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Jornal Brasileiro de Pneumologia

On-line version ISSN 1806-3756

J. bras. pneumol. vol.31 no.6 São Paulo Nov./Dec. 2005

https://doi.org/10.1590/S1806-37132005000600008 

ARTIGO ORIGINAL

 

Infarto do miocárdio experimental e aumento do estresse oxidativo em diafragma de ratos*

 

 

Fabiano Leichsering SilvaI; Nicolle Gollo MazzottiII; Marcus PicoralII; Daniella Meirelles NascimentoIII; Maria Isabel Morgan MartinsIV; Adriane Belló KleinIV

IMestrando da Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS - Porto Alegre (RS) Brasil
IIBolsista de Iniciação da Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS - Porto Alegre (RS) Brasil
IIIMestre pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS - Porto Alegre (RS) Brasil
IVDoutora pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS - Porto Alegre (RS) Brasil

Endereço para correspondência

 

 


RESUMO

OBJETIVO: Este é um estudo experimental que visa a avaliar o efeito da insuficiência cardíaca no estresse oxidativo em diafragma de ratos.
MÉTODOS:
O modelo de infarto do miocárdio por ligadura da artéria coronária esquerda foi utilizado para desenvolvimento de insuficiência cardíaca. No 42º dia após a ligadura coronária, os animais foram mortos e tiveram o diafragma retirado e homogeneizado. O estresse oxidativo foi avaliado em homogeneizados de diafragma através de medidas de lipoperoxidação e de ensaios de atividade enzimática antioxidante: catalase, glutationa peroxidase (enzimas que reduzem o peróxido de hidrogênio à água) e superóxido dismutase (enzima antioxidante que reduz o superóxido a peróxido de hidrogênio).
RESULTADOS: Os resultados encontrados foram os seguintes: o modelo de ligadura de artéria coronária esquerda foi efetivo em gerar insuficiência cardíaca, com área média de infarto de 39% da área do ventrículo esquerdo; a lipoperoxidação estava 217% aumentada no diafragma dos animais infartados em relação aos controles; a atividade antioxidante da catalase estava reduzida em 77% e a da glutationa peroxidase em 20%, em comparação com o grupo controle; o infarto não alterou a atividade enzimática da superóxido dismutase.
CONCLUSÃO: Os resultados sugerem a presença de estresse oxidativo no músculo diafragmático em animais submetidos à ligadura da artéria coronária esquerda.

Descritores: Infarto do miocárdio; Estresse oxidativo; Insuficiência cardíaca congestiva; Antioxidantes; Diafragma; Ratos


 

 

INTRODUÇÃO

As doenças cardiovasculares representam as principais causas de morbidade e de mortalidade do mundo.(1-2) A insuficiência cardíaca é responsável por pelo menos 20% das internações entre pacientes com mais de 65 anos, sendo que esse índice tem mostrado um perfil crescente.(3)

Os principais sintomas da insuficiência cardíaca são dispnéia, fadiga e diminuição de força muscular. Esses sintomas podem limitar a tolerância ao exercício, levando à congestão pulmonar e ao edema periférico. Os mecanismos relacionados à intolerância ao exercício em pacientes com insuficiência cardíaca não estão totalmente definidos.(4-6) No entanto, uma das hipóteses para a diminuição de força muscular é o aumento do dano oxidativo, promovido por hipoxemia relacionada à redução de aporte sangüíneo,(7) uma vez que a estrutura e a função das membranas celulares são afetadas, resultando em disfunção celular.(8-10)

Com base nesses dados, é possível supor que a insuficiência cardíaca seja capaz de produzir a redução do aporte sangüíneo ao diafragma, aumentando, assim, o estresse oxidativo nesse músculo.

No presente estudo, induzimos insuficiência cardíaca em ratos por meio de infarto do miocárdio experimental e examinamos o perfil oxidativo diafragmático e alterações na atividade de enzimas antioxidantes.

 

MÉTODOS

Foram utilizados ratos Wistar (n = 7, por grupo), fornecidos pelo Biotério do Instituto de Ciências Básicas da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, de acordo com o Comitê Internacional de Cuidado ao Uso de Animais.(11-12) Os ratos tiveram acesso livre à ração e à água, e foram mantidos em ciclos claro-escuro de 12 h e temperatura entre 20 e 25°C. Os animais foram divididos em dois grupos experimentais: grupo infarto, com animais submetidos à cirurgia de ligadura da coronária esquerda, e grupo controle, com animais que sofreram cirurgia fictícia. O método utilizado para produzir infarto do miocárdio foi baseado no de Pfeffer, com pequenas modificações.(13) Os animais foram anestesiados com quetamina (50 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), via intraperitoneal.

Após 42 dias da ligadura da coronária esquerda, os animais foram pesados e sacrificados por deslocamento cervical. Diafragma, coração, pulmões e fígado foram imediatamente removidos. O diafragma foi homogeneizado (UltraTurrax, Staufen, Alemanha) (5 mL/g de tecido) a 4°C com KCl 1,15% (p/v), 15µL de Triton X-100 10% e fluoreto de fenilmetil sulfonil (100 mmol/L), na proporção de 10 µL de KCl para inibir a atividade de proteases na amostra. A mistura foi centrifugada por 20 min (0 - 4°C) a 3.000 rpm (Sorval RC 5B-rotor SM24, Du Pont Instruments, USA), e o sobrenadante foi coletado e congelado a - 80°C para medidas de estresse oxidativo.(14)

O coração foi pesado e os ventrículos foram dissecados. A presença de infarto foi facilmente confirmada macroscopicamente pela visualização da cicatriz na região ântero-lateral do ventrículo esquerdo. A área de infarto foi calculada e apresentada como percentagem da superfície endocárdica do ventrículo esquerdo coberta por cicatriz.(15) Apenas corações com área de infarto superior a 25% da área ventricular esquerda foram incluídos no estudo. O índice de hipertrofia cardíaca foi obtido pela razão entre a massa do coração e a massa corporal total do animal (mg/g de peso corporal). Foi também calculada essa razão em relação à massa do ventrículo direito (hipertrofia de ventrículo direito) e à massa do ventrículo esquerdo (hipertrofia de ventrículo esquerdo).

Com relação à congestão pulmonar e hepática, para obtenção das relações peso úmido/peso seco dos pulmões e do fígado, os órgãos foram removidos e liberados de tecidos aderentes. Em cada caso, os tecidos foram pesados e colocados em estufa a 70ºC até peso constante.

A lipoperoxidação foi estimada pelo método das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico. Para isso, foram adicionados ao homogeneizado de diafragma ácido tricloroacético (10%) e ácido tiobarbitúrico (0,67%) - incubação a 100ºC por 15 minutos - e foi realizada a leitura da absorbância a 535 nm em espectrofotômetro. Os resultados foram expressos em nmoles por mg de proteína.(16)

A atividade da superóxido dismutase, enzima antioxidante que reduz o radical superóxido a peróxido de hidrogênio, foi determinada em homogeneizados de músculo diafragma pela taxa de inibição da reação do radical superóxido com o pirogalol. A atividade da enzima foi expressa em U/mg de proteína.(17) A atividade da glutationa peroxidase foi determinada em espectrofotômetro, medindo-se a oxidação do NADPH a 340 nm em um meio de reação contendo solução reguladora de fosfatos. A atividade da enzima foi expressa em nmoles/min/mg de proteína.(18) A atividade da catalase foi medida pela diminuição da absorção do peróxido de hidrogênio a 240 nm, sendo expressa em pmoles/mg de proteína.(19)

A concentração total de proteína das amostras foi quantificada pelo método de Lowry et al., utilizando-se albumina bovina como padrão.(20)

Os valores foram expressos como média ± erro padrão da média. Foi utilizado o teste t de Student para comparação entre os grupos, sendo consideradas significativas as diferenças para um p < 0,05.

 

RESULTADOS

A taxa de mortalidade do grupo infarto durante ou imediatamente após o procedimento cirúrgico foi de 33%. Outros 2% morreram na segunda semana após a cirurgia. A área média de infarto, promovida pela ligadura coronária esquerda, foi de 39% da área ventricular total (intervalo de confiança 29% - 44%).

Houve diferenças estatisticamente significativas entre os grupos em relação aos índices de hipertrofia cardíaca, e hipertrofias ventriculares esquerda e direita. A Tabela 1 mostra esses índices, assim como as relações peso úmido/peso seco para pulmões e fígado, que também estavam aumentadas no grupo infarto em relação ao controle.

 

 

Os resultados relacionados às análises de estresse oxidativo são mostrados na Tabela 2. Esses resultados indicam que a peroxidação lipídica, avaliada pelo método das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, estava significativamente aumentada no grupo infarto em comparação com o grupo controle (217%). As atividades da glutationa peroxidase e da catalase estavam 20% e 77% reduzidas no grupo infarto em relação ao grupo controle, respectivamente. O infarto não modificou a atividade da superóxido dismutase.

 

 

DISCUSSÃO

Após um evento isquêmico, como o infarto agudo do miocárdio, o tecido cardíaco passa a sofrer modificações que resultam num complexo de alterações envolvendo não somente o tecido infartado, mas todo o coração. Para se adaptar à nova condição, a região isquêmica modifica-se morfologicamente e, após a reação inflamatória local, as fibras lesadas começam a ser substituídas por tecido fibroso, formando a cicatriz.(1)

Um estudo com técnica semelhante de indução de infarto verificou diminuição da pressão sistólica do ventrículo esquerdo e do débito cardíaco, dados que corroboram nossos achados.(21) Assim, o desenvolvimento de hipertrofia cardíaca, bem como de congestão pulmonar e hepática podem ser resultantes de uma alteração da mecânica cardíaca e diminuição do débito.

A congestão pulmonar aumenta o esforço da musculatura ventilatória. Além disso, neste estudo, pelo menor débito cardíaco houve provavelmente menor aporte sangüíneo para o diafragma. Dessa forma, produzimos uma sobrecarga na musculatura ventilatória, pois a função diafragmática é criticamente dependente de uma circulação sangüínea adequada a fim de que haja oxigênio para sua função metabólica e atividade contrátil.

Um estudo com fibras diafragmáticas de ratos mostrou um aumento da produção de espécies ativas de oxigênio quando submetidas à situação hipoxêmica.(10) Em um estudo semelhante, que analisou fibras do músculo diafragma de 81 ratos Wistar, foi demonstrada redução da força de contração da musculatura estriada e também aumento da produção de espécies ativas de oxigênio sob condições de hipoxemia.(22)

Em nosso estudo, observou-se um aumento significativo dos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico nos homogeneizados de diafragma dos animais com ligadura de coronária, quando comparados com o grupo controle, o que sugere um aumento do dano oxidativo nesse tecido. Também se observou uma redução de atividade das enzimas catalase e glutationa peroxidase nos homogeneizados de diafragma desses animais, quando comparados com os controles. Estes dados, aumento da lipoperoxidação e diminuição da atividade de enzimas antioxidantes, representam uma situação de estresse oxidativo.

As enzimas antioxidantes têm papel fundamental na proteção do organismo, pois constituem a primeira linha de defesa contra as espécies ativas de oxigênio.(23) Estudos têm demonstrado que há atividade enzimática diminuída em tecidos submetidos a situações isquêmicas(24-25) e que o aumento na concentração de algumas dessas espécies ativas de oxigênio, como o radical superóxido e o peróxido de hidrogênio, pode inibir a atividade enzimática.(26)

Assim, sugerimos que o desequilíbrio encontrado na atividade enzimática do músculo diafragma, neste estudo, é conseqüente às condições sistêmicas geradas pelo infarto do miocárdio.

O aumento nos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico denota um maior dano oxidativo lipídico. Esse dano promove perda da capacidade de manutenção do equilíbrio homeostático celular e faz com que funções vitais das células sejam prejudicadas. Dentre elas, a diminuição da função das mitocôndrias. À medida que a membrana mitocondrial é lesada, há perda da capacidade de transporte de oxigênio.(27) Este mecanismo leva, em situações de alta demanda, a uma adaptação metabólica de menor produção de energia, refletindo na piora da contratilidade muscular.(28)

Alguns autores descreveram modificações fisiológicas em diafragmas sob condições isquêmicas. Nessas condições, a adaptação deve-se ao aumento de fibras do tipo IIb, tipicamente de contração rápida, porém com menor capacidade oxidativa.(27, 29)

O infarto do miocárdio aumentou o dano oxidativo, bem como diminuiu a atividade das enzimas antioxidantes no músculo diafragma. Estratégias que consigam modular o estresse oxidativo, através de adaptações do sistema antioxidante, como a prática de exercício físico com intensidade, freqüência e duração adequadas, podem representar melhora do desempenho dessa musculatura quando submetida a danos isquêmicos.

 

REFERÊNCIAS

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Endereço para correspondência:
Adriane Belló-Klein
Rua Sarmento Leite, 500
CEP: 90050-170, Porto Alegre - RS, Brasil
Tel: 55 51 3316-3621
E-mail: belklein@ufrgs.br

Recebido para publicação em 10/11/03. Aprovado, após revisão, em 15/6/05.

 

 

* Trabalho realizado no Laboratório de Fisiologia Cardiovascular, Departamento de Fisiologia, Instituto de Ciências Básicas da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS - Porto Alegre (RS) Brasil

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