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Jornal Brasileiro de Pneumologia

versión impresa ISSN 1806-3713

J. bras. pneumol. v.34 n.7 São Paulo jul. 2008

http://dx.doi.org/10.1590/S1806-37132008000700004 

ARTIGO ORIGINAL

 

Modelos experimentais para avaliação das alterações pulmonares na síndrome hepatopulmonar*

 

 

Rafael VercelinoI; Juliana TieppoI; Luiz Albeto Forgiarini JuniorII; Alexandre Simões DiasIII; Claudio Augusto MarroniIV; Norma Possa MarroniV

IEstudante de Doutorado do Programa de Pós-graduação em Fisiologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS - Porto Alegre (RS) Brasil
IIEstudante de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Ciências Pneumológicas da Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS - Porto Alegre (RS) Brasil
IIICoordenador do Mestrado Profissional em Reabilitação e Inclusão do Centro Universitário Metodista - IPA - Porto Alegre (RS) Brasil
IVProfessor Associado de Gastroenterologia. Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, Porto Alegre (RS) Brasi
VCoordenadora do Laboratório de Hepatologia e Fisiologia Experimental do Hospital de Clínicas de Porto Alegre-Universidade Luterana do Brasil - HCPA-ULBRA - Porto Alegre (RS) Brasil

Endereço para correspondência

 

 


RESUMO

OBJETIVO: O objetivo deste trabalho foi avaliar o melhor modelo experimental para observar alterações pulmonares que caracterizam a síndrome hepatopulmonar (SHP).
MÉTODOS: Ratos machos Wistar, com peso médio de 250 g foram usados em quatro modelos experimentais: tetracloreto de carbono inalatório; tetracloreto de carbono intraperitoneal; ligadura parcial de veia porta; e ligadura de ducto biliar (LDB). Em todos os grupos os animais foram divididos em controle e experimental. Foram avaliadas as seguintes variáveis: transaminases; gasometria; lipoperoxidação por substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e por quimiluminescência; e atividade antioxidante da enzima superóxido dismutase (SOD). Foi feito também o exame anatomopatológico do pulmão.
RESULTADOS: Observou-se diferenças significativas entre os grupos LDB controle e experimental: aspartato amino transferase (105,3 ± 43 vs. 500,5 ± 90,3 UI/L); alanino aminotransferase (78,75 ± 37,7 vs. 162,75 ± 35,4 UI/L); fosfatase alcalina (160 ± 20,45 vs. 373,25 ± 45,44 UI/L); pressão parcial de oxigênio (85,25 ± 8,1 vs. 49,9 ± 22,5 mmHg); e saturação de hemoglobina (95 ± 0,7 vs. 73,3 ± 12,07%). A lipoperoxidação e a atividade antioxidante também demonstrou diferenças entre os dois grupos LDB (controle vs. experimental): TBARS (0,87 ± 0,3 vs. 2,01 ± 0,9 nmol/mg proteína); quimiluminescência (16008,41 ± 1171,45 vs. 20250,36 ± 827,82 cps/mg proteína); e SOD (6,66 ± 1,34 vs. 16,06 ± 2,67 UI/mg proteína). No exame anatomopatológico observou-se vasodilatação pulmonar no modelo de LDB.
CONCLUSÕES: Os dados sugerem que o modelo de LDB pode ser usado para outros estudos envolvendo alterações hepáticas e suas relações com o estresse oxidativo e a SHP.

Descritores: Síndrome hepatopulmonar; Pulmão; Estresse oxidativo; Ratos.


 

 

Introdução

A cirrose hepática é uma doença crônica progressiva, que representa um estado de disfunção hepática irreversível ou lentamente reversível, caracterizado pela formação de nódulos fibróticos. Ocorre como resulta da cicatrização e regeneração hepatocelular, que constitui a principal resposta do tecido hepático para os incontáveis insultos inflamatórios, tóxicos metabólicos e congestivos.(1)

Anormalidades da oxigenação arterial são comuns em pacientes com cirrose, observando-se uma grande diferença no gradiente alvéolo-arterial de oxigênio e hipoxemia aguda em 3-7% dos casos (pressão parcial arterial de oxigênio-PaO2-abaixo de 60 mmHg).(2) A fisiopatologia da disfunção pulmonar na presença de doenças hepáticas pode envolver uma diminuição na atenuação da vasoconstrição hipóxica, baixa resistências vascular, desequilíbrio da ventilação e perfusão, shunt intrapulmonar e alteração na difusão gasosa. Estes achados clínicos e laboratoriais caracterizam a síndrome hepatopulmonar (SHP), que é observada em pacientes com cirrose ou hipertensão portal e consiste de cirrose acompanhada de hipoxemia e vasodilatação intrapulmonar, mesmo sem doença cardiopulmonar.(3)

A indução experimental da doença hepática pode replicar com precisão as alterações histológicas, bioquímicas, hemodinâmicas, renais e neurohumorais observadas na disfunção hepática humana. Os riscos do manuseio para o pesquisador são eliminados, e o uso de tais modelos melhora nosso entendimento da fisiopatologia da doença hepática e de outras síndromes envolvidas. Podemos acompanhar o progresso fisiopatológico da cirrose e suas complicações através de estudos experimentais em modelos de cirrose hepática, cirrose biliar secundária e hipertensão portal. Em tais modelos, a cirrose hepática é induzida através da administração de agentes carcinogênicos como o tetracloreto de carbono (CCl4), e a cirrose biliar é induzida através da ligadura de ducto biliar (LDB), e a hipertensão portal é induzida pela ligadura parcial da veia porta (LPVP).(4) Entre as inúmeras complicações da SHP, algumas das mais sérias são as alterações pulmonares, que são primariamente caracterizadas por baixas concentrações de oxigênio e vasodilatação intrapulmonar. Até o momento, não existe um modelo específico para o estudo destas alterações relacionadas à SHP. Portanto, o objetivo deste estudo é comparar quatro modelos experimentais em termos de habilidade para demonstrar as complicações pulmonares que ocorrem na SHP. Para tanto, analisamos a função hepática, gasometria, aspectos anatomopatológicos e estresse oxidativo (para quantificar dano tecidual).

 

Métodos

Para os propósitos deste estudo 40 ratos Wistar machos (peso corporal médio de 250 g) foram obtidos junto ao Centro de Reprodução e Experimentação de Animais de Laboratório da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Os ratos foram acondicionados em gaiolas plásticas (47 × 34 × 18 cm) forradas com lascas de madeira e foram mantidos em ciclo claro/escuro de 12/12 h em um ambiente com temperatura controlada (20-25 ºC) com acesso ad libitum à ração e água. Todos os procedimentos estavam de acordo com os parâmetros estabelecidos pelos comitês de ética do Hospital das Clínicas de Porto Alegre: o Comitê de Pesquisa em Saúde e Direito dos Animais, e o Comitê do Grupo de Pós-Graduação e Pesquisa sobre Pesquisa e Ética em Saúde. Quatro modelos experimentais foram avaliados.

1) CCl4 inalatório (CCl4 IN) para induzir a cirrose. Os animais foram divididos em dois subgrupos: controle (CCl4 IN-Co, n = 5), recebendo apenas fenobarbital em água potável, e experimental (CCl4 IN-Ex, n = 5), recebendo fenobarbital em água potável mais CCl4 IN. O fenobarbital foi adicionado à água potável a uma concentração de 0,3 g/L com a finalidade de provocar indução enzimática e acelerar o processo cirrótico. O grupo CCl4 IN-Ex foi exposto ao agente agressivo duas vezes por semana (às segundas e sextas), de acordo com o protocolo desenvolvido por Jiménez et al.,(4) em uma câmara de inalação (47 × 34 × 18 cm). O CCl4 foi colocado em um recipiente de vidro (umidificador) acoplado a um compressor de ar e liberado na câmara a um fluxo de 1 L/min. Nas primeiras três sessões, a duração da exposição foi de 30 s e os animais permaneceram dentro da câmara por mais 30 s enquanto o compressor estava desligado (tempo de espera). Na quarta sessão, a duração da exposição foi aumentada para 60 s, seguida de 60 s adicionais em modo de espera. Em seguida, a duração da exposição e do tempo de espera foram aumentados em 30 s a cada três sessões, chegando a um máximo de 5 min na 16ª semana.(4,5)
2) CCl4 intraperitoneal (CCl4 IP) para induzir a cirrose. Os animais foram divididos em dois subgrupos: controle (CCl4 IP-Co, n = 5), recebendo apenas fenobarbital em água potável, e experimental (CCl4 IP-Ex, n = 5), recebendo fenobarbital em água potável mais CCl4 IP. O fenobarbital foi aplicado como descrito acima. A cirrose foi induzida através de injeção IP de CCl4 (0.5 mL, diluídos 1:6 em óleo vegetal, às 22:00 a cada 4 dias por 14 semanas).(6)
3) LPVP para induzir hipertensão portal: Usamos o modelo de LPVP descrito em um estudo publicado em 1983.(7) Os animais foram divididos em dois subgrupos: controle (LPVP-Co, n = 5), submetidos a uma ligadura parcial fictícia da veia porta; e experimental LPVP-Ex, n = 5), submetidos à ligação. Resumidamente, os animais foram anestesiados e submetidos à laparotomia na linha mediana ventral e a veia porta foi isolada usando-se uma agulha de calibre 20, retirando-se delicadamente a agulha depois da ligadura. Ao se completar o procedimento, o peritônio e a parede abdominal estavam suturados.
4) LDB para induzir a cirrose biliar: Seguimos o modelo de cirrose biliar secundária à LDB descrito em um estudo publicado em 1985.(8) Os animais foram divididos em dois grupos: controle (LDB-Co, n = 5), submetido à LDB comum fictícia; e experimental (LDB-Ex, n = 5), submetido à LDB.

Os exames laboratoriais foram realizados no Laboratório Central do Complexo Hospitalar Santa Casa de Porto Alegre, e todos os outros procedimentos foram realizados no Laboratório de Fisiologia, Hepatologia e Estresse Oxidativos do Hospital das Clínicas da UFRGS em Porto Alegre.

Antes de todos os procedimentos cirúrgicos, os animais foram anestesiados com 2% de cloridrato de xilazina (50 mg/kg de peso corporal) e cloridrato de quetamina (100 mg/kg de peso corporal), ambos administrados intraperitonealmente. Após os procedimentos experimentais, os animais foram abrigados em gaiolas individuais por um período de duas semanas, quando foram sacrificados com uma overdose dos mesmos agentes anestésicos.

No dia do sacrifício, os animais foram anestesiados e amostras de sangue foram coletadas através do plexo retro-ocular.(9) Estas amostras de sangue foram usadas para a avaliação dos níveis séricos de aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT) e fosfatase alcalina (ALP), que são expressos em IU/L. Em seguida, a região abdominal foi depilada, uma laparotomia na linha mediana do ventral foi realizada, e coletou-se sangue da artéria aorta abdominal com o intuito de medir a troca gasosa do sangue arterial com um analisador ABL 700 (Radiometer, Copenhagen, Dinamarca). utilizando-se o método da iontoforese para se determinar o PaO2, a pressão parcial arterial de gás carbônico (PaCO2) e a saturação arterial de oxigênio (SaO2).

Depois que as amostras de sangue foram coletadas, os animais foram sacrificados como descrito acima. Os pulmões foram então dissecados e pesados para se determinar a relação entre peso do pulmão e peso corporal total (a chamada relação peso pulmonar/peso corporal) A parte anterior do lobo inferior direito foi então separada para a análise histológica, sendo o restante prontamente congelado em nitrogênio líquido e conservado a -80 ºC para análise posterior. O tecido congelado foi homogeneizado em tampão fosfato (KCl 140 mM, fosfato 20 mM, pH 7,4) usando-se um homogeneizador Ultra-Turrax (IKA Labortechnik, Staufen, Alemanha). A lipoperoxidação foi determinada através da determinação dos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (thiobarbituric acid reactive substances - TBARS)(10) e quimiluminescência.(11) A atividade da enzima antioxidante superóxido dismutase (SOD) foi determinada pela quantificação da oxidação da adrenalina em adrenocromo.(12)

As amostras para a análise histológica do tecido pulmonar foram coletadas e conservadas por 12 h em solução de formaldeído a 10%, depois transferidas para álcool a 70% e coradas com hematoxilina-eosina. O exame anatomopatológico foi realizado de forma duplo-cega por um patologista no Laboratório de Patologia do Hospital das Clínicas de Porto Alegre.

As médias e os erros padrão das médias foram calculados. Os dados foram analisados usando-se análise de variância. As comparações post hoc foram feitas usando-se o teste de Student Newman-Keuls O nível de significância estatística foi estabelecido em p < 0,05. O software Statistical Package for the Social Sciences, versão 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA) foi utilizado.

 

Resultados

Como pode ser observado na Tabela 1, existe uma diferença significante entre os grupos CCl4 IN-Co e CCl4 IN-Ex em termos de níveis séricos de ALT e ALP (mais elevado no grupo CCl4 IN-Ex; p < 0,05 para ambos), entre os grupos CCl4 IP-Co e CCl4 IP-Ex em termos de níveis séricos de AST e ALT (mais elevado no grupo CCl4 IP-Ex; p < 0,05 para ambos), e entre os grupos LDB-Co e LDB-Ex em termos de níveis séricos de AST e ALT (mais elevado no grupo LDB-Ex; p < 0,05 para ambos). Nenhuma diferença significante foi encontrada entre os grupos LPVP-Co e LPVP-Ex em termos de níveis séricos de AST e ALT ou ALP.

Para verificar as alterações nas trocas gasosas, realizamos uma gasometria (Tabela 1), na qual PaO2, PaCO2, SaO2 e o gradiente alvéolo-arterial de oxigênio foram analisados nos diferentes modelos e grupos. Houve uma diferença significativa entre os grupos CCl4 IN-Co e CCl4 IN-Ex em termos de PaO2 (p < 0,001). Nos modelos de CCl4 IP e LPVP não houve diferenças significantes entre os grupos controles e experimentais em termos de qualquer parâmetro gasométrico. Entretanto, houve diferenças significantes entre os grupos LDB-Co e LDB-Ex para PaO2, PaCO2 e SaO2 (p < 0,05 para todos), assim como para o gradiente alvéolo-arterial de oxigênio (p < 0,001).

Como mostramos na Tabela 2, não houve diferenças significativas entre os grupos controles e experimentais nos modelos CCl4 IN e LDB quanto à relação peso pulmonar/peso corporal (p < 0,05 para todos), apesar destas diferenças terem sido observadas nos modelos CCl4 IP ou LPVP.

 

 

A Tabela 3 mostra a lipoperoxidação, caracterizada pelos valores de TBARS, quimiluminescência e atividade de SOD. Nos modelos de CCl4 IN, CCl4 IP e LPVP, não houve diferenças significantes entre os grupos controles e experimentais. Entretanto, houve uma lipoperoxidação significativamente maior no grupo LDB-Ex que no grupo LDB-Co (p < 0,05). A atividade do SOD pulmonar foi significantemente maior no grupo CCl4 IN-Ex, CCl4 IP-Ex e LDB-Ex do que em seus grupos controles correspondentes (p < 0,05), apesar de não haver diferença entre os grupos LPVP-Ex e LPVP-Co.

Como pode ser observado na Figura 1, a análise histológica dos tecidos pulmonares dos animais em todos os grupos controles mostrou arquitetura normal do parênquima pulmonar e vasos com diâmetros normais. Apenas uma amostra de tecido pulmonar de um animal de um grupo controle é mostrada, já que os achados histológicos foram similares para todos os animais dos grupos controle. Os diâmetros dos vasos também estavam normais nos pulmões dos animais dos grupos experimentais dos modelos CCl4 IN, CCl4 IP e LPVP, apesar de diâmetros maiores terem sido observados no nos animais do grupo experimental do modelo de LDB.

 

Discussão

Neste estudo, quatro modelos experimentais foram utilizados, três envolvendo a indução de cirrose e um envolvendo a indução de hipertensão portal. O CCL4 é usado como indutor de cirrose, reduplicando com precisão anormalidades hemodinâmicas, com resistência vascular hepática aumentada; levando à hipertensão portal e impedindo trocas entre os sinusóides e os hepatócitos, todos quais são responsáveis pelo maior dano hepático na cirrose.(13,14) O modelo CCL4 combina a inalação do CCL4 com a administração de fenobarbital na água potável, o que acelera o processo metabólico ao aumentar a atividade do sistema citocromo P450, levando ao desenvolvimento da cirrose, com esplenomegalia e ascite acentuada, esta última sendo uma característica proeminente de falência crônica do fígado durante a cirrose.(6,15) No presente estudo, os níveis séricos de AST, ALT e ALP encontravam-se mais elevados nos animais dos grupos experimentais do que em seus respectivos grupos controles para ambos os modelos de CCL4, indicando uma perda de integridade hepática nos animais dos grupos CCL4 IN-Ex e CCL4 IP-Ex, já que os elevados níveis séricos destas enzimas estão diretamente relacionadas a lesão celular e necrose em atividade das células hepáticas.

Pacientes com hipertensão portal desenvolvem maior fluxo de sangue para o estômago. As descobertas fisiológicas que se correlacionam com a piora da gastropatia hipertensiva portal incluem gradiente de pressão venosa portal aumentado e fluxo sanguíneo hepático diminuído. Com uma prevalência de 80% dos casos, a hipertensão portal está diretamente relacionada à duração da lesão hepática e à extensão da gastropatia.(16) No presente estudo, os níveis séricos de AST, ALT e ALP eram normais nos animais dos grupos LPVP-Ex e LPVP-Co, indicando a falta de alterações hepáticas. Isto pode ser explicado pelo fato de que a LPVP é um modelo de hipertensão portal, que pode ser uma complicação da cirrose hepática, e não um modelo de cirrose em si. Estes achados corroboram os de um estudo prévio envolvendo um modelo animal de hipertensão portal.(17) A cirrose hepática foi observada em animais dos grupos experimentais de todos os modelos, com exceção do modelo de LPVP.

Encontramos níveis séricos de ALT, AST e ALP mais altos no grupo LDB-Ex que no grupo LDB-Co. Na maioria dos pacientes com cirrose biliar secundária, o dano hepático e ao sistema biliar resultante da obstrução biliar produz hiperbilirrubinemia, níveis mais altos de ALP e de aminotransferase. Os níveis elevados destas enzimas são, em grande parte, atribuídos à necrose de tecidos ricos em aminotransferase, bem como à colestase provocada por este modelo.(18) Nossos achados demonstram o acometimento hepático produzido nos animais submetidos a este modelo.

No modelo LDB, a relação peso pulmonar/peso corporal foi maior no grupo LDB-Ex que no grupo LDB-Co. Um estudo animal mostrou um aumento posterior à LDB nos diâmetros das arteríolas.(19) No presente estudo, a diferença na relação peso pulmonar/peso corporal provavelmente se deveu ao shunt e à dilatação vascular intrapulmonar causados pelo acúmulo de sangue no órgão.

A avaliação da gasometria é um indicador usado para facilitar o diagnóstico do SHP. Na maioria dos pacientes cirróticos, PaO2 é <80 mmHg, SaO2 é <92%, e PaCO2 é ≈30 mmHg.(20) Em nosso estudo, demonstramos diferenças significativas entre os grupos experimentais e controles em termos destes parâmetros. Estudos experimentais mostraram que animais controle apresentam valores de PaO2 de 90-99 mmHg e valores de PaCO2 de 40 mmHg,(21,22) valores comparáveis àqueles observados nos animais do grupo CCL4 IN-Co avaliados no presente estudo. Observamos que PaO2 e SaO2 foram significativamente mais baixos no grupo CCL4 IN-Ex que no grupo CCL4 IN-Co, enquanto o PaCO2 foi mais alto, mesmo não significativamente. Estas alterações provavelmente se devem ao potencial tóxico do CCL4 inalatório no sistema respiratório. O modelo LPVP não foi associado a anormalidades na difusão pulmonar,(23) como demonstrado em nosso estudo. Observamos diferenças significativas entre os grupos LDB-Ex e LDB-Co em termos de achados gasométricos, demonstrando que animais com cirrose biliar secundária apresentam hipoxemia. Esta hipoxemia pode ser associada com a translocação bacteriana que a LDB causa em 45-75% dos animais cirróticos, nos quais o dano hepatocelular induzido pelo LDB impede a filtração adequada do sangue, promovendo o desenvolvimento de shunts portossistêmicos e uma queda dramática na capacidade fagocítica do fígado, permitindo a entrada de bactérias e endotoxinas na circulação pulmonar. Nesta situação, o pulmão filtra o sangue, compensando pela queda da função fagocítica do fígado. Durante a fagocitose, a ativação de inúmeros macrófagos resulta na secreção de produtos como citocinas e ácido nítrico no meio extracelular, sendo o ácido nítrico um potente vasodilatador e também envolvido nos mecanismos de desequilíbrio dos sistemas antioxidantes e oxidantes.(24) O ácido nítrico funciona como um sinalizador molecular (mediando a vasodilatação quando produzido em baixas concentrações pelo óxido nítrico sintetase em macrófagos no processo inflamatório), então promovendo a vasodilatação intrapulmonar seguida de hipoxemia.(25)

Vários autores relataram que, na presença de cirrose, há um aumento considerável da lipoperoxidação devido à formação de espécies reativas do oxigênio.(26) Nos modelos experimentais, este fenômeno também ocorre, levando a alterações morfológicas envolvendo o retículo endoplasmático dos hepatócitos. No modelo de CCL4, estas alterações originam-se do metabolismo do próprio agente tóxico CCL4, que é metabolizado nos radicais livres triclorometil e triclorometil-peroxil, radicais lesivos que podem iniciar o processo de lipoperoxidação.(27)

Apesar de a peroxidação hepática ser amplamente descrita em modelos de cirrose induzida por CCL4, bem como os modelos de hipertensão portal induzida pela LPVP, o mesmo não observado em tecidos pulmonares.(6,15,17) Entretanto, no presente estudo, observou-se que a atividade do SOD estava alterada nos homogeneizados de amostras de tecido pulmonar coletados dos animais dos grupos CCL4 IN-Ex e LDB-Ex.

No modelo de cirrose induzida por CCL4, alterações nos gases arteriais e níveis elevados de atividade do SOD foram observados, possivelmente como uma defesa contra dano oxidativo causado pela inalação do CCL4. Entretanto, estas alterações não são características da SHP, já que o CCL4 inalatório tem efeitos tóxicos nos pulmões e rins que são aumentados pela alta concentração arterial da droga, que promove sua passagem através dos pulmões, através da circulação pulmonar em direção ao átrio esquerdo.(28)

No presente estudo, os animais submetidos à LDB apresentaram lipoperoxidação significantemente mais alta (níveis mais altos de TBARS e quimiluminescência) que seus controles correspondentes. Este achado pode ser associado com produção aumentada dos radicais livres, já que a translocação bacteriana e a migração fagocítica para o tecido pulmonar aumenta a geração de superóxido capazes de oxidar a membrana plasmática, gerando uma grande quantidade de espécies reativas do oxigênio. É possível que, em resposta a este dano, houve um aumento da atividade de SOD endógeno, que tem um papel importante no equilíbrio da oxido-redução celular, uma vez que catalisa os radicais livres gerados em uma tentativa de proteger o tecido contra lesões.

Entre os vários modelos clássicos de cirrose experimental e hipertensão portal, o modelo de cirrose induzida por LDB parece ser o mais útil para o estudo da SPH, uma vez que promove cirrose verdadeira e altera todos os parâmetros de troca gasosa arterial, aumenta a lipoperoxidação e a defesa antioxidante do SOD.

 

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Endereço para correspondência:
Norma Possa Marroni
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Recebido para publicação em 20/6/2007
Aprovado, após revisão, em 3/10/2007

 

 

Apoio Financeiro: Este estudo foi financiado pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), e pelo Fundo de Incentivo à Pesquisa e Eventos do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (FIPE-HCPA).
* Trabalho realizado no Hospital de Clinicas de Porto Alegre, Porto Alegre, Brasil.