenzyme Q10 deficiency: a potentially treatable form of mitochondrial disease. Am J Hum Genet. 2009;84(5):558-66.         [ Links ]

19. Mollet J, Giurgea I, Schlemmer D, Dallner G, Chretien D, Delahodde A, et al. Prenyldiphosphate synthase, subunit 1 (PDSS1) and OH-benzoate polyprenyltransferase (COQ2) mutations in ubiquinone deficiency and oxidative phosphorylation disorders. J Clin Invest. 2007;117(3):765-72.         [ Links ]

20. López LC, Schuelke M, Quinzii CM, Kanki T, Rodenburg RJ, Naini A, et al. Leigh syndrome with nephropathy and CoQ10 deficiency due to decaprenyl diphosphate synthase subunit 2 (PDSS2) mutations. Am J Hum Genet. 2006; 79(6):1125-9.         [ Links ]

21. Lamperti C, Naini AB, Lucchini V, Prelle A, Bresolin N, Moggio M, et al. Muscle coenzyme Q10 level in statin-related myopathy. Arch Neurol. 2005; 62(11):1709-12.         [ Links ]

22. Molyneux SL, Young JM, Florkowski CM, Lever M, George PM. Coenzyme q10: is there a clinical role and a case for measurement? Clin Biochem Rev. 2008;29(2):71-82.         [ Links ]

23. Ernster, L., Dallner, G. Biochemical, physiological and medical aspects of ubiquinone function. Biochim Biophys Acta. 1995;1271(1):195-204.         [ Links ]

24. Dimauro S, Rustin P. A critical approach to the therapy of mitochondrial respiratory chain and oxidative phosphorylation diseases. Biochim Biophys Acta. 2009;1792(12):1159-67.         [ Links ]

25. Kaikkonen J, Nyyssönen K, Salonen JT. Measurement and stability of plasma reduced, oxidized and total coenzyme Q10 in humans. Scand J Clin Lab Invest. 1999;59(6):457-66.         [ Links ]

26. Edlund PO. Determination of coenzyme Q10, alpha-tocopherol and cholesterol in biological samples by coupled-column liquid chromatography with coulometric and ultraviolet detection. J Chromatogr. 1988;425(1):87-97.         [ Links ]

27. Tang PH, Miles MV, DeGrauw A, Hershey A, Pesce A.HPLC analysis of reduced and oxidized coenzyme Q(10) in human plasma. Clin Chem. 2001;47(2):256-65.         [ Links ]

28. Littarru GP, Mosca F, Fattorini D, Bompadre S, Battino M. Assay of coenzyme Q10 in plasma by a single dilution step. Methods Enzymol. 2004;378:170-6. Review.         [ Links ]

29. Okamoto T, Fukunaga Y, Ida Y, Kishi T. Determination of reduced and total ubiquinones in biological materials by liquid chromatography with electrochemical detection. J Chromatogr. 1988;430(1):11-9.         [ Links ]

30. Kommuru TR, Khan MA, Ashraf M, Kattenacker R, Reddy IK. A simplified chromatographic method for quantitative determination of coenzyme Q10 in dog plasma. J Pharm Biomed Anal. 1998;16(6):1037-40.         [ Links ]

31. Takada M, IKenoya S,Yuzuriha T, Katayama K. Simultaneous determination of reduced and oxidezed coenzyme Q10 in human plasma. Methods Enzymol. 1984;105:147-55.         [ Links ]

32. Yamashita S, Yamamoto Y. Simultaneous detection of ubiquinol and ubiquinone in human plasma as a marker of oxidative stress. Anal Biochem. 1997;250(1):66-73.         [ Links ]

33. Wang Q, Lee BL, Ong CN. Automated high-performance liquid chromatographic method with precolumn reduction for the determination of ubiquinol and ubiquinone in human plasma. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 1999;726(1-2):297-302.         [ Links ]

34. Karpińska J, Mikołuć B, Motkowski R, Piotrowska-Jastrzebska J. HPLC method for simultaneous determination of retinol, alpha-tocopherol and coenzyme Q10 in human plasma. J Pharm Biomed Anal. 2006;42(2):232-6.         [ Links ]

35. Alleva R, Tomasetti M, Bompadre S, Littarru GP. Oxidation of LDL and their subfractions: kinetic aspects and CoQ10 content. Mol Aspects Med. 1997;18 Suppl:S105-12.         [ Links ]

36. Menke T, Niklowitz P, de Sousa G, Reinehr T, Andler W. Comparison of coenzyme Q10 plasma levels in obese and normal weight children. Clin Chim Acta. 2004;349(1-2):121-7.         [ Links ]

37. Hirota K, Kawase M, Kishie T. Effect of sodium dodecyl sulphate on the extraction of ubiquinone-10 in the determination of plasma samples. J Chromatogr. 1984;310(1):204-7.         [ Links ]

38. González-Mañas JM, Virto MD, Gurtubay JI, Goñi FM. The interaction of Triton X-100 with purple membranes. Detergent binding, spectral changes and membrane solubilization.Eur J Biochem. 1990;188(3):673-8.         [ Links ]

 

 

Autor correspondente:
Claudia Cristina Ferreiro-Barros
Avenida Albert Einstein, 627 – Morumbi
CEP: 05651-901 – São Paulo (SP) – Brasil
E-mail: claudiacfb@einstein.br

Data de submissão: 5/9/2011
Data de aceite: 28/5/2012
Conflitos de interesse: não há.

 

 

Trabalho realizado no Instituto do Cérebro – InCe, Hospital Israelita Albert Einstein – HIAE, São Paulo (SP), Brasil.