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Engenharia de tecidos cardíacos: atual estado da arte a respeito de materiais, células e formação tecidual

RESUMO

Doenças cardiovasculares são responsáveis pelo maior número de mortes no mundo. O coração possui capacidade de regeneração limitada, e o transplante, por consequência, representa a única solução em alguns casos, apresentando várias desvantagens. A engenharia de tecidos tem sido considerada a estratégia ideal para a medicina cardíaca regenerativa. Trata-se de uma área interdisciplinar, que combina muitas técnicas as quais buscam manter, regenerar ou substituir um tecido ou órgão. A abordagem principal da engenharia de tecidos cardíacos é criar enxertos cardíacos, sejam substitutos do coração inteiro ou de tecidos que podem ser implantados de forma eficiente no organismo, regenerando o tecido e dando origem a um coração completamente funcional, sem desencadear efeitos colaterais, como imunogenicidade. Nesta revisão, apresentase e compara-se sistematicamente as técnicas que ganharam mais atenção nesta área e que geralmente focam em quatro assuntos importantes: seleção do material a ser utilizado como enxerto, produção do material, seleção das células e cultura de células in vitro. Muitos estudos, fazendo uso de várias das técnicas aqui apresentadas, incluindo biopolímeros, descelularização e biorreatores, têm apresentado avanços significativos, seja para obter um enxerto ou um coração bioartifical inteiro. No entanto, ainda resta um grande esforço para entender e melhorar as técnicas existentes, para desenvolver métodos robustos, eficientes e eficazes.

Descritores:
Biopolímeros; Reatores biológicos; Transplante de coração; Cardiomioplastia; Doenças cardiovasculares; Engenharia tecidual

ABSTRACT

Cardiovascular diseases are the major cause of death worldwide. The heart has limited capacity of regeneration, therefore, transplantation is the only solution in some cases despite presenting many disadvantages. Tissue engineering has been considered the ideal strategy for regenerative medicine in cardiology. It is an interdisciplinary field combining many techniques that aim to maintain, regenerate or replace a tissue or organ. The main approach of cardiac tissue engineering is to create cardiac grafts, either whole heart substitutes or tissues that can be efficiently implanted in the organism, regenerating the tissue and giving rise to a fully functional heart, without causing side effects, such as immunogenicity. In this review, we systematically present and compare the techniques that have drawn the most attention in this field and that generally have focused on four important issues: the scaffold material selection, the scaffold material production, cellular selection and in vitro cell culture. Many studies used several techniques that are herein presented, including biopolymers, decellularization and bioreactors, and made significant advances, either seeking a graft or an entire bioartificial heart. However, much work remains to better understand and improve existing techniques, to develop robust, efficient and efficacious methods.

Keywords:
Biopolymers; Bioreactors; Heart transplantation; Cardiomyoplasty; Cardiovascular diseases; Tissue engineering

INTRODUÇÃO

As doenças cardiovasculares são a principal causa de morte no mundo. Em 2015, a Organização Mundial da Saúde (OMS) estimou que 17,7 milhões de pessoas morreram devido a doenças cardiovasculares, o que representou 31% das mortes no mundo.(11. World Health Organization (WHO). World Health Statistics 2017: monitoring health for the SDGs [Internet]. Geneva: WHO; 2017 [cited 2018 May 7]. Available from: http://www.who.int/gho/publications/world_health_statistics/2017/en/
http://www.who.int/gho/publications/worl...
) Uma doença relevante neste cenário é o infarto agudo do miocárdio, resultado do transporte insuficiente de sangue para o coração, causado principalmente por doença coronariana. O infarto do miocárdio leva a remodelamento ventricular, fibrose, necrose, insuficiência cardíaca, entre outros, o que pode causar disfunção cardíaca parcial ou total.(22. See F Kompa A, Martin J, Lewis DA, Krum H. Fibrosis as a therapeutic target post-myocardial infarction. Curr Pharm Des. 2005;11(4):477-87. Review.) Considerando as inúmeras desvantagens do transplante cardíaco, que ainda é a melhor opção para pacientes com insuficiência cardíaca em estágio terminal,(33. Mangini S, Alves BR, Silvestre OM, Pires PV, Pires LJ, Curiati MN, et al. Heart transplantation: review. einstein (São Paulo). 2015;13(2):310-8. Review.) bem como as habilidades regenerativas restritas dos cardiomiócitos para curar o coração após infarto agudo do miocárdio,(44. Papadaki M, Bursac N, Langer R, Merok J, Vunjak-Novakovic G, Freed LE. Tissue engineering of functional cardiac muscle: molecular, structural, and electrophysiological studies. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2001;280(1): H168-78.) muitos estudos têm sido realizados em Medicina Regenerativa, criando alternativas para a regeneração miocárdica por meio da engenharia de tecidos.

A engenharia de tecidos é um conjunto de técnicas biomédicas, biotecnológicas e de engenharia, que visa manter, regenerar ou substituir tecidos ou órgãos. Os avanços na engenharia de tecidos são evidentes, e a aplicação desta tecnologia à regeneração do miocárdio tem sido cada vez mais explorada, apresentando resultados encorajadores. A principal abordagem deste campo científico é a criação de scaffolds, que contêm células que podem ser aplicadas como enxertos cardíacos no organismo, para obter a recuperação desejada.

Esta revisão apresenta brevemente as técnicas mais amplamente utilizadas na engenharia de tecidos cardíaca, abrangendo duas décadas: final da década de 1990, quando esta aplicação de engenharia de tecidos viu seus primeiros estudos, até os dias atuais, quando se buscam obter enxertos com amplo potencial de regeneração cardíaca.

ENXERTOS CARDÍACOS

As técnicas utilizadas para obter enxertos cardíacos focam em quatro pontos importantes (Figura 1): (1) seleção do material para o scaffold; (2) produção do material para o scaffold; (3) seleção das células; e (4) cultura celular in vitro.

Figura 1
Técnicas de engenharia de enxerto cardíaco

Seleção do material para o scaffold

Os biomateriais têm sido o foco para utilização em engenharia de tecidos, como biomateriais tradicionais ou desenvolvendo variantes específicas para a engenharia de tecidos. Eles são capazes de interagir positivamente com sistemas biológicos e, dessa forma, busca-se melhorar a regeneração do tecido danificado ou efetivamente substituí-lo.

Uma das classes mais importantes de biomateriais é a dos polímeros, disponíveis em diferentes composições e propriedades. Trata-se dos biomateriais mais utilizados para regeneração cardíaca. Esta classe de materiais pode ser dividida em sintética e natural, além de materiais combinados sintéticos/naturais.(55. Chen QZ, Harding SE, All NN, Lyon AR, Boccaccini AR. Biomaterials in cardiac tissue engineering: ten years of research survey. Mater Sci Eng Rep. 2008; 59(1-6):1-37.)

Alguns biopolímeros sintéticos utilizados para a engenharia do tecido miocárdico incluem o ácido poliglicólico (PGA),(66. Bursac N, Papadaki M, Cohen RJ, Schoen FJ, Eisenberg SR, Carrier R, et al. Cardiac muscle tissue engineering: toward an in vitro model for electrophysiological studies. Am J Physiol. 1999;277(2 Pt 2):H433-44.) ácido poli-L-lático (PLLA), ácido glicólico polilático (PLGA) e poliuretano. Esta revisão aborda a aplicação do poliuretano na engenharia de tecidos cardíaca, tendo em vista que é um dos biopolímeros mais utilizados.

Há uma diversidade de aplicações biomédicas para poliuretano, desde dispositivos duráveis até scaffolds biodegradáveis.(77. Gabriel LP Rodrigues AA, Macedo M, Jardini AL, Maciel Filho R. Electrospun polyurethane membranes for Tissue Engineering applications. Mater Sci Eng C. 2017;72:113-7.,88. Gabriel LP, Rodrigues AA, Jardini AL, Maciel Filho R. From biodegradable to long-term polyurethanes: in vitro fibroblasts adhesion and degradation study of electrospun polyurethane membranes. Int J Eng Res Appl. 2016;6(7):13-9.) Levando em conta a boa compatibilidade tecidual e sanguínea, a adesão celular e as propriedades de ductilidade,(99. Bos GW, Poot AA, Beugeling T, van Aken WG, Feijen J. Small-diameter vascular graft prostheses: current status. Arch Physiol Biochem. 1998;106(2):100-15. Review.) o poliuretano têm sido investigado como alternativa para enxertos vasculares(1010. Zhang Z, King MW, Marois Y Marois M, Guidoin R. In vivo performance of the polyesterurethane Vascugraft prosthesis implanted as a thoraco-abdominal bypass in dogs: an exploratory study. Biomaterials. 1994;15(13):1099-112.) e outros dispositivos médicos. No entanto, a bioestabilidade a longo prazo provou ser um obstáculo para este tipo de aplicação.(1010. Zhang Z, King MW, Marois Y Marois M, Guidoin R. In vivo performance of the polyesterurethane Vascugraft prosthesis implanted as a thoraco-abdominal bypass in dogs: an exploratory study. Biomaterials. 1994;15(13):1099-112.)

Por outro lado, as estratégias cardíacas de engenharia de tecidos se concentram em scaffolds de polímero temporários, com taxas de degradação ajustáveis, boa porosidade, biocompatibilidade e propriedades elastoméricas, que podem favorecer mecanicamente a contração do tecido inerente à função cardíaca. Estas propriedades são encontradas em scaffolds à base de poliuretano(1111. McDevitt TC, Woodhouse KA, Hauschka SD, Murry CE, Stayton PS. Spatially organized layers of cardiomyocytes on biodegradable polyurethane films for myocardial repair. J Biomed Mater Res A. 2003;66(3):586-95.) (Figura 2). Diferentes técnicas utilizando poliuretano foram investigadas, demonstrando as variadas possibilidades e a versatilidade do poliuretano como material para scaffolds porosos na regeneração miocárdica. Fujimoto et al., publicaram estudo bem-sucedido em animais usando um patch cardíaco biodegradável, poroso, de poliuretano, que levou a um fenótipo de formação de tecido muscular liso e contrátil, e melhorou o remodelamento cardíaco e a função contrátil na fase crônica.(1212. Fujimoto KL, Tobita K, Merryman WD, Guan J, Momoi N, Stolz DB, et al. An elastic, biodegradable cardiac patch induces contractile smooth muscle and improves cardiac remodeling and function in subacute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 2007;49(23):2292-300.) Baheiraei et al,. demonstraram a síntese de um novo poliuretano condutor biodegradável contendo oligoanilina como polímero condutor eletroativo em experimentos de cultura celular.(1313. Baheiraei N, Yeganeh H, Ai J, Gharibi R, Azami M, Faghihi F Synthesis, characterization and antioxidant activity of a novel electroactive and biodegradable polyurethane for cardiac tissue engineering application. Mater Sci Eng C. 2014;44:24-37.)

Figura 2
Microscopía eletrónica de varredura de scaffold eletrofiado (electrospun) de poliuretano. Escala: 20μm

Polímeros naturais para aplicação, como scaffolds, são inspirados na matriz extracelular (MEC) que mantém as células unidas em um tecido nativo. Assim, alguns materiais, como colágeno (principalmente os tipos I e III são encontrados no coração) e fibrina, foram extensamente investigados na engenharia de tecidos cardíacos, devido a suas propriedades de interação natural com células.(1414. Eschenhagen T, Fink C, Remmers U, Scholz H, Wattchow J, Weil J, et al. Three-dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix: a new heart muscle model system. FASEB J. 1997;1 1(8):683-94.,1515. Christman KL, Fok HH, Sievers RE, Fang Q, Lee RJ. Fibrin glue alone and skeletal myoblasts in a fibrin scaffold preserve cardiac function after myocardial infarction. Tissue Eng. 2004;10(3-4):403-9.) No entanto, as propriedades mecânicas destes materiais, dependendo da conformação na forma de géis ou estruturas mais sólidas, podem não ser compatíveis com o tecido cardíaco.(55. Chen QZ, Harding SE, All NN, Lyon AR, Boccaccini AR. Biomaterials in cardiac tissue engineering: ten years of research survey. Mater Sci Eng Rep. 2008; 59(1-6):1-37.) Estratégia recente para obter polímeros naturais com tamanho e forma (anatomia) adequados é a descelularização.

Considerando a baixa resistência mecânica dos polímeros naturais, a combinação de polímeros sintéticos e naturais é aplicada como estratégia para criar scaffolds com melhores propriedades. Alperin et al., relataram que cardiomiócitos derivados de células-tronco embrionárias podem ser semeados em filmes de poliuretano revestidos com colágeno IV e laminina, e demonstraram um número maior de filmes contráteis do que poliuretano sem revestimento.(1616. Alperin C, Zandstra PW, Woodhouse KA. Polyurethane films seeded with embryonic stem cell-derived cardiomyocytes for use in cardiac tissue engineering applications. Biomaterials. 2005;26(35):7377-86.) Hong et al., produziram um composto bio-híbrido combinando MEC com poliuretano, para melhorar a bioatividade in vivo, e empregaram um método de eletrofiação/eletropulverização.(1717. Hong Y Huber A, Takanari K, Amoroso NJ, Hashizume R, Badylak SF et al. Mechanical properties and in vivo behavior of a biodegradable synthetic polymer microfiber-extracellular matrix hydrogel biohybrid scaffold. Biomaterials. 2011;32(13):3387-94.) Assim, uma abordagem promissora para a regeneração cardíaca pode ser, por exemplo, a síntese de poliuretano à base de colágeno.

Produção de material de scaffold

Uma questão importante, que tem sido objeto de investigação por grupos envolvidos em engenharia de tecidos do miocárdio, é o método de implante das células no local danificado. Uma das primeiras tecnologias desenvolvidas para a regeneração cardíaca foi a cardiomioplastia celular. Esta tecnologia foi muito importante para o estudo dos tipos de células, suas aplicações e efeitos na regeneração cardíaca. Entretanto, os métodos de implante das células no tecido miocárdico utilizados nesta tecnologia, como as vias transvenosa, endomiocárdica e intracoronária, não se mostraram satisfatórios e apresentaram desvantagens que levam a ineficiências.(1818. Wang F Guan J. Cellular cardiomyoplasty and cardiac tissue engineering for myocardial therapy. Adv Drug Deliv Rev. 2010;62(7-8):784-97. Review.) Outras estratégias de engenharia de tecidos cardíacas foram planejadas para melhorar os resultados da regeneração cardíaca, incluindo biomateriais injetáveis contendo células(1919. Ungerleider JL, Christman KL. Concise review: injectable biomaterials for the treatment of myocardial infarction and peripheral artery disease: translational challenges and progress. Stem Cells Transl Med. 2014;3(9):1090-9. Review.) e a criação de estruturas porosas bi- ou tridimensionais (patch ou scaffold).

Muitas técnicas foram investigadas para criar enxertos a serem implantados no coração, tais como métodos de produção de fibras, como eletrofiação(77. Gabriel LP Rodrigues AA, Macedo M, Jardini AL, Maciel Filho R. Electrospun polyurethane membranes for Tissue Engineering applications. Mater Sci Eng C. 2017;72:113-7.,88. Gabriel LP, Rodrigues AA, Jardini AL, Maciel Filho R. From biodegradable to long-term polyurethanes: in vitro fibroblasts adhesion and degradation study of electrospun polyurethane membranes. Int J Eng Res Appl. 2016;6(7):13-9.,2020. Rockwood DN, Akins RE Jr, Parrag IC, Woodhouse KA, Rabolt JF Culture on electrospun polyurethane scaffolds decreases atrial natriuretic peptide expression by cardiomyocytes in vitro. Biomaterials. 2008;29(36):4783-91.) e rotofiação,(2121. Cardoso GB, Machado-Silva AB, Sabino M, Santos AR Jr, Zavaglia CA. Novel hybrid membrane of chitosan/poly (ε-caprolactone) for tissue engineering. Biomatter. 2014;4(1):e29508.) além de engenharia por camadas de células.(2222. Shimizu T, Yamato M, Kikuchi A, Okano T. Cell sheet engineering for myocardial tissue reconstruction [Review]. Biomaterials. 2003;24(13):2309-16.) Ademais, as técnicas mais interessantes e recentes, como a descelularização, visam obter estruturas tridimensionais que não só podem regenerar o coração existente, mas também criar um órgão bioartificial inteiro.

A descelularização é um processo que consiste na remoção de todas as células dos tecidos ou órgãos, mantendo a MEC intacta (Figura 3), por meio de diferentes métodos físicos, químicos ou enzimáticos. Esta técnica é amplamente utilizada para obter scaffolds biológicos para aplicações clínicas. O processo de descelularização por perfusão se mostrou um método eficiente para preservar a geometria tridimensional dos órgãos e, com uma distribuição mais uniforme dos agentes de descelularização, é capaz de eliminar as células de maneira eficiente.(2323. Tapias LF Ott HC. Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs. Curr Opin Organ Transplant. 2014;19(2):145-52. Review.,2424. Keane TJ, Swinehart IT, Badylak SF. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance. Methods. 2015;84:25-34. Review.) Esta técnica foi a mais utilizada para a bioengenharia do coração inteiro, em parte devido à complexidade anatômica da macro e da microanatomia do órgão cardíaco, difícil de reproduzir em detalhes por meios inteiramente sintéticos, mas razoavelmente possível pela técnica de descelularização. A escolha do conduto para perfusão também é importante, e diferentes condutos de natureza vascular ou parenquimatosa são alternativas viáveis para certos órgãos (por exemplo, rim-vascular: artéria renal, veia renal; parenquimatosa: ureter), mas, para a descelularização cardíaca, a via de perfusão vascular é preferível, apresentando resultados promissores.(2424. Keane TJ, Swinehart IT, Badylak SF. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance. Methods. 2015;84:25-34. Review.)

Figura 3
Esquema de descelularização. (A) Um coração inteiro (pode ser humano, por exemplo de cadáver ou de transplante rejeitado, ou, mais comumente, de animal doador com tamanho/anatomia compatíveis, em geral, suíno) é colocado em (B) uma câmara de órgão de um biorreator de descelularização conectada à tubulação e a cânulas adequadas para perfusão. Inicia-se o processo de descelularização. Por algum tempo, geralmente 1 ou mais dias de aplicação contínua de solução de descelularização, o coração, aos poucos branqueia, indicando que o constituinte celular do tecido está sendo lavado, deixando para trás o colágeno e outras substâncias de tecido conjuntivo, e preservando bastante a arquitetura anatômica original do órgão em relação à vascularização e ao parênquima (C)

Seleção celular

A tecnologia da cardiomioplastia celular baseia-se no transplante celular e consiste no fornecimento de células para o tecido miocárdico lesado, visando à regeneração da função cardíaca que foi comprometida.(2525. Taylor DA. Cell-based myocardial repair: how should we proceed? Int J Cardiol. 2004;95 Suppl 1:S8-12. Review.) Muitos tipos de células foram utilizados para o transplante celular para o miocárdio lesado e são os mesmos utilizados como candidatos em outras técnicas de engenharia de tecidos miocárdico, incluindo cardiomiócitos adultos, fetais e neonatais;(2626. Soonpaa MH, Koh GY Klug MG, Field LJ. Formation of nascent intercalated disks between grafted fetal cardiomyocytes and host myocardium. Science. 1994;264(5155):98-101.,2727. Li RK, Weisel RD, Mickle DA, Jia ZQ, Kim EJ, Sakai T, et al. Autologous porcine heart cell transplantation improved heart function after a myocardial infarction. J Thorac Cardiovasc Surg. 2000;119(1):62-8.) mioblastos esqueléticos;(2828. Murry CE, Wiseman RW, Schwartz SM, Hauschka SD. Skeletal myoblast transplantation for repair of myocardial necrosis. J Clin Invest. 1996;98(11): 2512-23.) células-tronco derivadas da medula óssea (como células-tronco/progenitoras mesenquimais, endoteliais e hematopoiéticas);(2929. Janssens S, Dubois C, Bogaert J, Theunissen K, Deroose C, Desmet W, et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 2006;367(9505):113-21.) células-tronco embrionárias;(3030. Klug MG, Soonpaa MH, Koh GY Field LJ. Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts. J Clin Invest. 1996;98(1):216-24.3333. Laflamme MA, Chen KY, Naumova AV, Muskheli V, Fugate JA, Dupras SK, et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 2007; 25(9):1015-24.) células de músculos lisos;(3434. Li RK, Jia ZQ, Weisel RD, Merante F, Mickle DA. Smooth muscle cell transplantation into myocardial scar tissue improves heart function. J Mol Cell Cardiol. 1999;31(3):513-22.,3535. Yoo KJ, Li RK, Weisel RD, Mickle DA, Li G, Yau TM. Autologous smooth muscle cell transplantation improved heart function in dilated cardiomyopathy. Ann Thorac Surg. 2000;70(3):859-65.) células-tronco derivadas do tecido adiposo;(3636. Planat-Benard V, Silvestre JS, Cousin B, André M, Nibbelink M, Tamarat R, et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation. 2004;109(5):656-63.,3737. Rehman J, Traktuev D, Li J, Merfeld-Clauss S, Temm-Grove CJ, Bovenkerk JE, et al. Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells. Circulation. 2004;109(10):1292-8.) células-tronco cardíacas;(3838. Barile L, Chimenti I, Gaetani R, Forte E, Miraldi F, Frati G, et al. Cardiac stem cells: isolation, expansion and experimental use for myocardial regeneration. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 2007;4(S1 Suppl 1):S9-14.) e a tecnologia relativamente nova de células-tronco pluripotentes induzidas (células iPSC).(3939. Zwi L, Caspi O, Arbel G, Huber I, Gepstein A, Park IH, et al. Cardiomyocyte differentiation of human induced pluripotent stem cells. Circulation. 2009; 120(15):1513-23.,4040. Nelson TJ, Martinez-Fernandez A, Yamada S, Perez-Terzic C, Ikeda Y, Terzic A. Repair of acute myocardial infarction by human stemness factors induced pluripotent stem cells. Circulation. 2009;120(5):408-16.) Muitas considerações devem ser feitas para escolher o melhor tipo de célula a ser aplicada em cada situação, dependendo, por exemplo, de sua disponibilidade e sua adequação.(4141. Ott HC, McCue J, Taylor DA. Cell-based cardiovascular repair-the hurdles and the opportunities. Basic Res Cardiol. 2005;100(6):504-17.) É válido analisar as vantagens e desvantagens de cada tipo celular (Tabela 1).

Tabela 1
Vantagens e desvantagens de cada tipo de célula utilizada para cardiomioplastia celular

Cultura celular in vitro

O próximo tópico crítico para a criação de um enxerto cardíaco, após a seleção celular, é a cultura celular. De placas a equipamentos especializados em cultura de células (biorreatores), foram feitas pesquisas para estudar como promover a proliferação, o alinhamento, a diferenciação e a maturação celulares in vitro, antes da implantação in vivo.

O potencial para o alinhamento de células no scaffold foi demonstrado em alguns estudos com poliuretano e em cultura de células in vitro em placas. McDevitt et al., demonstraram que os cardiomiócitos poderiam ser cultivados em filmes de poliuretano com padrões de laminina impressos, permitindo o alinhamento bidimensional das células e apresentando resposta contrátil.(1111. McDevitt TC, Woodhouse KA, Hauschka SD, Murry CE, Stayton PS. Spatially organized layers of cardiomyocytes on biodegradable polyurethane films for myocardial repair. J Biomed Mater Res A. 2003;66(3):586-95.) Rockwood et al., prepararam substratos de cultura de poliuretano biodegradáveis alinhados e desalinhados usando eletrofiação, demonstrando que scaffolds alinhados podem gerar uma organização celular semelhante à do tecido cardíaco nativo.(2020. Rockwood DN, Akins RE Jr, Parrag IC, Woodhouse KA, Rabolt JF Culture on electrospun polyurethane scaffolds decreases atrial natriuretic peptide expression by cardiomyocytes in vitro. Biomaterials. 2008;29(36):4783-91.)

Para promover o aumento da proliferação, da diferenciação e da maturação celulares, a cultura celular in vitro dos tipos celulares escolhidos é realizada em laboratórios especializados em cultura de células, tanto nas instituições acadêmicas quanto nas indústrias. A infraestrutura padrão inclui salas limpas, incubadoras de dióxido de carbono, armários de segurança biológica, consumíveis de cultura de células estéreis, contadores de células, e outros equipamentos padrão. Em alguns casos,(5656. Eibl D, Eibl R. Bioreactors for mammalian cells: general overview. Cell and tissue reaction engineering. Berlin, Heidelberg: Springer; 2009. p. 55-82.) pode ser justificado o uso de biorreatores celulares, baseados unicamente na finalidade de melhorar, refinar e otimizar a qualidade e o rendimento (expansão) da própria célula. O objetivo de empregar tais biorreatores celulares, que podem incluir equipamentos como biorreatores de ondas (GE Xuri, GE Healthcare, Nova Iorque, NI, EUA) e biorreatores de tanque agitado (Applikon, Delft, Holanda; Sartorius, Gottingen, Alemanha; e outros) com microtransportadores para cultura de células aderentes, ou robôs de cultura celular automatizados (SelecT & CompacT SelecT, Sartorius Stedim Biotech, Royston, Reino Unido; sistemas VANTAGE & STAR, Hamilton, Reno, NV, EUA; sistema Freedom EVO, Tecan, Mânnedorf, Suíça; sistema Cytomat 10, Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA e outros), seria melhorar a qualidade e o rendimento viáveis alcançados pelas técnicas tradicionais de cultura celular. Olhando de forma mais ampla a categoria dos equipamentos como um todo, os biorreatores podem ser descritos como sistemas com condições e parâmetros controlados que permitem a estimulação do crescimento celular ou a transformação de substrato em produtos de interesse por células vivas ou seus componentes, como enzimas ou organelas.(5656. Eibl D, Eibl R. Bioreactors for mammalian cells: general overview. Cell and tissue reaction engineering. Berlin, Heidelberg: Springer; 2009. p. 55-82.) Sistemas baseados na produção de bioprodutos, como proteínas, lipídeos, entre outros, são chamados de biorreatores de produção.(5757. Kaasi A, Jardini AL. Bioreactors. In: Hashmi S, editor. Reference Module in Materials Science and Materials Engineering. Oxford: Elsevier; 2016. p. 1-15.) Sistemas que, por outro lado, focam na expansão celular e na terapia celular, para obter as próprias células como produto, são chamados biorreatores de células.(5757. Kaasi A, Jardini AL. Bioreactors. In: Hashmi S, editor. Reference Module in Materials Science and Materials Engineering. Oxford: Elsevier; 2016. p. 1-15.) Finalmente, os sistemas utilizados para a engenharia de tecidos, procurando obter tecido maduro como resultado, são denominados biorreatores de tecidos.(5757. Kaasi A, Jardini AL. Bioreactors. In: Hashmi S, editor. Reference Module in Materials Science and Materials Engineering. Oxford: Elsevier; 2016. p. 1-15.)

Muitos tipos de biorreatores foram utilizados para diferentes aplicações em bioprocessos. A diversidade de alternativas de projetos de biorreatores é baseada em parâmetros e condições específicas, como transferência de calor ou gás e homogeneidade, necessárias para cada aplicação. Alguns exemplos de projetos de biorreatores são o tanque-agitado e os reatores tipo airlift.(5858. Mandenius CF. Challenges for bioreactor design and operation. In: Mandenius CF, editor. Bioreactors: Design, Operation and Novel Applications. Germany: Wiley-VCH; 2016. p. 1-34.)

A possibilidade de criar um ambiente dinâmico com controle mecânico, físico e bioquímico, faz dos biorreatores teciduais uma tecnologia amplamente utilizada na engenharia de tecidos, devido à necessidade de fornecer estímulos apropriados para diferenciação e proliferação celular, e estimular propriedades da MEC adequadas para tecidos em desenvolvimento.(5959. Korossis S, Bolland F, Kearney J, Fisher J, Ingham E. Bioreactors in tissue engineering. Topics Tissue Eng. 2005;2(8):1-23.) Alguns estudos sobre biorreatores engenharia de tecidos, incluem osso,(6060. Rauh J, Milan F, Günther KP, Stiehler M. Bioreactor systems for bone tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 2011;17(4):263-80. Review.) cartilagem(6161. Darling EM, Athanasiou KA. Articular cartilage bioreactors and bioprocesses Tissue Eng. 2003;9(1):9-26. Review. Erratum in: Tissue Eng. 2003;9(3):565.) e sistema cardiovascular.(6262. Barron V, Lyons E, Stenson-Cox C, McHugh PE, Pandit A. Bioreactors for cardiovascular cell and tissue growth: a review. Ann Biomed Eng. 2003; 31(9):1017-30. Review.)

No âmbito dos estudos com foco em tecido cardiovascular, têm-se vasos sanguíneos,(6363. Isenberg BC, Williams C, Tranquillo RT. Small-diameter artificial arteries engineered in vitro. Circ Res. 2006;98(1):25-35. Review.) válvulas cardíacas(5757. Kaasi A, Jardini AL. Bioreactors. In: Hashmi S, editor. Reference Module in Materials Science and Materials Engineering. Oxford: Elsevier; 2016. p. 1-15.,6464. Kaasi A, Cestari IA, Stolf NA, Leirner AA, Hassager O, Cestari IN. A new approach to heart valve tissue engineering: mimicking the heart ventricle with a ventricular assist device in a novel bioreactor. J Tissue Eng Regen Med. 2011;5(4):292-300.) e cultura de tecido cardíaco.(44. Papadaki M, Bursac N, Langer R, Merok J, Vunjak-Novakovic G, Freed LE. Tissue engineering of functional cardiac muscle: molecular, structural, and electrophysiological studies. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2001;280(1): H168-78.,6565. Carrier RL, Rupnick M, Langer R, Schoen FJ, Freed LE, Vunjak-Novakovic G. Effects of oxygen on engineered cardiac muscle. Biotechnol Bioeng. 2002; 78(6):617-25.6868. Bursac N, Papadaki M, White JA, Eisenberg SR, Vunjak-Novakovic G, Freed LE. Cultivation in rotating bioreactors promotes maintenance of cardiac myocyte electrophysiology and molecular properties. Tissue Eng. 2003;9(6):1243-53.) O tecido cardíaco é extremamente complexo e os biorreatores podem ajudar a entender melhor a influência de cada parâmetro durante a cultura in vitro (Figura 4). Carrier et al., estudaram e caracterizaram o efeito de diferentes parâmetros, como fonte das células, cultivo celular, fluxo e oxigênio, na estrutura e na função cardíacas, que passaram por processos de engenharia, semeando suspensões bem misturadas de cardiomiócitos em placas misturadas em órbitas e frascos giratórios.(6565. Carrier RL, Rupnick M, Langer R, Schoen FJ, Freed LE, Vunjak-Novakovic G. Effects of oxygen on engineered cardiac muscle. Biotechnol Bioeng. 2002; 78(6):617-25.) Bursac et al., demonstraram que o músculo cardíaco tridimensional poderia ser manipulado usando células isoladas e scaffolds de polímero (PGA) biodegradável, em frascos giratórios, para obter propriedades estruturais e eletrofisiológicas específicas.(66. Bursac N, Papadaki M, Cohen RJ, Schoen FJ, Eisenberg SR, Carrier R, et al. Cardiac muscle tissue engineering: toward an in vitro model for electrophysiological studies. Am J Physiol. 1999;277(2 Pt 2):H433-44.) Papadaki et al., mostraram a correlação entre propriedades moleculares, estruturais e eletrofisiológicas, e como estas podem ser melhoradas com uma alta concentração de miócitos, scaffolds de PGA com superfície hidrolisada, revestida por laminina, usando biorreatores rotativos e um meio com baixo teor de soro.(44. Papadaki M, Bursac N, Langer R, Merok J, Vunjak-Novakovic G, Freed LE. Tissue engineering of functional cardiac muscle: molecular, structural, and electrophysiological studies. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2001;280(1): H168-78.) Carrier et al., estudaram o efeito de perfusão na melhora das condições de transporte da cultura e na criação de construtos com distribuições espaciais relativamente uniformes de células cardíacas, usando frascos mistos.(6666. Carrier RL, Rupnick M, Langer R, Schoen FJ, Freed LE, Vunjak-Novakovic G. Perfusion improves tissue architecture of engineered cardiac muscle. Tissue Eng. 2002;8(2):175-88.) Radisic et al., mostraram que a inoculação rápida de células, seguida por perfusão imediata, permitiu o cultivo rápido e uniforme de cardiomiócitos em alta densidade, mantendo a viabilidade celular.(6767. Radisic M, Euloth M, Yang L, Langer R, Freed LE, Vunjak-Novakovic G. High-density seeding of myocyte cells for cardiac tissue engineering. Biotechnol Bioeng. 2003;82(4):403-14.) Bursac et al,. relataram que cardiomiócitos de ratos recém-nascidos cultivados utilizando biorreatores rotatórios em scaffolds tridimensionais tinham propriedades mais semelhantes ao tecido nativo do que células cultivadas em monocamadas.(6868. Bursac N, Papadaki M, White JA, Eisenberg SR, Vunjak-Novakovic G, Freed LE. Cultivation in rotating bioreactors promotes maintenance of cardiac myocyte electrophysiology and molecular properties. Tissue Eng. 2003;9(6):1243-53.) Gonen-Wadmany et al., estudaram o efeito de um biorreator de estimulação de tensão para aplicar distensão cíclica em construtos cardíacos modificados por engenharia e melhorar a orientação celular in vitro.(6969. Gonen-Wadmany M, Gepstein L, Seliktar D. Controlling the cellular organization of tissue-engineered cardiac constructs. Ann N Y Acad Sci. 2004;1015(1):299-311.) Lichtenberg et al., relataram o desenvolvimento de um biorreator multifuncional com quatro câmaras e dois compartimentos separados para o cultivo concomitante tridimensional de diferentes tipos de células e condições de cultura.(7070. Lichtenberg A, Dumlu G, Walles T, Maringka M, Ringes-Lichtenberg S, Ruhparwar A, et al. A multifunctional bioreactor for three-dimensional cell (co)-culture. Biomaterials. 2005;26(5):555-62.) Desta forma, muitos tipos de biorreatores foram projetados para engenharia de tecidos cardíacos, e as diferentes técnicas testadas abriram caminho para um grande número de estratégias possíveis, que podem ser melhoradas, refinadas ou otimizadas, para obter um enxerto ideal de tecido miocárdico maduro.

Figura 4
Biorreator para tecidos e órgãos Eva Luxor™ com uma traqueia na câmara de órgão, passando pelo processo de descelularização. O mesmo biorreator pode ser utilizado para cultivo de tecido usando meio de cultura celular no lugar de soluções de descelularização (por exemplo, detergentes)

CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

O coração é um órgão extremamente complexo e as técnicas que influenciam em sua regeneração dependem de muitas variáveis de caráter não triviais. Estas técnicas geralmente se concentram na seleção de material de scaffold, produção de material de scaffold, seleção celular e cultivo celular in vitro. Muitos estudos neste campo já fizeram um enorme progresso, seja em um enxerto ou em um coração bioartificial inteiro. No entanto, muito trabalho ainda precisa ser feito para melhor entender e resolver os desafios experimentais e das tecnologias existentes, melhorando as técnicas atuais e desenvolvendo novas técnicas, protocolos e métodos.

Para a seleção e a estrutura do material, primeiramente, é importante definir o melhor material (sintético, natural ou híbrido) para aplicações cardíacas. Algumas propriedades desejadas para estes materiais são taxas de degradação ajustáveis, boa porosidade, biocompatibilidade, hemocompatibilidade, boa adesão celular, propriedades mecânicas e elásticas compatíveis com o coração, e que o material permita um bom acoplamento elétrico entre as células e entre o scaffold e o tecido nativo.(1111. McDevitt TC, Woodhouse KA, Hauschka SD, Murry CE, Stayton PS. Spatially organized layers of cardiomyocytes on biodegradable polyurethane films for myocardial repair. J Biomed Mater Res A. 2003;66(3):586-95.,1313. Baheiraei N, Yeganeh H, Ai J, Gharibi R, Azami M, Faghihi F Synthesis, characterization and antioxidant activity of a novel electroactive and biodegradable polyurethane for cardiac tissue engineering application. Mater Sci Eng C. 2014;44:24-37.) Em segundo lugar, é necessário escolher a técnica para produzir o scaffold, na qual as células vão ser semeadas antes da implantação. As perspectivas neste campo concentram-se na obtenção de um scaffold a partir da estrutura tridimensional de um coração inteiro. Além da descelularização, que é promissora para a aplicação em engenharia de tecidos cardíacos, outra tecnologia em destaque é a bioimpressão tridimensional de tecidos e órgãos.(7171. Murphy SV, Atala A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotechnol. 2014;32(8):773-85.) A combinação de bioimpressão tridimensional, biorreatores e células-tronco poderia fornecer uma nova tecnologia que permitiria o desenvolvimento do órgão humano da próxima geração.

Para a seleção celular e a expansão in vitro, o primeiro passo essencial é determinar o melhor tipo de célula para a aplicação (células-tronco derivadas da medula óssea, cardiomiócitos, iPSC, entre outros), considerando a disponibilidade e as peculiaridades sobre cada tipo de célula. Depois disso, o cultivo das células in vitro é necessário antes da semeadura e da posterior implantação do tecido. A tecnologia mais eficiente para fornecer a proliferação e a diferenciação destas células é o biorreator. Muitos tipos diferentes de biorreatores para aplicações cardíacas de engenharia de tecidos foram estudados, mas ainda resta determinar quais técnicas são as mais adequadas, com um equilíbrio ideal de vantagens e desvantagens, reconhecendo que nenhuma técnica isolada pode preencher todos os requisitos.

Outras oportunidades para engenharia do tecido miocárdico incluem encontrar a melhor combinação das diferentes técnicas aqui descritas, para conseguir o miocárdio artificial ideal para aplicações clínicas e estudar a influência de outros aspectos, como o melhor momento para implantação, com maior adesão celular no tecido do receptor após um infarto agudo do miocárdio.(1818. Wang F Guan J. Cellular cardiomyoplasty and cardiac tissue engineering for myocardial therapy. Adv Drug Deliv Rev. 2010;62(7-8):784-97. Review.)

AGRADECIMENTOS

Este trabalho recebeu apoio do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Biofabricação (INCT-BIOFABRIS), do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, processo 573661/2008-1) e da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (processos 2008/57860-3 e 2014/22799-3).

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    21 Set 2018
  • Data do Fascículo
    2018

Histórico

  • Recebido
    22 Abr 2018
  • Aceito
    24 Jul 2018
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