Determinação de um método de extração de coenzima Q10 em plasma humano: otimização do uso de surfactantes e outras variáveis

Resumos

OBJECTIVE: To establish a routine for the extraction of the total levels of CoQ10 in human plasma through the Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC). METHODS: Two extraction protocols were tested: a) methanol: hexane and b) 1-propanol. The following parameters were analyzed: extraction temperature (19ºC and 4ºC), extraction tubes (glass and polypropylene), and surfactants (SDS, Triton X-100, Tween-20) at different concentrations, i.e., 1%, 3%, 5% and 10%. RESULTS: The results showed that the method of extraction of CoQ10 in a sample of human plasma at 4ºC, using solvents methanol: hexane (85:15, v/v) in the presence of surfactant Tween-20 at 3% and polypropylene tubes showed better efficiency and reproducibility when compared to the method with 1-propanol. CONCLUSION: By the analyses performed, it was possible to observe that the addition of the surfactant Tween-20 promoted an increase in the recovery of CoQ10 by the methanol:hexane extraction method. This method showed good reproducibility, with a low coefficient of variation and high sensitivity, since CoQ10 was detected in samples of plasma of a control individual using a UV-type detector. The use of UHPLC equipment allowed a total analysis with total run time of 3.5 minutes, enabling the rapid achievement of results, considered mandatory for laboratory routines.

Coenzymes; Surfactants; Chromatography, liquid

ARTIGO ORIGINAL

Determinação de um método de extração de coenzima Q₁₀ em plasma humano: otimização do uso de surfactantes e outras variáveis

Claudia Cristina Ferreiro-Barros^I; Eduardo Kinio Sugawara^II; Livia Rentas Sanches^II

^IInstituto do Cérebro – InCe, Hospital Israelita Albert Einstein – HIAE, São Paulo (SP), Brasil

^IILaboratório Clínico/ Química Especial, Hospital Israelita Albert Einstein – HIAE, São Paulo (SP), Brasil

Autor correspondente

RESUMO

OBJETIVO: Estabelecer uma rotina de extração dos níveis totais de CoQ₁₀ em plasma humano por meio da análise por Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência (UHPLC).

MÉTODOS: foram testados dois protocolos de extração: a) metanol:hexano e b) 1-propanol. Os seguintes parâmetros foram analisados: temperatura de extração (19ºC e 4ºC), tubos de extração (vidro e polipropileno), surfactantes (SDS, Triton X-100, Tween-20) em diferentes concentrações 1%, 3%, 5% e 10%.

RESULTADOS: Os resultados mostraram que o método de extração de CoQ₁₀ em amostra de plasma humano, a 4ºC, utilizando-se os solventes metanol:hexano (85:15, v/v) na presença do surfactante Tween-20 a 3% e tubos de polipropileno apresentou melhor eficiência e reprodutibilidade quando comparado ao método com 1-propanol.

CONCLUSÃO: A adição do surfactante Tween-20 no processo de preparação de amostra promoveu um aumento na recuperação da CoQ₁₀ pelo método de extração metanol:hexano observada pela boa reprodutibilidade das prelicatas, pelo baixo coeficiente de variação e alta sensibilidade uma vez que a CoQ₁₀ foi detectada em amostras de plasma de um indivíduo controle utilizando-se um detector do tipo UV. Além disso, a utilização de um equipamento de UHPLC proporcionou a obtenção de uma análise com tempo total de corrida de 3,5 minutos, o que viabiliza a obtenção rápida de resultados, considerado mandatório para rotinas laboratoriais.

Descritores: Coenzimas; Surfactantes; Cromatografia líquida

INTRODUÇÃO

Coenzima Q₁₀ (CoQ₁₀), também conhecida como ubiquinona, é uma molécula lipídica essencial para os organismos aeróbicos. Participa da produção de ATP pela fosforilação oxidativa transferindo elétrons dos complexos respiratórios I e II para o complexo III na membrana interna mitocondrial. Além disso, a CoQ₁₀ participa de muitas outras funções vitais dentro da célula: atua como antioxidante de lipoproteínas e membranas celulares; sua participação é necessária na biossíntese de pirimidinas, afetando assim os processos de replicação e reparo de DNA; modula o processo de apoptose por meio da regulação dos poros de transição da membrana e auxilia na manutenção da temperatura corpórea decorrente de sua função em proteínas desacopladoras⁽¹⁾.

A CoQ₁₀ é composta por um anel de benzoquinona associada a uma cadeia poliprenil derivada da via do mevalonato, a mesma via da síntese do colesterol. O tamanho dessa cadeia poliprenil varia entre os organismos, a espécie humana apresenta 10 repetições (CoQ₁₀), enquanto camundongos apresentam 9 (CoQ₉) e Saccharomyces cerevisiae 6 (CoQ₆).

A síntese endógena da CoQ₁₀ ocorre na mitocôndria⁽¹⁾. É expressa em todos os tecidos, porém, em maior concentração no coração, rins, fígado e músculo, pois são órgãos que necessitam de maior quantidade de energia (ATP) para seu funcionamento, ocorrendo diminuição da sua expressão durante o processo de envelhecimento celular⁽²⁾.

Clinicamente, pacientes com deficiência de CoQ₁₀ são muito heterogêneos, com alta variação fenotípica principalmente em relação às manifestações neurológicas⁽³⁾. Entretanto, alguns subtipos de apresentação clínica parecem ser mais comuns: (1) encefalomiopatia, com miopatia mitocondrial e mioglobinúria recorrente⁽⁴⁾; (2) envolvimento infantil multissistêmico; (3) síndrome de Leigh; (4) forma miopática⁽⁵⁾; (5) forma atáxica, provavelmente a mais comum dentre as cinco formas⁽⁶⁾; (6) síndrome nefrótica resistente a esteroides⁽⁷⁾. Sua associação com outros fenótipos clínicos como convulsões, fraqueza muscular, retardo mental, oftalmoplegia, neuropatia periférica, sinais piramidais e escoliose é bastante frequente. O hipogonadismo hipergonadotrófico parece ser mais comum em pacientes com início tardio da doença⁽⁸⁾.

A deficiência primária da CoQ₁₀ é autossômica recessiva e está inserida no grupo de Doenças Mitocondriais. É causada por um defeito na via biossintética da ubiquinona a qual ainda não está completamente elucidada ⁽⁶⁾. Dentre as doenças mitocondriais descritas, a deficiência de CoQ₁₀ é a única, até o momento, que apresenta chances de tratamento efetivo por meio da administração de CoQ₁₀ exógena⁽⁹⁾.

Grande parte do que se conhece sobre a biossíntese de coenzima Q advém de estudos realizados em Escherichia coli e S. cerevisiae ⁽¹⁰⁾. Há pelo menos uma dezena de genes nomeados como COQ1, COQ2, COQ3... COQ10 em S. cerevisiae, necessários para a função respiratória da coenzima Q^(10-13).

Na espécie humana, já foram descritos pacientes com mutações nos genes COQ2, COQ4, COQ6, COQ8, COQ9, PDSS1 e PDSS2 ^(14-20).

A deficiência secundária no metabolismo da CoQ₁₀ tem sido discutida na patofisiologia de miopatia por estatina, toxicidade por antraciclina e doença de Parkinson, porém ainda não se conhece a relativa contribuição da CoQ₁₀ no desencadeamento dessas doenças^(21,22).

No entanto, a suplementação com CoQ₁₀ é amplamente recomendada em altas doses (30mg/kg em crianças e no mínimo 600mg diariamente em adultos) para todos os pacientes com doenças mitocondriais, pois é um suplemento que não tem efeitos colaterais e traz muitos benefícios para o metabolismo celular^(23,24). Por ser lipofílica, a CoQ₁₀ é transportada na circulação por partículas de lipoproteínas e sua concentração no plasma tem sido correlacionada aos níveis totais de colesterol, principalmente aos de LDL, em pacientes que fazem uso de estatinas^(25,26).

Dada essa possibilidade efetiva de tratamento, o interesse em dosar os níveis de CoQ₁₀ em plasma e outros tipos celulares ou tecidos tem sido alvo de vários estudos. O diagnóstico de deficiência de CoQ₁₀ é realizado por meio da análise da atividade enzimática dos complexos mitocondriais I+II e II+III⁽¹⁾ e também da quantificação dos níveis totais da enzima diretamente no músculo ou fibroblastos. Os níveis de CoQ₁₀ dosados no sangue não são utilizados para diagnóstico, pois a CoQ₁₀ está presente em certos alimentos e é absorvida por meio da dieta. Porém, é utilizada para monitoramento terapêutico em pacientes com comprovada deficiência da coenzima.

Há vários métodos para quantificação de CoQ₁₀ em plasma, células e tecidos descritos na literatura científica. O uso de equipamentos de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) em fase reversa acoplados a detectores do tipo eletroquímico ou ultravioleta (UV) é bastante frequente. Atualmente, a maioria dos métodos envolve preparação de amostra utilizando-se uma etapa única de diluição com 1-propanol, seguida de injeção direta da amostra em sistema de HPLC^(27,28). Porém, esse método é mais comumente utilizado em detectores do tipo eletroquímico, que apresentam maior sensibilidade permitindo a detecção de concentrações mínimas de CoQ₁₀. Devido à menor sensibilidade dos detectores ultravioleta, o seu uso requer preparo de amostra mais elaborado, com etapas de extração utilizando solventes orgânicos como hexano^(29,30), hexano/metanol^(31,32) ou etanol⁽³³⁾, seguido de concentração da amostra para então posterior injeção em HPLC.

Neste trabalho, foram testados dois métodos de extração de CoQ₁₀ em plasma humano: metanol:hexano e 1-propanol, ambos com detecção UV. Na tentativa de aperfeiçoar os métodos de extração da CoQ₁₀ por detecção UV, foi testada a adição de alguns surfactantes como o SDS (dodecil sulfato de sódio), Triton X-100 e Tween-20 quanto à possibilidade de obter uma melhor recuperação ao final do processo de extração. Outras variáveis que podem influenciar diretamente no resultado da quantificação da CoQ₁₀ também foram estudadas: temperatura (4°C e 19°C) e tipos de tubos (vidro e polipropileno).

OBJETIVO

Estabelecer uma rotina de extração dos níveis totais de CoQ₁₀ em plasma humano por meio da análise por Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência (UHPLC).

MÉTODOS ANALÍTICOS

Reagentes e Solventes

Solventes de grau cromatográfico, metanol, hexano e 1-propanol foram obtidos da Merck (Darmstadt, Alemanha) e Sigma-Aldrich (Missouri, EUA), respectivamente. Reagentes como SDS (dodecil sulfato de sódio), Triton X-100 e padrão de CoQ₁₀ (> 98% de pureza) foram obtidos da Sigma-Aldrich (Missouri, EUA) e Tween 20 foi obtido da Amresco (Solon, EUA). Solução de albumina humana 20% (Grifols Brasil Ltda).

Solução padrão

A solução padrão de CoQ₁₀ foi preparada na concentração de 1mg/mL utilizando-se 1-propanol como solvente de diluição, e armazenada a -20ºC protegida da luz.

Preparo da amostra

Para estudos iniciais de otimização e padronização do processo de extração da CoQ₁₀, utilizamos uma solução de albumina humana a 4% com o objetivo de simular amostras de plasma, que foi então, adicionada de solução padrão de CoQ₁₀ resultando na concentração final de 1000mg/mL. Após definição do melhor método de extração, seguiu-se com o protocolo de coleta de sangue conforme descrito a seguir.

Amostras de sangue foram coletadas de um mesmo indivíduo controle por meio de punção venosa periférica em tubos de vidro contendo anticoagulante ácido cítrico, citrato de sódio e dextrose, e mantidas a 4°C. O plasma foi obtido após centrifugação a 894,2g por 10 minutos a 4°C, transferidos para tubos tipo eppendorf e estocados a -80°C para posterior análise. A coleta da amostra foi realizada após obtenção de assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Israelita Albert Einstein (nº10/1465).

Métodos de extração de CoQ₁₀

Extração de CoQ₁₀ com metanol:hexano

Utilizou-se o protocolo inicial⁽³⁴⁾, com as seguintes modificações: em tubo de polipropileno e em tubo de vidro foram adicionados 700mL de plasma, 100mL de detergentes (SDS, Triton X-100 e Tween-20) nas concentrações de 1%, 3%, 5% e 10% separadamente, 1400mL de metanol e 1500mL de hexano. As amostras foram submetidas à agitação mecânica por 1 minuto e centrifugadas a 1752,8g por 10 minutos a 10°C. Os sobrenadantes foram transferidos para um novo tubo e evaporados sem aquecimento sob fluxo de nitrogênio por 20 minutos. Em seguida, os resíduos foram ressuspendidos em 60mL de fase móvel metanol:hexano (85:15, v/v), homogeneizados sob agitação mecânica em vórtex por 15 segundos e agitação orbital por 15 minutos. Foram utilizados 20mL para análise cromatográfica. As extrações foram realizadas em triplicatas a 19°C (temperatura controlada) e a 4°C (banho de gelo).

Extração de CoQ₁₀ com 1-propanol

Utilizou-se o protocolo inicial⁽²⁷⁾ com as seguintes modificações: em tubo de polipropileno e em tubo de vidro, foram adicionados 700mL de plasma, 100mL de detergentes (SDS, Triton X-100 e Tween 20) nas concentrações de 1%, 3%, 5% e 10% separadamente, 1400mL de 1-propanol. As amostras foram submetidas à agitação por 1 minuto e centrifugadas a 894,2g por 10 minutos a 10°C, e transferidas para "vial ambar" com o auxílio de unidade filtrante de 0,22mm, 13 mm. A análise cromatográfica foi realizada por meio da injeção de 20mL de amostra. As extrações foram realizadas em triplicatas a 19°C (temperatura controlada) e a 4°C (banho de gelo).

Análise cromatográfica e detecção de CoQ₁₀

Utilizou-se um equipamento para Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência (UHPLC) HP1290 (Hewlett-Packard) constituído por amostrador automático, bomba binária e detector UV com comprimento de onda variável. A detecção foi feita em 275nm. Para a separação cromatográfica empregou-se coluna analítica Zorbax Eclipsy C18^® (50 x 2,1mm, 1,8µm), com coluna-guarda equivalente, ambas obtidas da Hewlett-Packard e mantidas a 45°C durante a análise. A CoQ₁₀ apresentou tempo de retenção de 1,5 minutos e o tempo total de análise cromatográfica foi de 3,5 minutos. A fase móvel utilizada foi metanol-hexano (85:15; v/v) com vazão de 0,45mL/min.

RESULTADOS

Estabelecimento do protocolo de extração de CoQ₁₀

Para o estabelecimento do protocolo de extração de CoQ₁₀ foram realizados, inicialmente, testes utilizando-se solução de albumina humana a 4% adicionada de solução de CoQ₁₀ a 1000mg/mL. Os métodos de extração metanol:hexano e 1-propanol foram testados na presença e ausência de surfactantes como SDS (aniônico), Triton X-100 (não iônico) e Tween-20 (não iônico) nas concentrações de 1%, 3%, 5% e 10%, a 4°C e 19°C. Nos primeiros resultados foi possível observar que o método de extração utilizando-se metanol:hexano na presença dos surfactantes Triton X-100 e Tween-20 apresentou melhores taxas de recuperação de CoQ_10, enquanto que com uso de SDS, apresentou menor reprodutibilidade e eficiência (dados não mostrados).

O mesmo protocolo de extração utilizado nos testes com albumina adicionada de CoQ₁₀, foi aplicado em amostras de plasma de indivíduos controle sem adição de CoQ₁₀ para verificar a reprodutibilidade do método em amostras reais. As amostras foram analisadas quanto a temperatura de extração (controlada a 19°C e a 4°C, banho de gelo) e quanto a constituição dos tubos utilizados para a extração (polipropileno e vidro), conforme tabela 1.

Os resultados demonstram que as extrações realizadas em amostras reais de plasma apresentaram resposta similar a encontrada em solução de albumina, sendo que o uso do detergente Tween-20 a 3%, a 4°C utilizando-se metanol:hexano, resultou na melhor resposta obtida para detecção de CoQ₁₀ (Figura 1). Além de apresentar a melhor recuperação, também foi observada boa reprodutibilidade entre as replicatas com coeficiente de variação (CV) de 4,3%. Assim, a opção em fazer uso de surfactante como o Tween-20 resultou em uma melhora de (51,2%) de eficiência.

Os cromatogramas demonstram a qualidade cromatográfica obtida com a fase móvel composta de metanol:hexano (85:15, v/v) com fluxo de 0,45mL/min. (Figura 2). O tempo de retenção de CoQ₁₀ foi de 1,45 minutos e a pureza do pico (99%) foi obtida por meio da análise de seu espetro (ChemStation, Agilent).

DISCUSSÃO

A aplicação de técnicas cromatográficas tem sido muito utilizada em estudos de dosagem enzimática e farmacocinética para monitoramento terapêutico. Recentemente, o interesse em dosar os níveis de CoQ₁₀ em plasma e outros tipos celulares ou tecidos tem sido alvo de vários estudos dada a possibilidade de tratamento efetivo em pacientes neurológicos e doenças metabólicas por meio da sua suplementação via oral⁽³⁵⁾.

A CoQ₁₀ está presente no plasma circulante associada a lipoproteínas, sendo que sua concentração está diretamente relacionada à concentração de colesterol presente no plasma⁽³⁶⁾. Devido a essa ligação característica da CoQ₁₀ a moléculas de caráter lipofílico, optamos por fazer uso de surfactantes como auxiliares no processo de extração com o intuito de promover o rompimento desse tipo de ligação e assim aumentar os níveis de detecção da coenzima. Alguns autores demonstraram que a ação do SDS em plasma aumenta significativamente a recuperação da CoQ₁₀ após processo de extração⁽³⁷⁾. Já a ação do Triton X-100 na solubilização de membranas foi observada tanto em proteínas quanto em lipídeos⁽³⁸⁾. De fato, ao iniciar os primeiros experimentos, baixas taxas de detecção de CoQ₁₀ foram obtidas sem adição de surfactantes durante o processo de extração, observadas pela pequena área do pico cromatográfico (mUA).

Neste trabalho, os melhores resultados foram obtidos com o método de extração metanol:hexano quando comparado a 1-propanol. Alguns autores utilizam o 1-propanol como solvente de precipitação de proteínas devido ao seu maior caráter lipofílico, porém o sucesso do uso dessa técnica ocorre somente quando utilizada em detectores do tipo eletroquímico, uma vez que esse é mais sensível do que o utilizado neste estudo (UV). Isso ocorre porque essa técnica não permite concentrar a amostra no processo de extração, assim a adição de 1-propanol apenas atua precipitando as proteínas e diluindo a amostra, tornando mais difícil a quantificação da CoQ₁₀ utilizando detectores UV. Observou-se também que a utilização dos surfactantes Triton X-100 e Tween-20 resultaram em melhores taxas de recuperação de CoQ₁₀ enquanto o uso de SDS apresentou menor reprodutibilidade e eficiência. Além disso, mesmo utilizado em baixas concentrações, o SDS promoveu a formação de "ponto de nuvem" que prejudicou a separação das fazes orgânica e aquosa.

Quando o protocolo estabelecido utilizando-se solução de albumina humana foi aplicado para extração de CoQ₁₀ em amostras reais de plasma, observou-se resposta similar com o uso do surfactante Tween 20 a 3%, a 4°C em metanol:hexano, resultando em melhor recuperação, boa reprodutibilidade entre as replicatas, CV de 4,3% e um aumento de 51,2% de eficiência no processo de extração.

A temperatura também é um parâmetro relevante a ser avaliado quando a substância estudada é uma enzima, que por ser termolábil, pode facilmente sofrer desnaturação a temperaturas mais elevadas.

Os melhores resultados deste trabalho mostraram que o controle da temperatura (4°C) é de primordial importância durante o processo de extração. Observou-se também que houve uma melhor separação das fases orgânica e aquosa quando utilizados tubos de polipropileno contribuindo, de fato, para uma melhora na eficiência de extração.

CONCLUSÃO

Pelas análises realizadas foi possível observar que a adição do surfactante Tween-20 promoveu um aumento na recuperação da CoQ₁₀ pelo método de extração metanol:hexano. Este método mostrou boa reprodutibilidade, apresentando um CV baixo e sensibilidade alta, uma vez que a CoQ₁₀ foi detectada em amostras de plasma de um indivíduo controle utilizando-se um detector do tipo UV.

A utilização de um equipamento de UHPLC proporcionou a obtenção de uma análise com tempo total de corrida de 3,5 minutos, o que viabiliza a obtenção rápida de resultados, considerado mandatório para rotinas laboratoriais.

Terminada esta etapa de otimização do método, este protocolo de extração está em fase de validação o que possibilitará sua aplicabilidade para futuros exames clínicos com garantia de resultados confiáveis.

AGRADECIMENTOS

Ao pesquisador Lionel F. Gamarra, Instituto do Cérebro, pelo auxílio no início do trabalho, à Marta J. Diniz pelo apoio técnico laboratorial, à Dra. Anna Carla Goldberg por permitir o desenvolvimento deste trabalho no Centro de Pesquisa Experimental do Hospital Israelita Albert Einstein. Ao Dr. Edson Amaro Júnior pela confiança depositada para o desenvolvimento deste trabalho. À FAPESP pelo apoio financeiro (10/51924-0).

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Set 2012
• Data do Fascículo
  Jun 2012

Histórico

• Recebido
  05 Set 2011
• Aceito
  28 Maio 2012