Pesquisa da mutação F508del como primeiro passo no diagnóstico molecular de fibrose cística^*

Resumos

OBJETIVO:

Verificar a importância da detecção da mutação F508del no gene cystic fibrosis transmembrane conductance regulator como primeiro passo no diagnóstico genético de fibrose cística (FC), associando-se o genótipo com várias variáveis clínicas.

MÉTODOS:

Foram avaliados 180 pacientes com FC quanto à mutação F508del. As variáveis clínicas foram obtidas dos prontuários médicos dos pacientes e de entrevistas com seus pais ou responsáveis.

RESULTADOS:

Dos 180 pacientes estudados, 65 (36,1%) não apresentavam a mutação F508del (grupo 0 [G0]), 67 (37,2%) eram heterozigotos (grupo 1 [G1]), e 48 (26,7%) eram homozigotos (grupo 2 [G2]). Todos os três grupos mostraram associações com as variáveis clínicas. A homozigose associou-se a pacientes mais jovens, menor idade ao diagnóstico e menor idade no primeiro isolamento de Pseudomonas aeruginosa (PA), bem como maior prevalência de insuficiência pancreática (IP) e colonização por PA não mucoide (PANM). Na comparação com os pacientes G1+G2, os pacientes G0 eram mais velhos, com início de sintomas clínicos, doença digestiva e doença pulmonar mais tardio, diagnóstico tardio, PA isolada tardiamente, e menor prevalência de IP, íleo meconial e colonização por PANM, PA mucoide e Burkholderia cepacia. Nos pacientes G1, os valores foram intermediários para idade ao diagnóstico, idade no primeiro isolamento de PA, idade no início de doença pulmonar e de manifestações clínicas, colonização por PAM e OR para IP.

CONCLUSÕES:

A identificação de F508del em 63,9% dos pacientes estudados mostrou que ela pode ser uma ferramenta útil como primeiro passo no diagnóstico genético de FC. O genótipo F508del foi associado à gravidade clínica da doença, particularmente às variáveis relacionadas com o início da doença.

Fibrose cística; Regulador de Condutância Transmembrana em Fibrose Cística; Genótipo; Mutação

OBJECTIVE:

To determine the relevance of screening for the F508del mutation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene as a first step in the genetic diagnosis of cystic fibrosis (CF) by associating the genotype with various clinical variables.

METHODS:

We evaluated 180 CF patients regarding the F508del mutation. The clinical data were obtained from the medical records of the patients and from interviews with their parents or legal guardians.

RESULTS:

Of the 180 patients studied, 65 (36.1%) did not carry the F508del mutation (group 0 [G0]), 67 (37.2%) were F508del heterozygous (G1), and 48 (26.7%) were F508del homozygous (G2). All three groups showed associations with the clinical variables. Homozygosis was associated with younger patients, younger age at CF diagnosis, and younger age at the first isolation of Pseudomonas aeruginosa (PA), as well as with higher prevalence of pancreatic insufficiency (PI) and non-mucoid PA (NMPA) colonization. In comparison with G1+G2 patients, G0 patients were older; first experienced clinical symptoms, digestive disease, and pulmonary disease at an older age; were older at CF diagnosis and at first PA isolation; and had a lower prevalence of PI and meconium ileus, as well as of colonization by NMPA, mucoid PA, and Burkholderia cepacia. In G1 patients, values were intermediate for age at CF diagnosis; age at first PA isolation, first pulmonary symptoms, and first clinical manifestations; MPA colonization; and OR for PI.

CONCLUSIONS:

The identification of F508del in 63.9% of the patients studied showed that this can be a useful tool as a first step in the genetic diagnosis of CF. The F508del genotype was associated with clinical severity of the disease, especially with the variables related to CF onset.

Cystic Fibrosis; Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator; Genotype; Mutation

Introdução

A fibrose cística (FC) é a doença genética letal mais comum na infância em populações caucasianas.^{( 1 )} A doença é causada por mutações do gene cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR, regulador de condutância transmembrana da fibrose cística), que codifica a proteína de mesmo nome.^{( 2 - 4 )} Cerca de 2.000 mutações causadoras de doenças foram encontradas no gene CFTR.^{( 5 )} Essas mutações são classificadas em seis classes de acordo com a ausência de alterações ou alterações qualitativas e quantitativas na proteína CFTR.^{( 6 )}

A mais comum mutação do gene CFTR é uma deleção de três nucleotídeos que resulta na ausência do aminoácido 508 da proteína CFTR, que normalmente tem 1,480 aminoácidos. Essa mutação, a qual falta um único códon de fenilalanina, é comumente designada F508del (c.1521_1523delCTT para se referir à mutação do DNA e F508del para se referir à proteína mutante). Em todo o mundo, a principal mutação do gene CFTR é a F508del, cuja prevalência varia de 30% a 80%. Em populações caucasianas, a mutação F508del é encontrada em aproximadamente 70-88% dos alelos em pacientes com FC.^{( 5 , 7 )} Os demais 12-30% dos alelos compreendem as outras 2.000 diferentes mutações, cada qual apresenta, individualmente, uma frequência muito baixa (poucas mutações apresentam frequência acima de 0,1% em todo o mundo, mas algumas podem apresentar elevada prevalência em populações selecionadas).^{( 5 , 8 , 9 )}

A variabilidade da gravidade da FC está associada principalmente a fatores genéticos, tais como genes modificadores e classes de mutações do gene CFTR, bem como a fatores ambientais. ^{( 9 - 15 )} A mutação F508del é uma mutação classe II (que resulta em proteínas CFTR dobradas/processadas incorretamente) e está associada a FC de maior gravidade clínica.^{( 9 )}

Na maioria dos países, atualmente não é possível identificar todo o espectro de mutações do gene CFTR. Juntamente à triagem neonatal que utiliza o teste de tripsinogênio imunorreativo, o sistema público de saúde brasileiro tem atualmente auxiliado na investigação de mutações do gene CFTR. No entanto, por causa dos custos, apenas uma mutação é investigada. Portanto, estudos sobre a investigação da mutação F508del são necessários e importantes, pois se trata do único teste que pode ser realizado atualmente na maioria dos países. Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi verificar a importância da investigação da mutação F508del como primeiro passo para o diagnóstico genético de FC, associando-se o genótipo F508del a 28 variáveis clínicas.

Métodos

Trata-se de um estudo transversal realizado em um centro universitário de FC entre 2010 e 2011. O diagnóstico de FC foi confirmado por duas dosagens de sódio e cloro no suor (concentrações > 60 mEq/L) em todos os pacientes. Foram selecionados 215 pacientes para o estudo. Desses, 35 foram excluídos porque faltavam dados clínicos ou porque o termo de consentimento livre e esclarecido não havia sido assinado.

Usamos o método do fenol/clorofórmio para a extração do DNA, e, em todas as análises genéticas, a concentração do DNA foi de 50 ng/mL, determinada por meio de um espectrofotômetro (NanoVue(tm); GE Healthcare Biosciences, Pittsburgh, PA, EUA).

A presença da mutação F508del foi determinada por meio de PCR com um par de iniciadores - senso (5'-GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC-3') e antissenso (5'-TGG CAT GCT TTG ATG ACG C-3') - resultando em um fragmento de 74 pb (homozigose para F508del), um fragmento de 77 pb (ausência de F508del) ou presença de ambos os fragmentos (heterozigose para F508del). O procedimento de ciclagem térmica consistiu em desnaturação inicial a 94ºC durante 5 min, seguida de desnaturação a 94ºC durante 1 min, anelamento a 53,5ºC durante 1 min e extensão a 72ºC durante 1 min, repetidos durante 35 ciclos e seguidos de uma extensão final a 72ºC durante 10 min. A PCR continha 25 µL de uma solução com 50 ng de DNA, 1 µM de cada iniciador, 200 µM de dNTP, 1,0 mM de MgCl₂, 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 8,4 a 25ºC ) e 1,5 U de Taq DNA polimerase. Após a adição de 5 µL de tampão de carga à base de glicerol, 10 µL do produto da reação foram aplicados sobre gel de acrilamida.^{( 16 )}

A presença de mutações do gene CFTR foi determinada no laboratório de genética molecular da instituição por meio do método RFLP (G542X, R1162X, R553X, G551D e N1303K). Algumas mutações foram obtidas por sequenciamento ou multiplex ligation-dependent probe amplification: S4X, 2183A>G, 1717-G>A e I618T. Para ambos os métodos, usamos o sequenciador de DNA MegaBace1000 (GE Healthcare Biosciences).^{( 16 )}

Foram coletados dados clínicos e variáveis antropométricas, além de resultados de função pulmonar e de cultura de escarro ou swab de orofaringe.

Foram investigadas as seguintes variáveis clínicas: escores clínicos (escore de Shwachman-Kulczycki, Kanga e Bhalla)^{( 17 )}; índice de massa corporal (IMC) - para os pacientes com mais de 19 anos, usamos a fórmula IMC = peso/(altura)²; para os demais pacientes, usamos WHO Anthro, versão 3.0.1, e WHO Anthro Plus, versão 1.0.2, respectivamente, para crianças com menos de 5 anos de idade e para aqueles com 5-19 anos de idade; idade (dicotomizada em ≤ 154 meses e > 154 meses); idade no momento do diagnóstico (dicotomizada em ≤ 24 meses e > 24 meses); idade no momento em que apareceram os primeiros sintomas digestivos (dicotomizada em ≤ 3 meses e > 3 meses); idade no momento em que apareceram os primeiros sintomas pulmonares (dicotomizada em ≤ 6 meses e > 6 meses ); idade no momento em que Pseudomonas aeruginosa foi isolada pela primeira vez (dicotomizada em ≤ 30 meses e > 30 meses); colonização das vias aéreas (P. aeruginosa mucoide [PAM], P. aeruginosa não mucoide [PANM], Achromobacter xylosoxidans, Burkholderia cepacia e Staphylococcus aureus); SaO₂ transcutânea; resultados de espirometria; comorbidades - pólipos nasais, osteoporose, íleo meconial (IM), diabetes mellitus e insuficiência pancreática (IP).

Todos os escores foram determinados por dois pneumologistas pediátricos, e, em caso de discordância, um terceiro especialista era convidado a analisar os escores para determinar os resultados finais.

Todos os pacientes com idade ≥ 7 anos foram submetidos a espirometria com um espirômetro CPFS/D (MedGraphics, Saint Paul, MN, EUA). Os dados foram registrados por meio do programa Breeze PF, versão 3.8B para Windows 95/98/NT (Medical Graphics Corp., Saint Paul, MN, EUA), e foram incluídas as seguintes variáveis: CVF, em % do previsto; VEF₁, em % do previsto; relação VEF₁/CVF, em % do previsto; FEF_25-75%.

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas (Protocolo nº 528/2008).

Para fins de análise estatística, as variáveis que não apresentaram distribuição normal (idade no momento do diagnóstico, idade no momento em que surgiram os primeiros sintomas pulmonares e digestivos e idade no momento em que P. aeruginosa foi isolada pela primeira vez) foram divididas em dois grupos; para tal, o valor mediano de cada variável foi usado como ponto de corte. Os dados categorizados pela mediana foram divididos em duas coortes de tamanho amostral semelhante.

Para a avaliação clínica dos escores, da SaO₂ e dos testes espirométricos, as análises foram realizadas sem ajustar os dados.

As bactérias isoladas das vias aéreas dos pacientes foram usadas como marcadores de acordo com a presença ou ausência de bactérias específicas em três culturas consecutivas no ano anterior.

As comorbidities foram comparadas quanto a sua presença ou ausência.

As análises estatísticas foram realizadas com o programa Statistical Package for the Social Sciences, versão 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA).

A fim de evitar dados espúrios em virtude do problema de testes múltiplos,^{( 18 )} o nível de significância α foi ajustado pela correção de Bonferroni para três grupos: G0, sem a mutação F508del (pacientes sem F508del nos dois alelos ou aqueles cuja mutação do gene CFTR não pôde ser determinada); G1, mutação F508del heterozigótica (pacientes com a mutação F508del em um dos alelos, com ou sem outra mutação do gene CFTR) e G2, mutação F508del homozigótica (pacientes com F508del em ambos os alelos).

O poder estatístico da amostra foi calculado com o programa gratuito G*Power, versão 3.0.5,^{( 19 )} que mostrou um poder estatístico superior a 80% para a análise realizada e α = 0,05 com uma população de 159 pacientes com FC.

Os dados foram comparados por meio de ANOVA para um fator, teste de Kruskal-Wallis, teste U de Mann-Whitney e teste do qui-quadrado de Pearson. Para as comparações entre os genótipos e as variáveis com distribuição numérica, o teste de Kruskal-Wallis foi usado para genótipos F508del, e o teste de Mann-Whitney foi usado para os grupos F508del. Para as variáveis categóricas, usamos o teste do qui-quadrado de Pearson e ORs.

Resultados

Os dados numéricos e categóricos das variáveis clínicas em 180 pacientes com FC são apresentados na Tabela 1. A distribuição dos pacientes nos grupos (G0, G1 e G2) foi de 65 (36,1%), 67 (37,2%) e 48 (26,7%), respectivamente. Constatamos que a população não estava em equilíbrio de Hardy-Weinberg no tocante à mutação F508del (p < 0,001). A distribuição dos pacientes de acordo com o genótipo de mutação do gene CFTR é mostrada na Tabela 2.

Tabela 1
Características dos pacientes incluídos no estudo (n = 180).ª

Variável		Resultado
Homens		50,00
Idade, anos		17,72 ± 15,75 (0,60-24,00)
Caucasoides		91,70
Peso baixo e peso extremamente baixo		22,47
Identificação de um alelo F508del		37,20
Identificação de dois alelos F508del		26,70
Idade no momento das primeiras manifestações clínicas, anos		2,90 ± 8,88 (0,00-13,00)
Idade no momento do diagnóstico, anos		7,62 ± 13,63 (0,00-14,23)
Idade no momento dos primeiros sintomas digestivos, anos		3,39 ± 9,11 (0,00-12,45)
Idade no momento dos sintomas pulmonares, anos		2,90 ± 9,89 (0,00-13,00)
SaO2, %		94,92 ± 4,26 (66,00-99,00)
Escore de Bhalla		8,74 ± 5,72 (0,00-25,00)
Escore de Kanga		18,85 ± 5,84 (10,00-40,00)
Escore de Shwachman-Kulczycki		65,85 ± 16,77 (20,00-95,00)
CVF, % do previsto		79,29 ± 23,55 (19,00-135,00)
VEF1, % do previsto		71,29 ± 27,47 (17,00-132,00)
VEF1/CVF, % do previsto		83,46 ± 15,95 (37,00-137,00)
FEF25-75%		59,05 ± 35,55 (7,00-150,00)
Pólipos nasais		18,64
Diabetes mellitus		18,64
Osteoporose		16,38
Insuficiência pancreática		79,90
Íleo meconial		15,08
Idade no momento do primeiro isolamento de Pseudomonas aeruginosa, anos		8,55 ± 14,45 (2,00-15,00)
Colonizaçãob
	P. aeruginosa	56,42
	P. aeruginosa mucoide	42,46
	Burkholderia cepacia	13,97
	Achromobacter xylosoxidans	10,05
	Staphylococcus aureus	78,77

• ^ª
  Valores expressos em % ou média ± dp (variação).
• ^b
  Colonização positiva baseada em três culturas respiratórias positivas consecutivas no ano anterior

Tabela 2
Genótipo cystic fibrosis transmembrane conductance regulator de acordo com o grupo de mutação F508del.

			Paciente
Grupo de mutação F508del		Genótipo de mutação do gene CFTR	n	%	% por grupo
G0		-/-	43	23,9	36,1
		G542X/-	5	2,8
		G542X/R1162X	1	0,6
		G542X/I618T	1	0,6
		G542X/2183A>G	1	0,6
		G542X/2183AA→G	1	0,6
		G542X/P205S	1	0,6
		G542X/R334W	1	0,6
		I507V/-	1	0,6
		R334W/R1066C	1	0,6
		R334W/R334W	1	0,6
		3120+1G>A/3120+1G>A	1	0,6
		3120+1G>A/-	1	0,6
		TG11-5T/-	1	0,6
		622-2A>G/711+1G>T	1	0,6
		R1162X/R1162X	1	0,6
		R1162X/-	1	0,6
		D110H/V232H	1	0,6
G1		F508del/-	40	22,2	37,2
		F508del/G542X	13	7,2
		F508del/R1162X	5	2,8
		F508del/N1303K	4	2,2
		F508del/R553X	2	1,1
		F508del/S4X	1	0,6
		F508del/1717-1G>A	1	0,6
		F508del/duplicação do éxon 6B-16	1	0,6
		F508del/2184insA	1	0,6
G2		F508del/F508del	48	26,7	26,7

• G0: F508del ausente; G1: pacientes heterozigotos para F508del; e G2: pacientes homozigotos para F508del

A respeito das variáveis numéricas, a SaO₂ e o escore de Shwachman-Kulczycki foram significativamente maiores no G1 e no G2 do que no G0 (p = 0,034 e p = 0,046, respectivamente; Tabela 3).

Tabela 3
Variáveis numéricas significativamente diferentes nos grupos estudados.*

Variável	Grupo (genótipo)	Mediana	Média	dp	p
Escore de Shwachman-Kulczycki	G0	95	93,38	5,935	0,046
	G1+G2	96	95,50	2,869
SaO2	G0	60	61,40	17,844	0,034
	G1+G2	65	67,91	15,893

• ^*
  G0: F508del ausente; G1: pacientes heterozigotos para F508del; e G2: pacientes homozigotos para F508del. Teste U de Mann-Whitney

A respeito das variáveis categóricas clínicas, os pacientes do G2 associaram-se a menor idade em geral (p ≤ 0,001), menor idade no momento do diagnóstico de FC (p < 0,001), menor idade no momento em que P. aeruginosa foi isolada pela primeira vez (p = 0,009) e maior prevalência de IP (p = 0,001) e PANM (p = 0,025; Tabela 4). Na comparação com os pacientes do G1+G2, os pacientes do G0 eram mais velhos (p < 0,001), eram mais velhos quando apresentaram os primeiros sintomas clínicos (p < 0,001), eram mais velhos quando apresentaram doença digestiva (p = 0,023), eram mais velhos quando apresentaram doença pulmonar (p = 0,006), eram mais velhos no momento do diagnóstico de FC (p < 0,001), apresentavam menor prevalência de IP (p < 0,001), apresentavam menor prevalência de IM (p = 0,047), eram mais velhos quando P. aeruginosa foi isolada pela primeira vez (p = 0,001) e apresentaram menor prevalência de colonização por PANM (p = 0,025), PAM (p = 0,068) e B. cepacia (p = 0,001; Tabela 4). Foram encontrados valores intermediários nos pacientes do G1: idade no momento do diagnóstico de FC (p < 0,001), idade no momento em que P. aeruginosa foi isolada pela primeira vez (p = 0,001), idade no momento em que ocorreram os primeiros sintomas pulmonares (p = 0,006), idade no momento em que ocorreram as primeiras manifestações clínicas (p < 0,001), colonização por PAM (p = 0,068) e OR para IP (p < 0,001).

Tabela 4
Variáveis categóricas significativamente diferentes nos grupos estudados.*

Grupo	Variável	Categorização		p	OR	IC95%	Variável	Categorização		p	OR	IC95%CI
	Idade	≤ 154 m	> 154 m				Idade nas primeiras manifestações clínicas	≤ 3 m	> 3 m
G0		18	46	< 0,001	0,238	0,121-0,457		19	37	< 0,001	0,239	0,119-0,47
G1		36	31		1,202	0,654-2,217		48	18		2,974	1,539-5,884
G2		37	11		4,754	2,263-10,53		30	18		1,366	0,689-2,749
	Idade no diagnóstico	≤ 24 m	> 24 m				Idade na doença digestiva	≤ 3 m	>3 m
G0		15	44	< 0,001	0,157	0,007-0,315		13	27	0,023	0,362	0,165-0,77
G1		41	23		1,95	1,034-3,725		37	25		1,852	0,958-3,615
G2		36	12		3,563	1,715-7,74		26	22		1,227	0,615-2,464
	Idade na doença pulmonar	≤ 6 m	> 6 m				IP	Presença	Ausência
G0		20	32	0,006	0,385	0,179-0,704		35	29	< 0,001	0,08	0,03-0,192
G1		44	21		2,258	1,181-4,391		62	5		4,71	1,817-14,35
G2		28	20		1,158	0,586-2,312		46	2		7,007	2,136-51,37
	IM	Presença	Ausência				Idade no primeiro isolamento de PA	≤ 3 m	> 3 m
G0		5	60	0,047	0,335	0,108-0,892		9	26	0,001	0,229	0,093-0,535
G1		13	54		1,569	0,683-3,576		30	25		1,263	0,627-2,552
G2		10	38		1,662	0,682-3,906		28	13		2,794	1,29-6,248
	PAM	Presença	Ausência				PANM	Presença	Ausência
G0		21	44	0,068	0,553	0,2731-0,984		28	37	0,025	0,438	0,233-0,814
G1		35	32		1,914	1,034-3,56		41	26		1,39	0,752-2,593
G2		20	28		0,97	0,491-1,898		32	16		1,82	0,916-3,702
	BC	Presença	Ausência
G0		4	61	0,101	0,313	0,088-0,91
G1		12	55		1,83	0,757-4,426
G2		8	40		1,447	0,548-3,618

• ^*
  m: meses; G0: F508del ausente; G1: pacientes heterozigotos para F508del; G2: pacientes homozigotos para F508del; IM: íleo meconial; PA: Pseudomonas aeruginosa; PAM: colonização por PA mucoide; BC: colonização por Burkholderia cepacia; IP: insuficiência pancreática; e PANM: colonização por PA não mucoide. Teste do qui-quadrado

A Tabela 5 mostra a associação das principais variáveis com o genótipo F508del.

Tabela 5
Variáveis significativamente associadas ao genótipo cystic fibrosis transmembrane conductance regulator de acordo com os grupos de mutação F508del.*

Variável clínica		Genótipo	G2 vs. G0+G1	G0 vs. G1+G2
		p	p	p
Sexo		0,473	0,400	1
Etnia		0,353	0,549	0,407
Idade		< 0,001	< 0,001	< 0,001
Idade no momento das primeiras manifestações clínicas		< 0,001	0,394	< 0,001
Idade no momento do diagnóstico		< 0,001	0,001	0,01
Aparecimento de sintomas digestivos		0,022	0,602	< 0,001
Aparecimento de sintomas pulmonares		0,006	0,731	0,004
IMC		0,227	0,22	0,186
Escore de Bhalla		0,163	0,283	0,06
Escore de Kanga		0,509	0,466	0,264
Escore de Shwachman-Kulczycki		0,098	0,889	0,046
SaO2		0,068	0,076	0,034
CVF, % do previsto		0,514	0,368	0,29
VEF1, % do previsto		0,321	0,054	0,383
VEF1/CVF, % do previsto		0,49	0,232	0,596
FEF25-75%		0,29	0,27	0,132
Pólipos nasais		0,521	0,516	0,842
Diabetes mellitus		0,948	1	0,842
Osteoporose		0,236	0,255	0,139
Insuficiência pancreática		< 0,001	0,001	< 0,001
Íleo meconial		0,047	0,238	0,016
Primeiro isolamento de Pseudomonas aeruginosa		0,001	0,009	0,001
Colonização
	P. aeruginosa	0,025	0,092	0,012
	P. aeruginosa mucoide	0,068	1	0,059
	Burkholderia cepacia	0,332	0,46	0,04
	Achromobacter xylosoxidans	0,101	0,261	0,301
	Staphylococcus aureus	0,758	1	0,572

• ^*
  G0: F508del ausente; G1: pacientes heterozigotos para F508del; G2: pacientes homozigotos para F508del; e IMC: índice de massa corporal. ANOVA de Kruskal-Wallis para um fator (dados numéricos) e qui-quadrado de Pearson (dados categóricos)

Discussão

O uso de genética molecular na prática clínica tem melhorado, e é considerado importante em vários aspectos relacionados à assistência ao paciente. A técnica molecular é essencial para o diagnóstico de FC, especialmente nos casos em que haja dúvidas, isto é, quando o paciente apresenta sintomas de FC não confirmados por testes de suor, quando os sintomas de FC aparecem na vida adulta, em casos de FC atípica e quando a FC é causada por mutações do gene CFTR pertencentes à classe IV, V ou VI. Em pacientes com FC com variabilidade clínica, a análise genética pode melhorar a compreensão da doença e promover terapias específicas e melhor tratamento ambulatorial.

Os testes moleculares não estão disponíveis em nosso sistema público de saúde; no entanto, centros ligados a universidades investigam as principais mutações do gene CFTR. Dentre as mutações do gene CFTR, a investigação da mutação F508del é realizada rotineiramente em nosso centro de pesquisa em todos os pacientes com dois testes de sódio e cloro no suor com valores acima de 60 mEq/L. A investigação da mutação F508del não é cara e permite o diagnóstico definitivo em 26,7% dos pacientes em nosso centro, 37,2% dos quais são identificados como heterozigotos. Nosso estudo mostrou que a identificação da mutação F508del é importante em um país com grande diversidade étnica, pois 63,9% de nossos pacientes apresentaram pelo menos um alelo F508del. Portanto, a investigação da mutação F508del no sistema público de saúde é necessária e deve ser implantada em todos os países em desenvolvimento. A identificação da mutação F508del permite melhor aconselhamento genético.

No estado de São Paulo, a triagem neonatal de FC por meio da dosagem do tripsinogênio imunorreativo é possível desde 2010. A triagem neonatal e a dosagem de cloro/sódio no suor são gratuitas para todos os pacientes. Nossa clínica recebe cerca de 30 dólares/paciente do governo para a investigação de mutações do gene CFTR. Esse valor nos permite realizar apenas a investigação da mutação F508del. A identificação de mutações adicionais é feita por projetos de pesquisa financiados. O principal objetivo do presente estudo foi avaliar a importância da identificação da mutação F508del em nossos pacientes, em virtude da atual emenda para a triagem neonatal pública no Brasil, que fornece subsídios para a análise molecular a fim de identificar casos positivos em pacientes neonatais, bem como estudos sobre novas drogas para FC.

Em nosso estudo, foram analisadas 28 variáveis clínicas que foram associadas à mutação F508del. Associações com a mutação F508del foram encontradas principalmente nas variáveis relacionadas ao aparecimento da doença. Em nosso estudo, nenhum paciente foi diagnosticado por triagem neonatal. Portanto, a associação entre o genótipo F508del e as variáveis relacionadas ao aparecimento da doença, tais como a idade no momento em que surgiram os primeiros sintomas clínicos e a idade no momento do diagnóstico, deve estar relacionada com a gravidade clínica, e não com o diagnóstico, tratamento e acompanhamento dos pacientes.

Com a inclusão de um programa de triagem neonatal de FC no estado de São Paulo em 2010, a investigação da mutação F508del tornou-se importante como um meio de prever as manifestações clínicas da FC, permitindo melhor monitoramento dos pacientes em nossa clínica de saúde.

Os pacientes do G0 apresentaram um risco menor de manifestações clínicas precoces de FC e um fator protetor para algumas das variáveis estudadas (idade, idade no momento do diagnóstico de FC, primeiros sintomas clínicos, doenças digestivas e pulmonares, IM e idade no momento do primeiro isolamento de P. aeruginosa). Além disso, houve um fator de proteção contra colonização por PAM, PANM e B. cepacia, que é um importante fator de risco de doença pulmonar. Corroborando a literatura, IP foi menos comum no G0 do que em G1/G2 em nosso estudo.

Os pacientes do G2 eram mais jovens, eram mais jovens quando receberam o diagnóstico de FC, eram mais jovens quando P. aeruginosa foi isolada pela primeira vez e mais comumente receberam diagnóstico de IP.

Algumas das variáveis estudadas foram significativamente diferentes no G1 em relação ao G0 e ao G2 (idade no momento da primeira manifestação clínica, idade no momento do início da doença pulmonar e colonização por PAM). Além disso, a IP e a idade no momento do diagnóstico de FC apresentaram resultados intermediários.

Na análise de agrupamentos de genes quanto às variáveis com dados numéricos, os pacientes do G1 e do G2 apresentaram SaO₂ e escores de Shwachman-Kulczycki significativamente maiores. Maiores valores para essas variáveis estão associados a doença menos grave; no entanto, esses pacientes eram mais jovens, e isso está associado à variação do escore de Shwachman-Kulczycki e da SaO₂.

Ao medir os fatores de risco para sobrevivência em longo prazo em um grupo de pacientes com FC mais velhos (> 40 anos de idade), um grupo de autores relatou que a atividade residual da CFTR não foi um fator associado ao aumento da expectativa de vida, mas sim a outros fatores, como o IMC.^{( 20 )} A maior importância da mutação F508del e de sua identificação está associada ao aparecimento da doença. No presente estudo, os marcadores de gravidade inicial da fisiopatologia associaram-se mais evidentemente ao genótipo F508del do que o fizeram outras variáveis clínicas. ^{( 20 )} Portanto, acreditamos que o genótipo tem maior importância no aparecimento da doença e que o ambiente progressivamente se torna um fator de risco maior à medida que a idade avança. Além disso, acreditamos que a seleção de sobrevivência esteja relacionada à classe da mutação do gene CFTR.

Outro fato que sublinha a importância da investigação da F508del é que essa mutação é a mais comumente estudada, e o uso de novas drogas tem se concentrado em pacientes com essa mutação, o que poderia favorecer seu tratamento. O estudo de corretores de F508del-CFTR depende do uso de cicerones farmacológicos que estabilizam a proteína em seu estado nativo, de células-alvo com reguladores de proteostase para aumentar a eficiência de dobragem da proteína ou de ambos ao mesmo tempo. Embora tenham sido criados corretores de estabilização e dobragem de F508del-CFTR, é preciso conhecer todo o mecanismo de ação dessas drogas antes de usá-las em nossa prática clínica. Os esforços atuais para identificar corretores, baseados em grande parte em investigações de fenótipos, não têm logrado êxito em identificar moléculas altamente eficientes.^{( 21 , 22 )} Embora haja inúmeros defeitos na proteína CFTR, alguns deles podem ser passíveis de correção. Novos tratamentos visam corrigir proteínas CFTR defeituosas.^{( 22 )}

Apesar dos avanços no conhecimento científico sobre a FC, não se sabe muito sobre o manejo da doença, e ainda há muita controvérsia.^{( 23 )} Ainda há muito que se aprender sobre o mecanismo que envolve a expressão da proteína CFTR associada à mutação F508del,^{( 24 )} pois esta atua em múltiplas etapas da biogênese de CFTR.^{( 25 )}

Atualmente, o estudo da variação genética da FC por meio de tecnologia molecular permite novas possibilidades terapêuticas e fornece conhecimento sobre os fatores desconhecidos da gravidade da doença.^{( 9 )} Como a prevalência da mutação F508del é maior do que a de outras mutações do gene CFTR com importância clínica descrita, esse é o principal fator a ser analisado como primeiro passo para o diagnóstico molecular de FC. A análise das mutações em uma população predominantemente caucasiana pode melhorar o diagnóstico e o aconselhamento genético, propiciar o uso de novas drogas que ainda estão sendo estudadas e uma análise molecular menos cara, bem como melhor monitoramento e foco de pacientes ambulatoriais, além de promover o diagnóstico molecular em indivíduos com teste de triagem neonatal positivo para FC mesmo com o baixo subsídio fornecido. Deve haver uma compreensão e uma associação entre o ambulatório e o laboratório de pesquisa, a fim de melhorar o monitoramento dos pacientes.^{( 8 )}

Atualmente, temos áreas prioritárias para o estudo da FC: explorar os mecanismos patogênicos da doença pulmonar precoce; melhorar a triagem neonatal; criar um espectro de biomarcadores de doença pulmonar precoce que reflitam a fisiopatologia, o curso clínico e a resposta ao tratamento; explorar o papel da genética/genômica na patogênese da doença; definir os eventos microbiológicos na doença pulmonar precoce e elucidar as alterações dos mecanismos de remodelação, inflamação, e reparo na doença pulmonar.^{( 26 )} Ainda há muito a ser feito nesse contexto, e a identificação de uma mutação pontual pode trazer benefícios tão importantes como aqueles trazidos pela identificação de outras mutações do gene CFTR.

Em nosso estudo, realizamos uma análise univariada. Um modelo de regressão logística multivariada poderia ter sido usado; no entanto, seria necessária uma amostra maior de pacientes com FC para ajustar a idade e outros fatores simultaneamente. Por exemplo, um paciente de 40 anos de idade é significativamente mais propenso a ser colonizado do que um paciente de 5 anos de idade. Em nosso estudo, analisamos diretamente a influência do genótipo F508del em pacientes com FC.

Há uma enorme diversidade étnica no Brasil, e, portanto, pode ser desvantajoso para alguns indivíduos ser testados apenas para F508del. No entanto, não surpreendentemente, nossos achados foram semelhantes aos da literatura, e a investigação de uma única mutação de FC foi capaz de demonstrar o diagnóstico genético em um terço dos pacientes. Outro terço dos pacientes apresentou pelo menos um alelo com essa mutação. A investigação da F508del é importante, particularmente em países em desenvolvimento e em países com recursos limitados.

Em conclusão, a identificação da mutação F508del e sua associação com a gravidade clínica da doença nos permitiram compreender melhor sua influência sobre as manifestações clínicas em pacientes com FC. A associação com variáveis relacionadas com o aparecimento da doença sublinha a importância da investigação dessa mutação no momento do diagnóstico e após a triagem neonatal positiva para FC. No futuro, o uso de novas drogas voltadas a um genótipo particular associar-se-á à análise molecular. Em virtude de sua elevada prevalência na população com FC, a F508del deve ser analisada primeiramente, principalmente em países em desenvolvimento. O aconselhamento genético de pais e pacientes é mais bem realizado quando se conhece a mutação associada à doença. O tratamento ambulatorial pode ser mais bem realizado, especialmente considerando a importância da F508del em associação com variáveis de gravidade da FC, tais como o isolamento de bactérias que causam infecção pulmonar crônica. Em suma, a identificação da mutação F508del promove o aconselhamento genético, o manejo, o monitoramento, o diagnóstico e o uso de novas drogas. Acreditamos que os laboratórios genéticos em todo o mundo deveriam inicialmente considerar a investigação da mutação F508del apenas em pacientes com dois testes de sódio/cloro no suor alterados.

Gostaríamos de agradecer a Luciana C Bonadia, Taís DR Hortêncio, Kátia CA Aguiar, Aline Gonçalves, Simoni Avancini, Carlos E Levy, Patrícia Barbalho e Luciana M Rezende seu auxílio na coleta de dados e organização de ideias. Gostaríamos também de agradecer a Maria Julia Gonçalves de Oliveira Ribeiro seu auxílio na revisão do manuscrito em inglês.

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  Trabalho realizado no Departamento de Pediatria, no Laboratório de Genética Molecular e no Laboratório de Fisiologia Pulmonar do Centro de Investigação em Pediatria, Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas, Campinas (SP) Brasil.
• Apoio financeiro: Este estudo recebeu apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Jun 2013

Histórico

• Recebido
  16 Nov 2012
• Aceito
  15 Fev 2013