Padronização de modelo experimental adequado a estudos do efeito do exercício na artrite

Resumos

OBJECTIVE: To standardize an experimental model of chronic monoarthritis induced by complete Freund's adjuvant appropriate for the analysis of the effect of walking on nociception and on joint edema. METHODS: The following factors were evaluated as to monoarthritis induction: route and site of administration, number and interval of inoculations, Mycobacterium species, and animal gender. Wistar male and female rats (200 to 250g) received two injections of complete Freund's adjuvant containing Mycobacterium tuberculosis (1.0mg/mL; 50µL) or Mycobacterium butyricum (0.5mg/mL; 50µL) intra-articularly in the tibiotarsal or tibiofemoral joints, or an injection of complete Freund's adjuvant (Mycobacterium butyricum or tuberculosis) intradermally at the base of the tail and another intra-articularly (tibiotarsal or tibiofemoral). The animals were submitted to evaluations of articular disability and edema. Articular disability was assessed by paw elevation time (in seconds) during the one-minute walk test. Edema of the tibiofemoral joint was assessed by variation of joint diameter (cm). Tibiotarsal joint edema was measured by the volume of the paw (mL). RESULTS: Administration of complete Freund's adjuvant containing Mycobacterium butyricum increased paw elevation time and edema in both joints. CONCLUSIONS: These data allow standardization of an animal model of chronic monoarthritis adequate for analysis of the effects of exercise on treatment of rheumatoid arthritis.

Arthritis, experimental; Edema; Models, animal; Nociception; Freund's adjuvant; Exercise; Wistar

ARTIGO ORIGINAL

Padronização de modelo experimental adequado a estudos do efeito do exercício na artrite

Raquel Pinheiro Gomes^I; Elisangela Bressan^II; Tatiane Morgana da Silva^I; Monique da Silva Gevaerd^I; Carlos Rogério Tonussi^II; Susana Cristina Domenech^I

^IUniversidade do Estado de Santa Catarina, Florianópolis, SC, Brasil

^IIUniversidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, SC, Brasil

^{Autor correspondente}

RESUMO

OBJETIVO: Padronizar um modelo experimental de monoartrite crônica induzida por adjuvante completo de Freund apropriado à análise do efeito da deambulação na nocicepção e no edema articular.

MÉTODOS: Foram avaliados os seguintes fatores para a indução da monoartrite: via e local de administração, número e intervalo das inoculações, espécie de micobactéria e gênero dos animais. Para tanto, ratos Wistar machos e fêmeas (200 a 250g) receberam duas injeções de adjuvante completo de Freund contendo Mycobacterium tuberculosis (1,0mg/mL; 50µL) ou Mycobacterium butiricum (0,5mg/mL; 50µL) intra-articular nas articulações tibiotársica ou tibiofemural ou, ainda, uma injeção de adjuvante completo de Freund (Mycobacterium butiricum ou tuberculosis) intradérmica na base da cauda e outra intra-articular (tibiotársica ou tibiofemural). Os animais foram submetidos à avaliação da incapacitação e edema articulares. A incapacitação articular foi avaliada pelo tempo de elevação da pata (em segundos) durante a marcha de 1 minuto. O edema da articulação tibiofemural foi avaliado pela variação do diâmetro articular (cm). O edema da articulação tibiotársica foi medido pelo volume da pata (mL).

RESULTADOS: A administração de adjuvante completo de Freund, contendo Mycobacterium butiricum, aumentou o tempo de elevação da pata e o edema, em ambas as articulações.

CONCLUSÃO: Esses dados possibilitaram a padronização de um modelo animal de monoartrite crônica, adequado à análise dos efeitos do exercício no tratamento da artrite reumatoide.

Descritores: Artrite experimental; Edema; Modelos animais; Nociceptividade; Adjuvante de Freund/administração & dosagem; Exercício; Wistar

INTRODUÇÃO

A artrite reumatoide (AR) é um processo inflamatório crônico e sistêmico, que destrói gradativamente a sinóvia e as estruturas periarticulares^(1-3). A dor e o edema articulares são os principais sintomas^(4,5), gerando limitações no movimento, restrições funcionais e declínio dos sistemas musculoesquelético, cardiopulmonar e neuromuscular⁽⁶⁾. Estudos têm evidenciado que a prática regular de exercício atenua a resposta inflamatória, a dor e o edema articulares, contribuindo para a restauração da amplitude de movimento articular, força muscular e melhora das condições cardiovasculares^(6-8), porém, seu efeito ainda não foi totalmente esclarecido.

Com a finalidade de estudar a etiopatogenia da artrite e de buscar diferentes tratamentos, inúmeros modelos experimentais que representam a artrite humana têm sido desenvolvidos durante anos^(4,9-27). Dentre os modelos experimentais de AR desenvolvidos^(9-26) destaca-se a artrite induzida por adjuvante completo de Freund (CFA)^{(9,10-17,19,22,23,25,26)}. Em modelos animais, a manifestação e a severidade dos sintomas podem variar em função do gênero do animal utilizado, via e local de administração, espécie de micobactéria, número e intervalo das inoculações^{(9-17,19,22,23,25,26)}. Dessa forma, a realização de um estudo sobre os efeitos do exercício nos sintomas da artrite induzida por adjuvante requer, primeiramente, a padronização de um modelo animal adequado a essa finalidade.

OBJETIVO

Padronizar um modelo experimental de monoartrite crônica induzida por CFA em ratos, para análise do efeito da deambulação na nocicepção e no edema articular.

MÉTODOS

Animais

Foram utilizados 30 ratos Wistar, sendo 18 machos, com 60 dias de idade (200 a 250g), provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). Os animais foram mantidos em condições controladas de umidade e temperatura (22±2°C), com ciclo claro/escuro de 12 horas e livre acesso a água e ração. Os experimentos foram conduzidos conforme as diretrizes éticas da Associação Internacional para o Estudo da Dor e aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UFSC (protocolo 100/CEUA/PRPe/2007).

Drogas e reagentes

Neste estudo, foram utilizados: CFA Mycobacterium tuberculosis (1mg/mL, Sigma^®) ou Mycobabterium butyricum (0,5mg/mL, Difco^®); solução isotônica de cloreto de sódio (0,9%, Aster^®); gás halotano (250mL, 1:1_v/v, 2 a 4% diluído em O₂ hospitalar, Cristália^®); álcool iodado (1%, Rialcool^®); e solução aquosa de sulfato de lauril (2,5% Vetec^®).

Teste de incapacitação articular

A incapacitação articular foi mensurada por meio do tempo (segundos) de elevação da pata (TEP) dos animais, com o auxílio do sistema de registro proposto por Tonussi e Ferreira⁽²¹⁾, que avalia a nocicepção. Nessa análise, os animais foram submetidos à deambulação forçada em um cilindro de aço inox (30x30cm) em velocidade constante (3 rpm) por 60 segundos. Sapatilhas metálicas foram ajustadas nas patas traseiras, sendo que apenas a sapatilha da pata direita foi conectada a um computador, que registrou o tempo total que esta ficava sem tocar a superfície do cilindro durante o teste. Uma semana antes do início do experimento, os animais foram habituados ao procedimento de deambulação pelo tempo suficiente para aprenderem a se manter no topo do cilindro em movimento. Uma hora antes do teste, foi feita a habituação com as sapatilhas. O TEP de animais sem nenhum tratamento intra-articular é de aproximadamente 10 segundos⁽²⁰⁾. O aumento do TEP após a injeção intra-articular de agentes flogísticos indica desenvolvimento de incapacitação articular⁽²⁰⁾.

Avaliação do edema articular

A avaliação do edema da articulação tibiofemural (TF) foi realizada com o auxílio de um paquímetro analógico (precisão de 0,05mm) pelo registro da variação do diâmetro articular (DA) em centímetros⁽¹⁵⁾. A avaliação do edema da articulação tibiotársica (TT) foi realizada com o auxílio de uma cubeta plástica preenchida com sulfato de lauril (2,5%) em água, acoplada a uma balança eletrônica de precisão (Acculab, V-121). A pata do animal foi submersa até imediatamente acima da articulação TT. Registrou-se o deslocamento da coluna líquida dentro da cubeta, em mililitros. Cada 1mL de líquido deslocado na cubeta correspondia a 1g de peso da pata⁽²⁷⁾.

Os registros de TEP e edema foram realizados imediatamente antes do estímulo com CFA (medida basal) e posteriormente até o final de cada experimento. As medidas de edema foram realizadas antes da análise do TEP.

Procedimentos experimentais

O estudo foi realizado no Laboratório de Neurobiologia da Nocicepção (LANEN) do Departamento de Farmacologia da UFSC. Para desenvolver o modelo de artrite, foram testados diferentes procedimentos, variando-se a via e o local de administração (TF, na região do ligamento suprapatelar, ou TT, região lateral da articulação); a espécie de micobactéria; o número e o intervalo das inoculações e o gênero dos animais. Para tanto, foram realizados cinco experimentos, nos quais foram avaliados a incapacitação e o edema articulares até que os valores retornassem ao basal (final do experimento).

Experimento 1

Para definir o número de administrações de CFA necessárias para promover uma artrite crônica, 6 ratos machos receberam 2 injeções de CFA (intra-articular) contendo Mycobacterium tuberculosis (1mg/mL; 50µL) na articulação TF com um intervalo de 8 dias entre cada injeção. O TEP e DA foram avaliados diariamente até o 19º dia e a cada 2 dias, até o 29° dia de experimento.

Experimento 2

Para definir a via de administração e o intervalo entre as inoculações, seis ratos machos receberam uma injeção intradérmica de CFA contendo Mycobacterium tuberculosis (1mg/mL; 50µL) na base da cauda e na articulação TF (intra-articular, 50µL), após 21 dias. O TEP e DA foram avaliados diariamente até o 28º dia e a cada 2 dias até o 42º dia.

Para verificar diferenças no comportamento da indução de artrite ao modificar o gênero dos animais, a espécie de micobactéria empregada e o tipo de articulação, foram realizados os experimentos 3 a 5.

Experimento 3

Seis ratos machos receberam uma injeção de CFA contendo Mycobacterium tuberculosis (1mg/mL; 50µL) na base da cauda (intradérmica) e outra na articulação TT (intra-articular, 50µL), após 21 dias. O TEP e edema foram avaliados diariamente até o 28º dia e a cada 2 dias, até o 39º dia.

Experimento 4

Seis ratos fêmeas receberam uma injeção de CFA contendo Mycobacterium butyricum (0,5mg/mL; 50µL) na base da cauda (intradérmica) e outra na articulação TT (intra-articular, 50µL), após 21 dias. O TEP e edema foram avaliados diariamente até o 28º dia e a cada 2 dias, até o 45º dia.

Experimento 5

Seis ratos fêmeas receberem uma injeção de CFA contendo Mycobacterium butyricum (0,5mg/mL; 50µL) na base da cauda (intradérmica) e outra na articulação TF (intra-articular, 50 µL), após 21 dias. O TEP e DA foram avaliados diariamente até o 27º dia e a cada 2 dias, até o 44º dia.

Análise estatística

O teste de Shapiro-Wilk e o teste de Levene foram aplicados para verificação da normalidade dos dados e homogeneidade das variâncias, respectivamente. O teste t de Student pareado foi utilizado nas comparações entre os valores basais e os obtidos diariamente para o TEP e o edema. Para as análises foi utilizado o programa Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) para Windows^®, versão 19.0, com nível de significância de 5%.

RESULTADOS

Na figura 1, observa-se que a primeira administração (intra-articular) de CFA promoveu aumento do TEP e DA. O pico da curva ocorreu no segundo dia (TEP=27,4±4,23 segundos, 234% dos níveis basais; DA=0,44±0,03cm, 44% dos níveis basais). Posteriormente, houve queda da incapacitação, verificando-se ausência de significância estatística em relação ao nível basal a partir do 5º dia, retornando a 2,02% dos níveis basais no 6º dia (TEP=8,83±0,33 segundos). O DA diminuiu em torno do 7º dia (DA=0,25±0,03cm, 25% acima dos níveis basais), demonstrando tendência a manter tal comportamento. Considerando que uma única administração não foi eficiente para a obtenção de uma artrite persistente, efetuou-se uma segunda administração (intra-articular) de CFA após 8 dias. Após 24 horas do segundo estímulo, houve novo aumento da incapacitação (TEP=36,68±6,06 segundos, 346% dos níveis basais) e do edema (DA=0,45±0,03cm, 45% dos níveis basais). Esses dados evidenciaram a necessidade de duas inoculações para promover algum efeito considerável nos parâmetros TEP e DA. Entretanto, observou-se diminuição nos valores de ambos os parâmetros, perdendo a significância estatística a partir do 13º dia para TEP e no 29º dia para o DA.

A figura 2 mostra os resultados da investigação da via de administração e do intervalo entre inoculações sobre os parâmetros avaliados. A primeira injeção de CFA (intradérmica) alterou significativamente apenas os valores de DA (a partir do 9° dia). Entretanto, a segunda estimulação com CFA (intra-articular) promoveu uma elevação do TEP e DA, cujo máximo foi observado no 22° dia para a incapacitação (TEP=42,70±3,98 segundos, 356% dos níveis basais) e no 23° dia para o edema (DA=0,58±0,03cm, 58% dos níveis basais). Em seguida, verificou-se diminuição progressiva da incapacitação, perdendo significância estatística a partir do 28º dia. Em contrapartida, apesar da diminuição gradativa observada no DA, os valores médios apresentaram diferenças significativas em relação aos níveis basais até o final do experimento. Comparando-se tais resultados com os do experimento anterior, verificou-se que, após a segunda inoculação de CFA, o TEP foi um pouco mais elevado e duradouro. Quanto ao DA, verificou-se que a injeção intradérmica de CFA provocou uma sensibilização dos animais promovendo um aumento significativo do efeito para a segunda inoculação. Com esses dados, padronizaram-se o intervalo (21 dias) e a via de indução de artrite (uma administração intradérmica de CFA seguida de outra intra-articular).

Na figura 3 encontram-se os dados da investigação da articulação mais adequada para indução da artrite crônica. Observou-se que a segunda estimulação com CFA na articulação TT promoveu aumento do TEP e do edema a partir do 22º dia, com valores máximos no 23º dia (TEP=35,58±8,23 segundos, 209% dos níveis basais; edema=1,09±0,13mL, 109% dos níveis basais). Posteriormente, foi verificada uma queda progressiva nos valores do TEP e edema, perdendo significância estatística a partir 37º dia. No entanto, observou-se edema com aspecto necrótico em três animais, que foram sacrificados antes da conclusão do experimento. Comparando-se esses resultados com os obtidos no experimento 2, verificou-se que, para essa micobactéria (Mycobacterium tuberculosis), a articulação TT foi menos adequada, produzindo uma artrite severa, em relação à articulação TF.

A avaliação do efeito da espécie de micobactéria e do gênero dos animais sobre os parâmetros TEP e edema estão ilustrados na figura 4. Nesse experimento, somente após a segunda estimulação com CFA, foi observado aumento significativo do TEP e edema. Esses valores atingiram máximos no 23º dia (TEP=54,8±1,40 segundos, 319% dos níveis basais; edema=1,02±0,05mL, 188% dos níveis basais), reduzindo após o 25° dia. Foi observada perda da significância estatística em relação aos valores basais a partir do 35º dia de experimento para o TEP. Já o edema, apesar de apresentar um decréscimo nos valores, estes permaneceram significativamente acima dos valores basais até o final do experimento (Figuras 4A e 4B). Com o uso de fêmeas e da Mycobacterium butyricum foi possível observar indução de monoartrite duradoura, para a articulação TT, de características menos severas que as observadas no experimento 3.

As figuras 4C e 4D apresentam o resultado da investigação da monoartrite por Mycobacterium butyricum na articulação TF em fêmeas. Verificou-se que a segunda estimulação com CFA promoveu aumento do TEP e do DA. Esses valores atingiram o máximo no 23º dia de experimento (TEP=51,3±6,22 segundos, 467% dos níveis basais; DA=0,53±0,04mL, 53% dos níveis basais), tendo redução iniciada no 24° dia. Entretanto, os valores de ambos os parâmetros apresentaram diferenças significativas em relação aos respectivos valores basais até o final do experimento (44º dia). Tais resultados indicam que a segunda injeção na articulação TF provocou uma artrite duradoura, pois, apesar dos resultados do teste de incapacitação indicarem que a nocicepção reduziu ao longo do estudo, o edema permaneceu estável até o final do experimento.

DISCUSSÃO

Segundo Wauben et al.⁽²²⁾, a dose ideal para indução de artrite severa é de 0,1mL de micobactéria a 10,0mg/mL e, para casos menos severos, 1,0 a 5,0mg/mL. As indicações do volume de adjuvante, da via de administração e da articulação utilizada em ratos variam entre os estudos: Nagakura et al.⁽¹⁷⁾ e Cook e Moore⁽¹²⁾ injetaram 100µL de CFA (5,0mg/mL, Mycobacterium butyricum) intraplantares; Zhang et al.⁽²⁵⁾ utilizaram 100µL de CFA (0,5mg/mL, Mycobacterium tuberculosis) na base da cauda, intradérmicos; Zheng et al.⁽²⁶⁾ empregaram 100µL de adjuvante, (10mg/mL, Mycobacterium tuberculosis), também na base da cauda, intradérmicos; Yu et al.⁽⁴⁾ utilizaram 125µL de CFA (250µg, Mycobacterium butyricum), no joelho; Sharif Naeini et al.⁽¹⁸⁾ injetaram 25µL de CFA (135µg/mL, Mycobacterium butyricum), na articulação do tornozelo. Todos obtiveram indução de artrite por adjuvante satisfatória aos seus propósitos.

Neste estudo, a concentração de CFA, segundo o tipo de micobactéria e o volume injetado, considerou as particularidades do teste de incapacitação articular (deambulação forçada). A indução de uma artrite severa prejudicaria a realização do teste, entretanto, a artrite teve que ser duradoura para permitir a avaliação de um tratamento em futuros estudos.

Inicialmente, verificou-se a necessidade de duas inoculações de CFA intra-articular, para promover efeito considerável nos parâmetros TEP e DA. A literatura evidencia que a administração de 100 e 150µL de CFA (1mg/mL, Mycobacterium tuberculosis) na articulação do joelho causa hiperalgesia e edema por 14 e 90 dias, respectivamente⁽²⁴⁾. Yu et al.⁽⁴⁾ administraram 125µL de CFA (250µg, Mycobacterium butyricum) na articulação do joelho, observando hiperalgesia e edema por 20 a 30 dias. Adicionalmente, Donaldson et al., demonstraram que os efeitos intra-articulares de CFA são dose-dependentes⁽¹⁴⁾. Apesar da diferença na concentração e no volume de administração de CFA em relação ao presente estudo, estes autores não analisaram dor espontânea ao movimento.

O uso de uma injeção de CFA (Mycobacterium tuberculosis) na base da cauda (intradérmica), foi baseada nos achados de Wauben et al.⁽²²⁾, que sugerem esta como a via preferencial de imunização. Porém, esta não promoveu sinais significativos de dor e edema. Somente após a segunda injeção de CFA, na articulação TF, verificou-se um TEP um pouco mais duradouro e o DA elevado. Por outro lado, na articulação TT, houve edema com aspecto necrótico na pata. Portanto, a injeção de CFA Mycobacterium tuberculosis na articulação TT foi menos adequada em relação à articulação TF, por ter produzido uma artrite muito severa. Cai et al.⁽¹¹⁾ e Zheng et al.⁽²⁶⁾ induziram artrite por uma única injeção intradérmica de 100µL de CFA (5,0mg/mL, Mycobacterium tuberculosis), na base da cauda de ratos Lewis. Contudo, esses autores não descreveram detalhadamente as técnicas de manipulação e doses de Mycobacterium tuberculosis que influenciaram na indução e na gravidade da indução da artrite^(11,26).

Os resultados obtidos para verificar o efeito da espécie de micobactéria e do gênero dos animais sobre os parâmetros estudados demonstraram novamente aumento significativo do TEP e edema somente após a segunda estimulação, em ambas as articulações. Banik et al.⁽²⁸⁾ demonstraram que os sinais inflamatórios e artríticos, após injeção de Mycobacterium butyricum na base da cauda, apareceram forma mais precoce, severa e consistente em ratos Lewis. No entanto, Costa et al.⁽¹³⁾ realizaram uma indução de artrite com injeção de 50µL de CFA (5mg/mL, Mycobacterium butyricum) na base da cauda de ratos Wistar, observando edema por 25 dias na articulação TT. Resultados similares de hiperalgesia e edema foram encontrados por Sharif Naeini et al.⁽¹⁸⁾, após injeção de 25µL de CFA, contendo 135µg/mL de Mycobacterium butyricum, na articulação TT⁽¹⁸⁾.

Com o uso de fêmeas e da Mycobacterium butyricum foi possível observar a indução de uma monoartrite duradoura, para as articulações TT e TF, com características menos severas que as observadas com a Mycobacterium tuberculosis e com o uso de machos. A influência do gênero tem sido reportada em alguns estudos para algumas raças de ratos, porém não há restrição significante do gênero na suscetibilidade da artrite^(11,22).

Em relação ao número de inoculações, Buttler et al.⁽¹⁰⁾ administraram seis injeções de CFA (300mg/0,05mL, Mycobacterium butyricum) na articulação TT, sugerindo esse modelo para estudos de artrite crônica e reforçando a necessidade de realização de mais de uma inoculação com CFA para o desenvolvimento de estudos a longo prazo. Entretanto, foram suficientes duas doses de CFA (Mycobacterium butyricum) para aumentar o TEP e o edema de forma persistente, em ambas as articulações estudadas. Esses dados possibilitaram a padronização de um modelo animal de artrite induzida por CFA, adequado à análise do efeito da deambulação na nocicepção e no edema articular, permitindo o desenvolvimento de futuros estudos na avaliação do exercício no tratamento da AR.

CONCLUSÃO

Com base nos resultados obtidos, observou-se que o modelo de indução de artrite por CFA adequado à análise do efeito da deambulação na nocicepção e no edema articular apresenta as seguintes características: duas inoculações de CFA contendo Mycobabterium butyricum, sendo a primeira injeção intradérmica e realizada na base da cauda 21 dias antes da segunda, esta intra-articular, na articulação TF ou TB, tanto em ratos Wistar machos quanto em fêmeas. Considerando que os testes de incapacitação articular e de medição de edema são importantes na avaliação da efetividade do exercício como tratamento da artrite, a padronização do modelo adequado a essas análises são relevantes aos nossos propósitos. Conclui-se que este modelo animal de indução de artrite é adequado para o estudo em deambulação, permitindo o desenvolvimento de futuros estudos para a avaliação do exercício no tratamento da AR.

Data de submissão: 27/6/2012

Data de aceite: 16/11/2012

Conflito de interesse: não há.

Estudo realizado na Universidade do Estado de Santa Catarina, Florianópolis, SC, Brasil.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  09 Abr 2013
• Data do Fascículo
  Mar 2013

Histórico

• Recebido
  27 Jun 2012
• Aceito
  16 Nov 2012