Colonização oral por espécies de Candida em pacientes HIV positivo: estudo de associação e suscetibilidade antifúngica

RESUMO

Objetivo

Investigar a suscetibilidade a antifúngicos e os fatores associados à colonização oral por espécies de Candida isoladas de pacientes HIV positivo.

Métodos

Estudo prospectivo realizado com amostragem por conveniência de indivíduos HIV positivo, acompanhados por um serviço de atendimento especializado da cidade de Rondonópolis, Mato Grosso, Brasil. Foram coletados swabs orais de 197 pacientes. As espécies de Candida foram identificadas por técnicas microbiológicas fenotípicas padrão e por método molecular. A suscetibilidade antifúngica foi determinada pelo método de microdiluição em caldo.

Resultados

Cento e um (51,3%) pacientes foram colonizados por Candida spp. Candida albicans foi a espécie mais prevalente (80%). Identificou-se um maior risco de colonização oral por espécies de Candida em pacientes com idade entre 45 e 59 anos (razão de prevalência: 1,90; IC95%: 1,57-6,31) e 60 anos ou mais (razão de prevalência: 4,43; IC95%: 1,57-34,18). A resistência ao fluconazol e ao cetoconazol foi de 1% cada e de 4% ao itraconazol.

Conclusão

O único fator associado à colonização oral por espécies de Candida foi ter 45 anos ou mais. Identificamos baixa taxa de resistência antifúngica aos azóis entre as leveduras isoladas de pacientes HIV positivo. Estes achados podem contribuir para selecionar o tratamento da candidíase oral em pacientes HIV positivos.

Candida; Candidíase bucal; HIV; Testes de sensibilidade microbiana; Antifúngicos

ABSTRACT

Objective

To investigate antifungal susceptibility and factors associated with oral colonization by Candida species in HIV-positive patients.

Methods

A prospective study based on convenience sampling of subjects recruited from a pool of confirmed HIV-positive individuals seen at a specialty outpatient service in Rondonópolis, Mato Grosso, Brazil). Oral swabs were collected from 197 patients. Candida species were identified by standard microbiological techniques (phenotypic and molecular methods). Antifungal susceptibility was investigated using the broth microdilution method.

Results

A total of 101 (51.3%) patients were Candida spp carriers. Candida albicans was the most prevalent species (80%). Patients aged 45 to 59 years (Prevalence ratios: 1.90; 95%CI: 1.57-6.31) and 60 years or older (Prevalence ratios: 4.43; 95%CI: 1.57-34.18) were at higher risk of oral colonization by Candida species. Resistance to fluconazole and ketoconazole, or to itraconazole, corresponded to 1% and 4%, respectively.

Conclusion

Age (45 years or older) was the only factor associated with oral colonization by Candida . Low rates of antifungal resistance to azoles were detected in yeast isolates obtained from HIV-positive patients. Findings of this study may contribute to proper therapeutic selection for oral candidiasis in HIV-positive patients.

Candida; Candidiasis, oral; HIV; Microbial sensitivity tests; Antifungal agents

INTRODUÇÃO

Nos últimos cinco anos, o Brasil registrou uma média de 40,6 mil casos de síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) por ano.⁽¹⁾A AIDS é causada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), sendo caracterizada por uma redução nas células T CD4, o que torna os pacientes mais propensos a infecções oportunistas decorrentes da alteração na resposta imunológica.⁽²⁾A ocorrência de lesões específicas na cavidade oral tem desempenhado um papel importante no diagnóstico e no monitoramento da progressão da doença.⁽³⁾

A candidíase orofaríngea é um dos primeiros sinais clínicos da AIDS e acomete 50 a 95% dos indivíduos infectados pelo vírus HIV.⁽⁴⁾As espécies de Candida colonizam a mucosa oral, porém, na presença de fatores predisponentes à levedura, podem se tornar patogênicas e causarem infecção.⁽⁵⁾Vários fatores predispõem à candidíase oral, como extremos de idade, uso de próteses dentárias, tabagismo, alterações salivares, hormonais, nutricionais e imunológicas.⁽⁶⁾As manifestações bucais da candidíase incluem pseudomembranosa, eritematosa, hiperplásica, mucocutânea e queilite angular.⁽⁷⁾ Candida albicans é responsável pela maioria dos episódios de candidíase oral, no entanto, outras espécies, como Candida glabrata , Candida krusei , Candida tropicalis , Candida parapsilosis e Candida dubliniensis , têm sido frequentemente implicadas com a doença.⁽⁸⁾

A resistência intrínseca à terapia antifúngica observada em algumas espécies de Candida , juntamente do desenvolvimento de resistência adquirida durante o tratamento, tem dificultado o manejo da candidíase oral.⁽⁹⁾Neste sentido, duas organizações, o European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) e o Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), padronizaram métodos para realização de testes de suscetibilidade aos antifúngicos.⁽¹⁰⁾Estes testes desempenham um papel cada vez mais importante na orientação da tomada de decisão terapêutica, auxiliando nos estudos de desenvolvimento de fármacos e como meio de acompanhar o desenvolvimento da resistência antifúngica em estudos epidemiológicos.^(9,11)

OBJETIVO

Investigar a suscetibilidade a antifúngicos e os fatores associados à colonização oral por espécies de Candida isoladas de pacientes HIV positivo.

MÉTODOS

Foi realizado um estudo prospectivo com indivíduos HIV positivo, acompanhados pelo serviço de atendimento especializado da Secretaria Municipal de Saúde da cidade de Rondonópolis, Mato Grosso, Brasil. Os participantes foram recrutados em uma amostra de conveniência no período de janeiro a maio de 2015, durante suas consultas de rotina no serviço de saúde, sendo informados sobre os objetivos, riscos e benefícios do estudo, quando assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Júlio Muller da Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), parecer 749.382, CAAE: 31905114.6.0000.5541. Pacientes com idade inferior a 18 anos foram excluídos do estudo. As informações sobre idade, sexo, uso de agentes antirretrovirais, história de infecções oportunistas, outras infecções sexualmente transmissíveis, uso de drogas intravenosas e contagem de linfócitos T CD4 foram coletadas dos prontuários médicos dos pesquisados.

Isolamento e identificação das leveduras

Foram coletados swabs orais dos pacientes HIV positivo, o material foi semeado em ágar Sabouraud Dextrose (Difco, Detroit, EUA) suplementado com cloranfenicol (100μg/mL) e em ágar cromogênico CHROMagar Candida (PROBAC, São Paulo, Brasil), incubado a 37°C por 48 a 72 horas. A espécie das leveduras foi confirmada pelo método de reação em cadeia da polimerase espécie-específica baseada no protocolo previamente descrito por Liguori et al.⁽¹²⁾O DNA foi extraído com um kit de extração de DNA (Mobio, Carlsbad, CA, EUA), conforme as instruções do fabricante. Polymerase chain reaction foi realizada em volume de reação total de 25μL, contendo Tris-HCl 10mM (pH 8,3), KCl 50mM, MgCl2 1,5mM, 0,38mM de desoxirribonucleotídeos trifosfato (0,2mM cada), primers 3,2mM, e TaqDNA polimerase 1,25U. Os oligonucleotídeos foram CA ( C. albicans , 5’- TCA ACT TGTCAC AGA TTA TT-3 ‘), CGLA ( C. glabrata , 5’- CAC GAC TCGACA CTT TCT AAT T-3’), CT ( C. tropicalis , 5’-AAG AAT TTAACG TGG AAA CTT A-3 ‘), CK ( C. krusei , 5’- GAT TTA GTA CTACAC TGC GTC A-3’) e ITS4 (5’- TCC TCCGCT TAT TGA TAT GC-3’). As reações de amplificações foram sob a seguinte condição: desnaturação inicial (92°C, 2 minutos); 35 ciclos de desnaturação (95°C, 1 minuto); anelamento (50°C, 1 minuto); extensão (72°C, 1 minuto); e extensão final (72°C, 10 minutos).

Teste de suscetibilidade a antifúngicos

A sensibilidade antifúngica dos isolados foi determinada pelo método de microdiluição em caldo, de acordo com o protocolo M27-A3 do CLSI.⁽¹³⁾Os agentes antifúngicos foram diluídos no meio RPMI-1640 (Sigma ChemicalCo., EUA) tamponado a pH 7,0, com MOPS (Sigma Chemical Co., EUA). Os fármacos foram distribuídos em microplacas de 96 poços a uma concentração final de 0,03 a 16 μ g/mL para itraconazol e cetoconazol e de 0,125 a 64 μ g/mL para fluconazol. As placas de microdiluição foram incubadas a 35°C e examinadas visualmente após 24 e 48 horas para determinar os valores de concentração inibitória mínima (CIM). A CIM foi definida como a menor concentração capaz de inibir ≥50% do crescimento fúngico em comparação ao controle positivo. Os resultados foram expressos em termos de variação de CIM, CIM50 e CIM90, sendo considerada a concentração capaz de inibir 50 e 90% dos isolados, respectivamente.

Com base nas diretrizes do documento M27-S4 do CLSI,⁽¹⁴⁾os valores de corte epidemiológico para fluconazol em C. albicans e C. tropicalis são: CIM ≤2μg/mL considerada sensível; ≥8μg/mL, resistente; e 4μg/mL, sensível dose-dependente (SDD); para C. glabrata , CIM ≤32μg/mL SDD e ≥64μg/mL resistente. Os isolados de C. krusei são considerados intrinsecamente resistentes ao fluconazol e seus CIMs não devem ser interpretados usando esta escala. Para o itraconazol, os valores de referência em espécies de Candida são CIM ≤0,125μg/mL sensível, ≥1μg/mL resistente e 0,25 a 0,5μg/mL SDD.⁽¹⁵⁾Os valores de referência para o cetoconazol não são descritos pelo CLSI, tendo sido adotado o parâmetro proposto por Mulu et al.,⁽¹⁵⁾que consideram resistente ≥4μg/mL.

Análise dos dados

Foi aplicado um modelo de regressão logística para análise multivariada, a fim de se identificar os fatores associados à colonização oral por espécies de Candida . Foram calculados razão de prevalência (RP), intervalo de confiança de 95% (IC95%) e valor de p para cada fator, adotando-se um nível de significância de 5%. As análises foram realizadas utilizando o software R.

RESULTADOS

Foram incluídos no estudo 197 pacientes infectados pelo vírus HIV (99 homens) com idade entre 19 e 78 anos. A média de idade foi 42,1 anos. A tabela 1 apresenta as características sociodemográficas e clínicas dos participantes da pesquisa. A maioria (n=193, 98%) dos pacientes foi tratada com terapia antirretroviral altamente ativa (HAART), e o tempo médio de tratamento foi de cinco anos. O regime antirretroviral mais frequente (52,8%) foi de inibidor nucleosídeo da transcriptase reversa associado a um inibidor não nucleosídeo da transcriptase reversa. A análise do histórico clínico revelou 78 (39,6%) casos de infecções oportunistas, sendo a candidíase a mais frequente (11,2%), seguida de herpes-zóster (10,6%). Foram identificados 17,8% de pacientes com diagnóstico de outra infecção sexualmente transmissível. Dentre os indivíduos, 14% faziam uso de drogas intravenosas. A média das contagens de células T CD4 para todos os pesquisados foi de 663 células/mm³e variou de 16 a 2.299 células/mm³.

Tabela 1
Características demográficas e clínicas de pacientes HIV positivo

Características	Colonização
	Positiva (n=101) n (%)	Negativa (n=96) n (%)
Sexo
Masculino	42 (41,6)	57 (59,3)
Feminino	59 (58,4)	39 (40,7)
Idade, anos
19-29	17 (16,8)	15 (15,6)
30-44	43 (42,6)	46 (46,9)
45-59	30 (29,7)	32 (33,4)
≥60	11 (10,9)	3 (3,1)
Regime antiviral
IP+ITRN	47 (46,5)	41 (42,7)
ITRN+ITRNN	49 (48,5)	55 (57,3)
Duração da terapia antiviral, anos
0-5	57 (56,4)	47 (49)
6-11	30 (29,7)	29 (30,2)
≥12	14 (13,9)	20 (20,8)
Histórico de infecção oportunista	40 (39,6)	38 (39,6)
Outra infecção sexualmente transmissível	17 (16,8)	18 (18,7)
Uso de drogas intravenosas	16 (10,9)	11 (11,5)
Linfócitos T CD4 (células/mm3)
<200	14 (13,9)	8 (8,3)
200-700	50 (49,5)	49 (51)
>700	37 (36,6)	39 (40,7)

• IP: inibidor de protease; ITRN: inibidores da transcriptase reversa análogos de nucleosídeos; ITRNN: inibidores da transcriptase reversa não análogos de nucleosídeos.

A colonização oral por espécies de Candida foi detectada em 51,3% dos pacientes. C. albicans foi a espécie mais frequente (80%), seguida de C. glabrata (14%), C. tropicalis (4%) e C. krusei (2%).

Os resultados da regressão logística são apresentados na tabela 2 . Não houve diferença estatística significativa entre os grupos de pacientes colonizados e não colonizados por leveduras quanto a sexo (p=0,3760), duração da terapia antiviral (p=0,6820), regimes antivirais (p=0,405), história de infecção oportunista (p=0,392), outras infecções sexualmente transmissíveis (p=0,718) e uso de drogas intravenosas (p=0,413). Não encontramos correlação entre contagem de linfócitos T CD4 e presença de espécies de Candida na cavidade oral de pacientes HIV positivo. A idade foi o único fator de risco relacionado à colonização oral por Candida spp., este risco aumentou com a idade, sendo identificado nos pacientes com idade entre 45 e 59 anos (RP: 1,90; IC95%: 1,57-6,31) e 60 anos ou mais (RP: 4,43; IC95%: 1,57-34,18).

Tabela 2
Razões de prevalência para colonização oral por espécies de Candida

Fatores	RP	IC95%	Valor de p*
Sexo
Masculino		1 (referência)	0,3760
Feminino	1,43	0,65-3,13
Idade, anos
19-29		1 (referência)	0,0273
30-44	1,04	0,36-2,97
45-59	1,90	1,57-6,31
≥60	4,43	1,57-34,18
Regime antiviral
IP+ITRN		1 (referência)	0,405
ITRN+ITRNN	0,73	0,35 - 1,53
Duração da terapia antiviral, anos
0-5		1 (referência)	0,6820
6-11	0,89	0,37-2,12
≥12	0,61	0,2-1,84
Histórico de infecção oportunista	0,72	0,34-1,53	0,392
Outra infecção sexualmente transmissível	1,19	0,47-2,98	0,718
Uso de drogas intravenosas	0,60	0,18-2,05	0,413
Linfócitos T CD4 (celulas/mm3)
<200		1 (referência)	0,718
200-700	0,6	0,17-2,09
>700	0,68	0,18-2,48

• * Regressão logística. IC95%: intervalo de confiança de 95%; RP: razão de prevalência; IP: inibidor de protease; ITRN: inibidores da transcriptase reversa análogos de nucleosídeos; ITRNN: inibidores da transcriptase reversa não-análogos de nucleosídeos.

Os testes de sensibilidade ao fluconazol revelaram que 84% dos isolados de Candida spp. foram sensíveis, 15% SDD e 1% resistentes. Nos ensaios com cetoconazol, 99% das leveduras foram classificadas como sensíveis e 1% resistentes. Uma frequência de 73% das linhagens foi sensível, 23% SDD e 4% resistente ao itraconazol. Um isolado de C. albicans foi resistente ao fluconazol, um isolado de C. tropicalis foi resistente ao cetoconazol e quatro isolados foram resistentes ao itraconazol, sendo duas C. glabrata , uma C. albicans e uma C. tropicalis. Os valores de CIM50 para fluconazol, cetoconazol e itraconazol foram 0,5, 0,03 e 0,125μg/mL, e de CIM90 foram 0,5, 0,03 e 0,5μg/mL, respectivamente ( Tabela 3 ).

Tabela 3
Suscetibilidade a antifúngicos de espécies de Candida isoladas de pacientes HIV positivo

Espécie (n)	Antifúngico	Variação de CIM	CIM50	CIM90	Sensível	SDD	Resistente
		(µg/mL)	(µg/mL)	(µg/mL)	n (%)	n (%)	n (%)
Candida albicans (n=81)	Fluconazol	0,125-8	0,125	0,125	79 (98)	1 (1)	1 (1)
	Cetoconazol	0,03-2	0,03	0,03	81 (100)	0 (0)	0 (0)
	Itraconazol	0,03-4	0,125	0,5	65 (81)	15 (18)	1 (1)
Candida glabrata (n=14)	Fluconazol	0,25-4	0,5	2	0 (0)	14 (100)	0 (0)
	Cetoconazol	0,03-0,5	0,03	0,5	14 (100)	0 (0)	0 (0)
	Itraconazol	0,06-2	0,125	2	7 (50)	5 (36)	2 (14)
Candida tropicalis (n=4)	Fluconazol	0,125-0,5	0,125	0,125	4 (100)	0 (0)	0 (0)
	Cetoconazol	0,03-16	0,06	0,125	3 (75)	0 (0)	1 (25)
	Itraconazol	0,03-16	0,25	0,5	1 (25)	2 (50)	1 (25)
Candida krusei (n=2)	Fluconazol	0,25	0,25	0,25	-	-	-
	Cetoconazol	0,03	0,03	0,03	2 (100)	0 (0)	0 (0)
	Itraconazol	0,125	0,125	0,125	1 (100)	1 (100)	0 (0)
Total (n=101)	Fluconazol	0,125-8	0,125	0,5	83 (84)	15 (15)	1 (1)
	Cetoconazol	0,03-16	0,03	0,03	100 (99)	0 (0)	1 (1)
	Itraconazol	0,03-16	0,125	0,5	74 (73)	23 (23)	4 (4)

• CIM: concentração inibitória mínima; SDD: sensível dose-dependente.

DISCUSSÃO

A colonização oral por espécies de Candida é um evento frequente em pacientes HIV positivo.⁽¹⁶⁾Na presente pesquisa, 51,3% dos pacientes estavam colonizados pela levedura. Estes dados são semelhantes aos estudos realizados na China (49,5%),⁽¹⁷⁾no Brasil (50,4%),⁽¹⁸⁾em Taiwan (51,4%)⁽¹⁹⁾e na Nigéria (52,5%).⁽²⁰⁾A identificação de portadores assintomáticos de Candida spp. reveste-se de importância em estudos epidemiológicos, pois possibilitam conhecer as espécies prevalentes, podendo contribuir com o direcionamento da terapêutica, mas não se recomenda a pesquisa de colonização oral na prática médica de rotina, pois não traria impacto para a clínica, além de gerar custos desnecessários.

C. albicans foi a espécie predominante (80%) e C. glabrata foi a espécie não albicans mais frequente entre os pacientes estudados. Outros inquéritos também evidenciaram a prevalência destes microrganismos na mucosa oral de pacientes com HIV/AIDS.^(18,21,22) C. albicans é a espécie mais comumente isolada da mucosa oral de indivíduos HIV positivo, com frequências variando de 70 a 82,1%.^(23-26) C. glabrata emergiu como importante patógeno, sobretudo na mucosa oral, quer como um agente coinfectante com C. albicans ou como única espécie isolada de lesões orais. As infecções orofaríngeas associadas a C. glabrata tendem a ser mais graves e mais difíceis de tratar do que as candidíases associadas exclusivamente a C. albicans .^{(17,21,22,27)}

Analisamos os fatores que poderiam influenciar na colonização oral por Candida spp . em pacientes com infecção pelo vírus HIV. Nosso estudo demonstrou que houve maior risco de colonização pela levedura em pacientes com 45 anos ou mais, e que esse risco aumenta com a idade. Esebelahie et al.,⁽²⁰⁾também identificaram que a colonização oral por Candida spp. em pacientes HIV em HAART aumenta com a idade, sendo mais prevalente na faixa etária de 61 a 70 anos. Kantheti et al.,⁽²⁸⁾demonstraram correlação entre a presença de Candida na cavidade oral de indivíduos HIV positivo e idade, estando esse risco presente no grupo de indivíduos que não fazem uso de HAART com 41 a 50 anos e entre as pessoas sob HAART de 51 a 60 anos. Entre os pacientes de meia-idade e idosos, há maior uso de próteses dentárias, o que pode justificar o maior risco de colonização e infecção por Candida spp. nesta faixa etária.⁽¹⁷⁾

Os antivirais inibidores da protease revolucionaram o tratamento da AIDS, reduzindo as infecções oportunistas, especialmente a candidíase.⁽²⁹⁾A atenuação das infecções pode resultar não apenas da melhoria do estado imunológico, mas também como consequência da inibição direta de aspartil proteases de Candida spp.⁽³⁰⁾Os inibidores da protease inibem a expressão de aspartil proteases in vivo e selecionam biotipos fúngicos, afetando a prevalência e a sensibilidade a antifúngicos em Candida spp.⁽³¹⁾Nesta pesquisa, não encontramos correlação significativa entre o status de portador de espécies de Candida e terapia antirretroviral com inibidores da protease, corroborando outros estudos.^{(17,26,32,33)}

Os resultados deste estudo demonstraram que as contagens de linfócitos T CD4 não influenciaram na ocorrência de levedura na mucosa oral. Este resultado é confirmado por outros autores que relataram que a média da contagem de linfócitos T CD4 para os indivíduos HIV positivo não diferiu entre aqueles com levedura na cavidade oral e os pacientes em que o fungo não foi detectado.^{(16,20,32,34)}No entanto, algumas pesquisas evidenciaram que uma contagem de linfócitos T CD4 inferior a 200 células/mL pode ser fator de risco para colonização por Candida spp.^(19,26,27)

Os testes de suscetibilidade a antifúngicos permitem determinar o melhor tratamento para cada microrganismo e contribuem para o conhecimento da epidemiologia local e global das resistências fúngicas.⁽¹²⁾Por meio dos testes de microdiluição em caldo, identificamos baixa frequência de isolados orais de Candida spp resistentes a fluconazol (1%), cetoconazol (1%) e itraconazol (4%). Achados semelhantes foram relatados por outros autores, que identificaram um pequeno percentual de leveduras resistentes ao fluconazol (0,7%),⁽³²⁾cetoconazol (1,5%)⁽³⁵⁾e itraconazol (4,7%).⁽¹⁵⁾Entre os azólicos testados, a maior frequência de resistência foi observada contra o itraconazol. Este dado é similar ao de estudos prévios.^(17,35,36)A resistência de espécies de Candida aos compostos azólicos tem sido frequentemente atribuída a uma pressão seletiva causada por agentes antifúngicos, devido à exposição a vários cursos de terapias de supressão a curto ou longo prazo em pacientes com candidíase oral.⁽¹⁵⁾O tratamento da candidíase oral ainda é um desafio; por isto, estudos de suscetibilidade antifúngica devem ser realizados, quando possível, antes que a terapia antifúngica seja iniciada.⁽⁷⁾

CONCLUSÃO

Candida albicans foi a espécie mais prevalente na mucosa oral de pacientes HIV positivo. Os indivíduos na faixa etária a partir dos 45 anos apresentaram maior risco de colonização oral por espécies de Candida . A maioria dos isolados foi sensível aos antifúngicos azólicos. Esses achados destacam a importância da identificação precisa e correta das espécies de Candida pelas abordagens moleculares e oferecem informações úteis para a seleção de fármacos para o tratamento de pacientes com candidíase oral.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  06 Ago 2018
• Data do Fascículo
  2018

Histórico

• Recebido
  19 Set 2017
• Aceito
  25 Jan 2018