Resumos
OBJETIVO:
Avaliar o dano oxidativo (oxidação lipídica, oxidação proteica, thiobarbituric acid-reactive substances [TBARS, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico], e carbonilação) e inflamação (expressão de phosphorylated AMP-activated protein kinase e de phosphorylated mammalian target of rapamycin (p-AMPK e p-mTOR, respectivamente) em tecido pulmonar e músculos do diafragma em camundongos C57BL/6 machos expostos à fumaça de cigarro (FC) por 7, 15, 30, 45 ou 60 dias.
MÉTODOS:
Trinta e seis camundongos machos da espécie C57BL/6 foram divididos em seis grupos (n = 6/grupo): grupo controle e 5 grupos expostos a FC por 7, 15, 30, 45 e 60 dias, respectivamente.
RESULTADOS:
Comparados aos camundongos controle, os camundongos expostos à FC apresentaram menor peso corporal em 30 dias. Nos camundongos expostos à FC (comparados aos controle) as maiores diferenças (aumentos) nos níveis de TBARS foram observados no dia 7 no músculo diafragma, comparado ao dia 45 em tecido pulmonar; as maiores diferenças (aumentos) nos níveis de carbonilas foram observados no dia 7 em ambos os tipos de tecido; e os níveis de sulfidrilas foram menores, nos dois tipos de tecidos, em todos os tempos. No tecido pulmonar e no músculo diafragma, a expressão de p-AMPK exibiu um comportamento semelhante ao dos níveis de TBARS. A expressão de p-mTOR foi maior que o valor controle nos dias 7 e 15 no tecido pulmonar, assim como no dia 45 no músculo diafragma.
CONCLUSÕES:
Nossos dados demonstram que a exposição à FC produz dano oxidativo tanto no tecido pulmonar quanto (primariamente) no tecido muscular, tendo um efeito adicional no músculo respiratório, como é frequentemente observado em fumantes com DPOC.
Estresse oxidativo; Camundongos; Sistema respiratório; Poluição por fumaça de tabaco; Inflamação
OBJECTIVE:
To evaluate oxidative damage (lipid oxidation, protein oxidation, thiobarbituric acid-reactive substances [TBARS], and carbonylation) and inflammation (expression of phosphorylated AMP-activated protein kinase and mammalian target of rapamycin [p-AMPK and p-mTOR, respectively]) in the lung parenchyma and diaphragm muscles of male C57BL-6 mice exposed to cigarette smoke (CS) for 7, 15, 30, 45, or 60 days.
METHODS:
Thirty-six male C57BL-6 mice were divided into six groups (n = 6/group): a control group; and five groups exposed to CS for 7, 15, 30, 45, and 60 days, respectively.
RESULTS:
Compared with control mice, CS-exposed mice presented lower body weights at 30 days. In CS-exposed mice (compared with control mice), the greatest differences (increases) in TBARS levels were observed on day 7 in diaphragm-muscle, compared with day 45 in lung tissue; the greatest differences (increases) in carbonyl levels were observed on day 7 in both tissue types; and sulfhydryl levels were lower, in both tissue types, at all time points. In lung tissue and diaphragm muscle, p-AMPK expression exhibited behavior similar to that of TBARS. Expression of p-mTOR was higher than the control value on days 7 and 15 in lung tissue, as it was on day 45 in diaphragm muscle.
CONCLUSION:
Our data demonstrate that CS exposure produces oxidative damage, not only in lung tissue but also (primarily) in muscle tissue, having an additional effect on respiratory muscle, as is frequently observed in smokers with COPD.
Oxidative stress; Mice; Respiratory system; Smoking; Inflammation
Introdução
A fumaça de cigarro (FC) contém um grande número de oxidantes que têm efeitos
adversos sobre os tecidos por meio de dano oxidativo.(
11. Barreiro E, Peinado VI, Galdiz JB, Ferrer E, Marin-Corral J, Sánchez
F, et al. Cigarette smoke-induced oxidative stress: A role in chronic obstructive
pulmonary disease skeletal muscle dysfunction. Am J Respir Crit Care Med.
2010;182(4):477-88. http://dx.doi.org/10.1164/rccm.200908-1220OC
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,
22. Fusco L, Pêgo-Fernandes P, Xavier A, Pazetti R, Rivero D, Capelozzi
V, et al. Modelo experimental de enfisema pulmonar em ratos induzido por papaína. J
Pneumol. 2002;28:1-7.
) Sabe-se que a FC ativa as células inflamatórias, o que pode também
aumentar a produção de oxidantes por células polimorfonucleares nos tecidos,
desencadeando o estresse oxidativo, etapa crucial na patogênese do dano tecidual
induzido pela FC.(
33. Menegali BT, Nesi RT, Souza PS, Silva LA, Silveira PC, Valença SS, et
al. The effects of physical exercise on the cigarette smoke-induced pulmonary
oxidative response. Pulm Pharmacol Ther. 2009;22(6):567-73.
http://dx.doi.org/10.1016/j.pupt.2009.08.003
http://dx.doi.org/10.1016/j.pupt.2009.08...
4. Yoshida T, Tuder RM. Pathobiology of cigarette smoke-induced chronic
obstructive pulmonary disease. Physiol Rev. 2007;87(3):1047-82.
http://dx.doi.org/10.1152/physrev.00048.2006
http://dx.doi.org/10.1152/physrev.00048....
5. Kozma Rde L, Alves EM, Barbosa-de-Oliveira VA, Lopes FD, Guardia RC,
Buzo HV, et al. A new experimental model of cigarette smoke-induced emphysema in
Wistar rats. J Bras Pneumol. 2014;40(1):46-54.
http://dx.doi.org/10.1590/S1806-37132014000100007
http://dx.doi.org/10.1590/S1806-37132014...
-
66. Valença SS, Porto LC. Immunohistochemical study of lung remodeling in
mice exposed to cigarette smoke. J Bras Pneumol. 2008;34(10):787-95.
http://dx.doi.org/10.1590/S1806-37132008001000006
http://dx.doi.org/10.1590/S1806-37132008...
) Os efeitos combinados de aumento da degradação proteolítica, aumento da
morte celular e redução do remodelamento pulmonar levam a alterações enfisematosas
nos pulmões.(
77. Tuder RM, Petrache I, Elias JA, Voelkel NF, Henson PM. Apoptosis and
emphysema: the missing link. Am J Respir Cell Mol Biol. 2003;28(5):551-4.
http://dx.doi.org/10.1165/rcmb.F269
http://dx.doi.org/10.1165/rcmb.F269...
) Estudos mostraram que, no sangue de fumantes,(
88. Kalra J, Chaudhary AK, Prasad K. Increased production of oxygen free
radicals in cigarette smokers. Int J Exp Pathol. 1991;72(1):1-7.
,
99. Frei B, Forte TM, Ames BN, Cross CE. Gas phase oxidants of cigarette
smoke induce lipid peroxidation and changes in lipoprotein properties in human blood
plasma. Protective effects of ascorbic acid. Biochem J. 1991;277(Pt
1):133-8.
) bem como em vários órgãos de animais cronicamente expostos à
FC,(
1010. Park EM, Park YM, Gwak YS. Oxidative damage in tissues of rats
exposed to cigarette smoke. Free Radic Biol Med. 1998;25(1):79-86.
http://dx.doi.org/10.1016/S0891-5849(98)00041-0
http://dx.doi.org/10.1016/S0891-5849(98)...
) há aumentos da peroxidação lipídica, da carbonilação de proteínas, da
oxidação de tióis e da oxidação do DNA.
Há evidências de que dois fatores centrais estão envolvidos na lesão direta ou
inflamação sistêmica induzida pela FC: a phosphorylated AMP-activated protein
kinase e o phosphorylated mammalian target of rapamycin
(p-AMPK e p-mTOR, respectivamente). Um estudo recente mostrou que a ativação da
p-AMPK inibe ou promove a inflamação, dependendo do estímulo. (
1111. Chang MY, Ho FM, Wang JS, Kang HC, Chang Y, Ye ZX, et al. AICAR
induces cyclooxygenase-2 expression through AMP-activated protein kinase-transforming
growth factor-beta-activated kinase 1-p38 mitogen-activated protein kinase signaling
pathway. Biochem Pharmacol. 2010;80(8):1210-20.
http://dx.doi.org/10.1016/j.bcp.2010.06.049
http://dx.doi.org/10.1016/j.bcp.2010.06....
) Há também evidências crescentes de que, em muitos tipos de células, um
aumento dos níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio (ERO) pode ativar
a p-AMPK.(
1212. Zmijewski JW, Banerjee S, Bae H, Friggeri A, Lazarowski ER, Abraham
E. Exposure to hydrogen peroxide induces oxidation and activation of AMP-activated
protein kinase. J Biol Chem. 2010;285(43):33154-64.
http://dx.doi.org/10.1074/jbc.M110.143685
http://dx.doi.org/10.1074/jbc.M110.14368...
) O mTOR, que é um importante integrador de estímulos ambientais, controla
o metabolismo, crescimento, proliferação e sobrevivência celulares, dependendo de
sinais mitogênicos, bem como da disponibilidade de nutrientes e de energia.
Recentemente ficou claro que a sinalização do mTOR desempenha um papel central na
regulação de aspectos básicos do comportamento das células e do organismo, e sua
desregulação associa-se fortemente à progressão de numerosas doenças humanas
proliferativas e metabólicas, incluindo o câncer, a obesidade, o diabetes tipo 2 e a
síndrome do hamartoma.(
1313. Laplante M, Sabatini DM. mTOR signaling in growth control and
disease. Cell. 2012;149(2):274-93.
http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2012.03.017
http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2012.03...
)
É muito importante elucidar o possível dano oxidativo induzido pela FC diretamente no músculo esquelético, bem como as anormalidades estruturais relacionadas e a relação direta entre a p-AMPK e o p-mTOR, dois fatores associados à inflamação. Portanto, o objetivo deste estudo em animais foi avaliar o dano oxidativo e a inflamação no parênquima pulmonar e no músculo diafragma após 7, 15, 30, 45 e 60 dias de exposição à FC.
Métodos
Neste estudo, utilizamos 36 camundongos machos da espécie C57BL/6 com idade de dois meses e peso de 30-35 g. Os animais foram utilizados e cuidados de acordo com a Diretiva 86/609/CEE, de 24 de novembro de 1986, do Conselho das Comunidades Europeias. Os procedimentos adotados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade do Extremo Sul de Santa Catarina, localizada em Criciúma. Os camundongos foram mantidos em ambiente com temperatura e umidade controladas (umidade de 70%; 20 ± 2°C), em ciclo claro-escuro de 12 h, e tinham livre acesso a água e ração (Nuvilab CR1; Nuvital Nutrientes Ltda., Colombo, Brasil). Os animais foram verificados periodicamente para confirmar a ausência de patógenos. Para os ensaios bioquímicos, os camundongos foram divididos aleatoriamente em 6 grupos (n = 6/grupo): grupo controle e 5 grupos expostos a FC por 7, 15, 30, 45 e 60 dias (designados FC-7, FC-15, FC-30, FC-45 e FC-60, respectivamente).
Foram utilizados cigarros comerciais com filtro (MarlboroTM Red, 8 mg de
alcatrão e 0,6 mg de nicotina por cigarro; Philip Morris Products, Richmond, VA,
EUA).(
1414. IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to
Humans. Tobacco smoke and involuntary smoking. IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum.
2004;83:1-1438.
,
1515. Counts ME, Morton MJ, Laffoon SW, Cox RH, Lipowicz PJ. Smoke
composition and predicting relationships for international commercial cigarettes
smoked with three machine-smoking conditions. Regul Toxicol Pharmacol.
2005;41(3):185-227. http://dx.doi.org/10.1016/j.yrtph.2004.12.002
http://dx.doi.org/10.1016/j.yrtph.2004.1...
) Os animais do estudo foram expostos à fumaça emitida pela queima de 12
cigarros ao dia por 7, 15, 30, 45 e 60 dias, conforme descrito anteriormente por
Menegali et al.(
33. Menegali BT, Nesi RT, Souza PS, Silva LA, Silveira PC, Valença SS, et
al. The effects of physical exercise on the cigarette smoke-induced pulmonary
oxidative response. Pulm Pharmacol Ther. 2009;22(6):567-73.
http://dx.doi.org/10.1016/j.pupt.2009.08.003
http://dx.doi.org/10.1016/j.pupt.2009.08...
) Em suma, os animais foram colocados em uma câmara de inalação coberta
(40 cm de comprimento, 30 cm de largura e 25 cm de altura), posicionada sob um
exaustor. Um cigarro foi acoplado a uma seringa plástica de 60 mL de modo que cada
baforada pudesse ser colhida e em seguida expelida para a câmara de exposição. Um
litro de fumaça (20 baforadas de 50 mL) foi aspirado de cada cigarro, sendo que cada
baforada foi imediatamente injetada na câmara de inalação. Os animais foram mantidos
nessa condição de fumaça-ar (3% de fumaça) por 6 min. Retirou-se então a tampa da
câmara de inalação e ligou-se o exaustor, que evacuou a fumaça em 60 s. Esse processo
foi imediatamente repetido. Um total de quatro cigarros foi assim "fumado" em cada
tratamento. Os camundongos foram submetidos a esses tratamentos com 4 cigarros três
vezes ao dia (manhã, meio-dia e tarde), resultando na exposição à FC por 72 min (12
cigarros por dia). (
1616. Valenca SS, Bezerra FS, Romana-Souza B, Paiva RO, Costa AM, Porto
LC. Supplementation with vitamins C and E improves mouse lung repair. J Nutr Biochem.
2008;19(9):604-11. http://dx.doi.org/10.1016/j.jnutbio.2007.08.004
http://dx.doi.org/10.1016/j.jnutbio.2007...
) Cada cigarro fumado produziu 300 mg/m3 de particulados totais
na câmara de exposição.(
33. Menegali BT, Nesi RT, Souza PS, Silva LA, Silveira PC, Valença SS, et
al. The effects of physical exercise on the cigarette smoke-induced pulmonary
oxidative response. Pulm Pharmacol Ther. 2009;22(6):567-73.
http://dx.doi.org/10.1016/j.pupt.2009.08.003
http://dx.doi.org/10.1016/j.pupt.2009.08...
) Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical 24 h após a
última exposição à FC. As amostras de tecido pulmonar e do músculo diafragma foram
homogeneizadas em tampão. Os homogeneizados foram centrifugados a 1000 ×
g por 10 min a 4°C, e os sobrenadantes foram armazenados a −70°C
para posterior utilização nos experimentos.
Para a análise histológica, selecionaram-se todos os animais de cada grupo. O
ventrículo direito foi submetido a perfusão com solução salina estéril (0,9%) a fim
de remover o sangue do pulmão. O pulmão direito foi fixado (por infusão suave de
formalina tamponada com fosfato a 4% [pH 7,2], a 25 cmH2O, por 2 min,
através de cateter traqueal), após o que o mesmo foi retirado e pesado. Os pulmões
inflados foram fixados por 48 h e então incluídos em parafina. Cortes seriados
sagitais (5 µm) foram obtidos para as análises histológicas e morfométricas.
Realizou-se a quantificação de macrófagos e neutrófilos nos alvéolos. Para cada
grupo, foram analisados 30 campos microscópicos (10 campos aleatórios, de 26.000
mm2 cada, em 3 diferentes cortes do pulmão direito). A contagem do
número de macrófagos e neutrófilos (células/mm2) foi realizada em um
microscópio de fluorescência (BH-2; Olympus, Tóquio, Japão) equipado com objetiva de
40×.(
33. Menegali BT, Nesi RT, Souza PS, Silva LA, Silveira PC, Valença SS, et
al. The effects of physical exercise on the cigarette smoke-induced pulmonary
oxidative response. Pulm Pharmacol Ther. 2009;22(6):567-73.
http://dx.doi.org/10.1016/j.pupt.2009.08.003
http://dx.doi.org/10.1016/j.pupt.2009.08...
)
O dano oxidativo foi avaliado pela quantificação de sulfidrilas, carbonilas proteicas
e malondialdeído. O conteúdo total de tióis foi determinado pelo método do ácido
5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico) - reagente DTNB (Sigma, St. Louis, MO, EUA). O teste
do reagente DTNB foi realizado conforme condições descritas
anteriormente.(
1717. Aksenov MY, Markesbery WR. Changes in thiol content and expression
of glutathione redox system genes in the hippocampus and cerebellum in Alzheimer's
disease. Neurosci Lett. 2001;302(2-3):141-5.
http://dx.doi.org/10.1016/S0304-3940(01)01636-6
http://dx.doi.org/10.1016/S0304-3940(01)...
) Em suma, 30 µL de uma amostra foram misturados a 1 mL de PBS e 1 mM de
EDTA (pH 7,5). A reação foi iniciada pela adição de 30 µL de solução estoque de DTNB
(10 mM em PBS). As amostras controle, que não incluíam DTNB ou proteína, foram
processadas simultaneamente. Após 30 min de incubação em temperatura ambiente, leu-se
a absorbância a 412 nm e mediram-se as quantidades de ácido 5-tio-2-nitrobenzoico
(TNB) formado (equivalentes à quantidade de grupos sulfidrilas). As carbonilas
proteicas foram determinadas pelo método espectrofotométrico utilizando
2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNPH), conforme descrito por Levine et al.(
1818. Levine RL, Garland D, Oliver CN, Amici A, Climent I, Lenz AG, et al.
Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins. Methods Enzymol.
1990;186:464-78. http://dx.doi.org/10.1016/0076-6879(90)86141-H
http://dx.doi.org/10.1016/0076-6879(90)8...
) Em suma, as amostras contendo ou ácido clorídrico 2 N ou DNPH foram
passadas através de colunas contendo Sephadex G-10 e lavadas com ácido clorídrico 2
N. O efluente foi coletado e misturado a cloridrato de guanidina, após o que se
determinou a absorbância a 360 nm em espectrofotômetro (SP 1105; Shanghai Spectrum
Instruments Co., Ltd., Xangai, China). A diferença na absorbância com e sem DNPH foi
calculada para todas as amostras. Os valores foram expressos em unidades molares
utilizando-se o coeficiente de extinção de 22.000 [M-1]. A determinação do
malondialdeído, um importante indicador de peroxidação lipídica, foi realizada por
espectrofotometria do produto de cor rosa resultante das thiobarbituric
acid-reactive substances (TBARS, substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico). As TBARS totais, como proxy para peroxidação
lipídica (níveis de malondialdeído), foram expressas em mmol/mg de
proteína.(
1919. Draper HH, Hadley M. Malondialdehyde Determination as Index of
Lipid-Peroxidation. Methods Enzymol. 1990;186:421-31.
http://dx.doi.org/10.1016/0076-6879(90)86135-I
http://dx.doi.org/10.1016/0076-6879(90)8...
)
Para Western blotting, os homogeneizados de pulmão foram preparados a partir de pulmões congelados, utilizando-se um tampão de lise de tecido (50 mM de TRIS, pH 8,0; 5 mM de EDTA; 150 mM de NaCl; 1% de detergente não iônico; 0,5% de desoxicolato de sódio; e 0,1% de dodecilsulfato de sódio) e um coquetel de inibidores de protease (Sigma). Os lisados foram clarificados por centrifugação a 13.000 g por 15 min a 4°C; 10-30 g de proteína foram separados por SDS-PAGE em gel a 10% ou 15%; e a expressão de p-AMPK e p-mTOR foi analisada por immunoblot. A detecção da imunorreatividade foi realizada por quimiluminescência (ECL; Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido). A densidade das bandas foi determinada utilizando-se um densitômetro de imagem e analisada com o software do próprio aparelho ((GS-700 e Quantity One; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA).( 2020. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76(9):4350-4. )
Os dados foram expressos em média ± erro padrão da média. Para comparar as médias
entre os grupos, utilizou-se ANOVA de um fator seguida do teste post
hoc HSD de Tukey para comparações múltiplas. O nível de significância
adotado foi de p < 0,05. O software utilizado para a análise dos dados foi o
Statistical Package for the Social Sciences, versão 18.0 para
Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). O tamanho da amostra foi baseado em estudos
anteriores realizados em nosso laboratório,(
33. Menegali BT, Nesi RT, Souza PS, Silva LA, Silveira PC, Valença SS, et
al. The effects of physical exercise on the cigarette smoke-induced pulmonary
oxidative response. Pulm Pharmacol Ther. 2009;22(6):567-73.
http://dx.doi.org/10.1016/j.pupt.2009.08.003
http://dx.doi.org/10.1016/j.pupt.2009.08...
) em que abordagens semelhantes foram empregadas.
Resultados
Entre os camundongos avaliados no presente estudo, a taxa de sobrevivência foi de 100%. Em comparação aos valores basais, o peso corporal dos animais diminuiu após 30, 45 e 60 dias de exposição à FC (27 ± 1 vs. 23 ± 0,8 g; p < 0,01, 26 ± 0,5 vs. 22 ± 0,4 g; p < 0,01, e 25 ± 0,7 vs. 20 ± 0,3 g; p < 0,001, respectivamente). Além disso, o peso corporal dos camundongos do grupo FC-60 foi significativamente menor que o dos camundongos controle, sendo também significativamente menor que o dos camundongos dos grupos FC-30 e FC-45 (p < 0,001 para todos).
Na análise histológica, as amostras de tecido pulmonar dos camundongos controle apresentaram septos alveolares finos e alvéolos normais, enquanto as dos camundongos que foram expostos à FC apresentaram destruição dos septos alveolares (iniciando-se no 15º dia de exposição), alargamento dos alvéolos e presença de macrófagos alveolares (Figura 1A). O alargamento dos alvéolos foi significativamente maior no grupo FC-45 (Figura 1A). Conforme mostrado na Figura 1B, os números tanto de macrófagos quanto de neutrófilos nos grupos FC aumentaram significativamente (em comparação aos observados para o grupo controle) em 7 dias de exposição à FC (p < 0,01). Porém, a diferença no número de neutrófilos foi mais pronunciada após 45 dias de exposição (p < 0,001).
Em A, fotomicrografias de amostras de tecido pulmonar de camundongos expostos a fumaça de cigarro mostrando aumento dos espaços aéreos (EA) resultante da consolidação alveolar durante o desenvolvimento de enfisema pulmonar (aumento, 40×): a, grupo controle; b, grupo exposto por 7 dias; c, grupo exposto por 15 dias; d, grupo exposto por 30 dias; e, grupo exposto por 45 dias; e f, grupo exposto por 60 dias. Em B, média ± EPM do número de macrófagos e de neutrófilos (células/mm2). *p < 0,001 vs. controle para macrófagos. †p < 0,001 vs. controle para neutrófilos. ‡p < 0,001 vs. basal para neutrófilos.
As Figuras 2, 3 e 4, respectivamente, mostram peroxidação lipídica, carbonilas proteicas e conteúdo de sulfidrila nas amostras de tecido pulmonar e nas amostras do músculo diafragma. Em ambos os tipos de tecido, as TBARS totais aumentaram após 7 dias de exposição à FC, da mesma foram que os níveis de carbonilas. Nos grupos FC-7, FC-15 e FC-45, houve diferenças entre as amostras de tecido pulmonar e as amostras do músculo diafragma em termos do grau de aumento dos níveis de carbonilas. No grupo FC-15, os níveis de TNB foram significativamente menores no tecido pulmonar que no músculo diafragma. Porém, em 7 dias de exposição à FC, os níveis de TNB foram menores que os valores controle em ambos os tipos de tecido.
Média ± EPM dos níveis de thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS) no tecido pulmonar e no músculo diafragma em 6 grupos de camundongos: grupo controle e 5 grupos expostos a fumaça de cigarro por 7, 15, 30, 45 e 60 dias, respectivamente. *p < 0,05 vs. controle no tecido pulmonar. † p < 0,05 vs. controle no músculo diafragma. ‡ p < 0,05 vs. tecido pulmonar.
Média ± EPM dos níveis de carbonilas no tecido pulmonar e no músculo diafragma em 6 grupos de camundongos: grupo controle e 5 grupos expostos a fumaça de cigarro por 7, 15, 30, 45 e 60 dias, respectivamente. p < 0,05 vs. controle no tecido pulmonar. † p < 0,05 vs. controle no músculo diafragma. ‡ p < 0,05 vs. tecido pulmonar.
Média ± EPM dos níveis de ácido 5-tio-2- nitrobenzoico (TNB) no tecido pulmonar e no músculo diafragma em 6 grupos de camundongos: grupo controle e 5 grupos expostos a fumaça de cigarro por 7, 15, 30, 45 e 60 dias, respectivamente. * p < 0,05 vs. controle no tecido pulmonar. † p < 0,05 vs. controle no músculo diafragma. ‡ p < 0,05 vs. tecido pulmonar.
A expressão de p-AMPK no pulmão foi maior no grupo FC-15 que no grupo FC-7. Notadamente, nos grupos FC-30 e FC-45, a expressão de p-AMPK foi maior no músculo diafragma que no tecido pulmonar (Figura 5). Do 7º dia de exposição à FC em diante, a expressão de p-mTOR no pulmão foi menor em todos os grupos expostos à FC que no grupo controle. Porém, essa diferença foi mais pronunciada nos grupos FC-7 e FC-45. Nas amostras do músculo diafragma, a expressão de p-mTOR começou a aumentar em 15 dias de exposição à FC, atingindo seu pico em 45 dias (Figura 5).
Em A e B, média ± EPM para expressão de phosphorylated AMP-activated protein kinase (p-AMPK) no tecido pulmonar e no músculo diafragma, respectivamente. Em C e D, média ± EPM para expressão de phosphorylated mammalian target of rapamycin (p-mTOR) no tecido pulmonar e no músculo diafragma, respectivamente. Os dados são referentes a 6 grupos de camundongos: grupo controle e 5 grupos expostos a fumaça de cigarro por 7, 15, 30, 45 e 60 dias, respectivamente. *p < 0,01 vs. controle. †p < 0,001 vs. controle.
Discussão
No presente estudo, nosso principal objetivo foi caracterizar, em diferentes momentos, os efeitos induzidos pela exposição à FC. Os principais efeitos observados foram dano oxidativo no músculo diafragma e alterações morfológicas no tecido pulmonar.
A quantidade de neutrófilos, que está associada ao dano oxidativo no tecido pulmonar,
alcançou seu maior valor em 45 dias de exposição à FC. Os números de macrófagos e de
neutrófilos são elevados em pacientes com DPOC, apresentando relação direta com a
gravidade da doença.(
2121. Retamales I, Elliott WM, Meshi B, Coxson HO, Pare PD, Sciurba FC, et
al. Amplification of inflammation in emphysema and its association with latent
adenoviral infection. Am J Respir Crit Care Med. 2001;164(3):469-73.
http://dx.doi.org/10.1164/ajrccm.164.3.2007149
http://dx.doi.org/10.1164/ajrccm.164.3.2...
) Nossos dados demonstram aumentos de leucócitos, incluindo macrófagos e
neutrófilos, do 7º ao 45º dia de exposição à FC, o que pode estar relacionado a
aumento do número de células e proliferação celular, resultando na ativação da
resposta imune.(
2222. Duong C, Seow HJ, Bozinovski S, Crack PJ, Anderson GP, Vlahos R.
Glutathione peroxidase-1 protects against cigarette smoke-induced lung inflammation
in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2010;299(3):L425-33.
http://dx.doi.org/10.1152/ajplung.00038.2010
http://dx.doi.org/10.1152/ajplung.00038....
) Conforme observado, confirmamos que as alterações pulmonares induzidas
pela FC parecem ser consequência de uma lesão inflamatória primária caracterizada
pelo acúmulo de macrófagos alveolares e neutrófilos no trato respiratório inferior
como resposta imune, que é crucial na doença inflamatória.(
2323. Vlahos R, Bozinovski S, Jones JE, Powell J, Gras J, Lilja A, et al.
Differential protease, innate immunity, and NF-kappaB induction profiles during lung
inflammation induced by subchronic cigarette smoke exposure in mice. Am J Physiol
Lung Cell Mol Physiol. 2006;290(5):L931-45.
http://dx.doi.org/10.1152/ajplung.00201.2005
http://dx.doi.org/10.1152/ajplung.00201....
) Sabe-se que as ERO desempenham um papel importante na resposta
inflamatória à FC. O estresse oxidativo é caracterizado pela maior produção de ERO e
diminuição dos níveis de antioxidantes, com a peroxidação lipídica, alterações tióis
e carbonilação de proteínas no plasma.(
2424. Park EM, Park YM, Gwak YS. Oxidative damage in tissues of rats
exposed to cigarette smoke. Free Radic Biol Med. 1998;25(1):79-86.
http://dx.doi.org/10.1016/S0891-5849(98)00041-0
http://dx.doi.org/10.1016/S0891-5849(98)...
)
O enfisema pulmonar está associado a respostas intensas ao estresse oxidativo, que
resultam em uma relação direta entre a atividade de defesa sistêmica e o dano
oxidativo.(
2525. Kluchová Z, Petrásová D, Joppa P, Dorková Z, Tkácová R. The
association between oxidative stress and obstructive lung impairment in patients with
COPD. Physiol Res. 2007;56(1):51-6.
,
2626. Pinho RA, Chiesa D, Mezzomo KM, Andrades ME, Bonatto F, Gelain D, et
al. Oxidative stress in chronic obstructive pulmonary disease patients submitted to a
rehabilitation program. Respir Med. 2007;101(8):1830-5.
http://dx.doi.org/10.1016/j.rmed.2007.02.004
http://dx.doi.org/10.1016/j.rmed.2007.02...
) O dano oxidativo e a inflamação no tecido pulmonar após exposição à FC
têm sido amplamente estudados. Além disso, de acordo com MacNee,(
2727. MacNee W. Oxidative stress and lung inflammation in airways disease.
Eur J Pharmacol. 2001;429(1-3):195-207.
http://dx.doi.org/10.1016/S0014-2999(01)01320-6
http://dx.doi.org/10.1016/S0014-2999(01)...
) o estresse oxidativo, quantificado por meio da determinação dos níveis
plasmáticos de TBARS, está associado à limitação do fluxo aéreo. As alterações do
fluxo aéreo desempenham um papel na função dos músculos respiratórios como o
diafragma. Porém, nossos achados demonstram que há aumento da intensidade da resposta
inflamatória no tecido pulmonar começando após 45 dias de exposição à FC.
De acordo com Park et al.,(
1010. Park EM, Park YM, Gwak YS. Oxidative damage in tissues of rats
exposed to cigarette smoke. Free Radic Biol Med. 1998;25(1):79-86.
http://dx.doi.org/10.1016/S0891-5849(98)00041-0
http://dx.doi.org/10.1016/S0891-5849(98)...
) a exposição à FC por 30 dias causa oxidação significativa e depleção do
pool de glutationa no pulmão. Esses autores também concluíram que
o pulmão é um alvo primário do dano oxidativo pelo tabagismo nos estágios iniciais e
que, em algum momento, a FC exerce seus efeitos oxidativos em todos os órgãos. Em
nosso estudo, observou-se que o dano oxidativo induzido pela FC causou alterações
tanto nos pulmões quanto no diafragma. Verificou-se que a exposição à FC por 30-45
dias foi suficiente para gerar maiores níveis de dano oxidativo em músculo
esquelético (diafragma).
Um estudo recente mostrou que a principal limitação encontrada em pacientes com DPOC
pode estar relacionada ao mecanismo de débito cardíaco lento associado à limitação do
fluxo aéreo.(
2828. Chiappa GR, Borghi-Silva A, Ferreira LF, Carrascosa C, Oliveira CC,
Maia J, et al. Kinetics of muscle deoxygenation are accelerated at the onset of
heavy-intensity exercise in patients with COPD: relationship to central
cardiovascular dynamics. J Appl Physiol (1985). 2008;104(5):1341-50.
http://dx.doi.org/10.1152/japplphysiol.01364.2007
http://dx.doi.org/10.1152/japplphysiol.0...
) Chiappa et al.(
2929. Chiappa GR, Queiroga F Jr, Meda E, Ferreira LF, Diefenthaeler F,
Nunes M, et al. Heliox improves oxygen delivery and utilization during dynamic
exercise in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit
Care Med. 2009 Jun 1;179(11):1004-10.
http://dx.doi.org/10.1164/rccm.200811-1793OC
http://dx.doi.org/10.1164/rccm.200811-17...
) testaram condições que melhoram a oferta e o consumo de oxigênio como
estratégias em pacientes com DPOC. Os autores demonstraram que uma dessas estratégias
- o uso de heliox (uma mistura de 79% de hélio e 21% de oxigênio) - é capaz de
melhorar a limitação do fluxo expiratório e a hiperinsuflação dinâmica, acelerando a
dinâmica de utilização de oxigênio pela musculatura periférica em consequência do
aumento da oferta durante exercícios de alta intensidade em pacientes com DPOC
moderada a grave. Acreditamos que essas interações podem estar ligadas ao equilíbrio
redox e às respostas inflamatórias. Um estudo recente sugeriu que, no manejo clínico
da lesão pulmonar aguda, o uso de heliox apresenta benefícios terapêuticos combinados
de redução do estresse mecânico e oxidativo, atenuando assim a inflamação
pulmonar.(
3030. Nawab US, Touch SM, Irwin-Sherman T, Blackson TJ, Greenspan JS, Zhu
G, et al. Heliox attenuates lung inflammation and structural alterations in acute
lung injury. Pediatr Pulmonol. 2005;40(6):524-32.
http://dx.doi.org/10.1002/ppul.20304
http://dx.doi.org/10.1002/ppul.20304...
)
O dano oxidativo gerado pela exposição à FC no músculo esquelético pode levar à perda
da função muscular, manifestando-se como perda de força muscular e consequente maior
susceptibilidade à fadiga.(
11. Barreiro E, Peinado VI, Galdiz JB, Ferrer E, Marin-Corral J, Sánchez
F, et al. Cigarette smoke-induced oxidative stress: A role in chronic obstructive
pulmonary disease skeletal muscle dysfunction. Am J Respir Crit Care Med.
2010;182(4):477-88. http://dx.doi.org/10.1164/rccm.200908-1220OC
http://dx.doi.org/10.1164/rccm.200908-12...
,
3131. Barreiro E, Rabinovich R, Marin-Corral J, Barberà JA, Gea J, Roca J.
Chronic endurance exercise induces quadriceps nitrosative stress in patients with
severe COPD. Thorax. 2009;64(1):13-9.
http://dx.doi.org/10.1136/thx.2008.105163
http://dx.doi.org/10.1136/thx.2008.10516...
) A presente investigação é a primeira a fornecer evidências de alterações
oxidativas induzidas pelas ERO nas proteínas do músculo diafragma em animais
cronicamente expostos à FC. Verificou-se que a oxidação proteica estava
significativamente aumentada no diafragma após 7 dias de exposição à FC. Os maiores
níveis de carbonilação do diafragma foram observados após 30-45 dias de exposição, em
oposição aos níveis de carbonilação no pulmão, que só atingiram seu pico em 60 dias.
Nossos dados indicam que a exposição à FC afeta principalmente o diafragma, o que
pode se traduzir em perda significativa da função locomotora e da musculatura
respiratória em enfisema pulmonar.
De acordo com Barreiro et al.,(
11. Barreiro E, Peinado VI, Galdiz JB, Ferrer E, Marin-Corral J, Sánchez
F, et al. Cigarette smoke-induced oxidative stress: A role in chronic obstructive
pulmonary disease skeletal muscle dysfunction. Am J Respir Crit Care Med.
2010;182(4):477-88. http://dx.doi.org/10.1164/rccm.200908-1220OC
http://dx.doi.org/10.1164/rccm.200908-12...
) os efeitos da oxidação proteica muscular induzida pelo tabaco no músculo
quadríceps surgem em uma fase anterior, em comparação aos observados nos músculos
respiratórios. Esses achados reforçam o conceito de que a FC, por si só,
provavelmente está envolvida na toxicidade tecidual direta da musculatura esquelética
dos camundongos expostos à FC, independentemente das alterações pulmonares e
brônquicas. Além disso, observou-se que os mesmos animais agudamente expostos à FC
apresentaram aumento significativo das TBARS, juntamente com redução dos níveis
musculares de sulfidrila, imediatamente após a exposição. A carbonilação é
fundamental para desencadear a ativação da via oxidativa e promover a peroxidação
lipídica.
Neste estudo sobre exposição crônica à FC em animais, mostramos que a função pulmonar
diminui com o tempo de exposição, à semelhança do que foi observado em
humanos.(
3232. Gold DR, Wang X, Wypij D, Speizer FE, Ware JH, Dockery DW. Effects
of cigarette smoking on lung function in adolescent boys and girls. N Engl J Med.
1996;335(13):931-7. http://dx.doi.org/10.1056/NEJM199609263351304
http://dx.doi.org/10.1056/NEJM1996092633...
) Além disso, há relatos de que a exposição crônica à FC causa obstrução
ao fluxo aéreo.(
3333. Wright JL, Sun JP, Vedal S. A longitudinal analysis of pulmonary
function in rats during a 12 month cigarette smoke exposure. Eur Respir J.
1997;10(5):1115-9.
) Quando analisamos a expressão de p-AMPK e p-mTOR no tecido pulmonar,
observamos diminuição da expressão de p-mTOR, resultado que era esperado, pois a
expressão de p-mTOR está associada ao metabolismo, crescimento, proliferação e
sobrevivência celulares, dependendo de sinais mitogênicos, bem como da
disponibilidade de nutrientes e de energia.
O aumento da expressão de p-mTOR observado no diafragma do 15º ao 45º dia de
exposição à FC pode ser explicado pelo possível aumento da síntese proteica muscular
relacionado a um estado de estresse fisiológico.(
3434. Wullschleger S, Loewith R, Hall MN. TOR signaling in growth and
metabolism. Cell. 2006;124(3):471-84.
http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2006.01.016
http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2006.01...
) Em um modelo de exposição à FC em ratos, Kozma et al.(
55. Kozma Rde L, Alves EM, Barbosa-de-Oliveira VA, Lopes FD, Guardia RC,
Buzo HV, et al. A new experimental model of cigarette smoke-induced emphysema in
Wistar rats. J Bras Pneumol. 2014;40(1):46-54.
http://dx.doi.org/10.1590/S1806-37132014000100007
http://dx.doi.org/10.1590/S1806-37132014...
) demonstraram que a resistência das vias aéreas e a resistência do
sistema respiratório eram maiores nos animais expostos que nos animais não expostos.
Esse aumento da resistência das vias aéreas pode resultar em maior trabalho
diafragmático, o que explicaria o aumento da expressão de p-mTOR no diafragma em
nossos grupos FC-15, FC-30 e FC-45, uma vez que se sabe que a expressão de p-mTOR é
elevada em situações de hipertrofia muscular.(
3535. Bassel-Duby R, Olson EN. Signaling pathways in skeletal muscle
remodeling. Annu Rev Biochem. 2006;75:19-37.
http://dx.doi.org/10.1146/annurev.biochem.75.103004.142622
http://dx.doi.org/10.1146/annurev.bioche...
) Em nosso grupo FC-60, houve redução significativa da expressão de
p-mTOR, o que foi um resultado esperado, pois a miopatia está associada à redução da
expressão de p-mTOR.(
3636. Risson V, Mazelin L, Roceri M, Sanchez H, Moncollin V, Corneloup C,
et al. Muscle inactivation of mTOR causes metabolic and dystrophin defects leading to
severe myopathy. J Cell Biol. 2009;187(6):859-74.
http://dx.doi.org/10.1083/jcb.200903131
http://dx.doi.org/10.1083/jcb.200903131...
) Essa miopatia é comum em doenças pulmonares crônicas.(
11. Barreiro E, Peinado VI, Galdiz JB, Ferrer E, Marin-Corral J, Sánchez
F, et al. Cigarette smoke-induced oxidative stress: A role in chronic obstructive
pulmonary disease skeletal muscle dysfunction. Am J Respir Crit Care Med.
2010;182(4):477-88. http://dx.doi.org/10.1164/rccm.200908-1220OC
http://dx.doi.org/10.1164/rccm.200908-12...
) Porém, em nosso estudo, a expressão de p-AMPK encontrava-se aumentada
apenas do 30º ao 45º dia de exposição à FC. Esse fato pode ser explicado pelo fato de
que o aumento da expressão de p-AMPK foi acompanhado por aumento do estresse
oxidativo, que fica claro quando olhamos para o aumento das carbonilas em 30 dias de
exposição à FC. Evidências crescentes sugerem que a p-AMPK pode ser ativada por
aumento de ERO intracelulares em muitos tipos de células.(
1212. Zmijewski JW, Banerjee S, Bae H, Friggeri A, Lazarowski ER, Abraham
E. Exposure to hydrogen peroxide induces oxidation and activation of AMP-activated
protein kinase. J Biol Chem. 2010;285(43):33154-64.
http://dx.doi.org/10.1074/jbc.M110.143685
http://dx.doi.org/10.1074/jbc.M110.14368...
) Assim, o envolvimento ou não da via de sinalização da p-AMPK sensível a
ERO na inflamação pulmonar induzida pela fumaça tóxica ainda requer investigação.
Perang et al.(
3737. Perng DW, Chang TM, Wang JY, Lee CC, Lu SH, Shyue SK, et al.
Inflammatory role of AMP-activated protein kinase signaling in an experimental model
of toxic smoke inhalation injury. Crit Care Med. 2013;41(1):120-32.
http://dx.doi.org/10.1097/CCM.0b013e318265f653
http://dx.doi.org/10.1097/CCM.0b013e3182...
) foram os primeiros a relatar uma detalhada via de sinalização da AMPK
responsável pela indução da expressão da interleucina (IL)-8 por exposição à fumaça
tóxica em células epiteliais pulmonares. Nessa via, o aumento dos níveis
intracelulares de ERO constitui o gatilho vital, pois a remoção de ERO intracelulares
pela N-acetil-cisteína reduziu a ativação da AMPK, da c-Jun N-terminal quinase e da
quinase regulada por sinal extracelular, bem como a indução de IL-8. (
3737. Perng DW, Chang TM, Wang JY, Lee CC, Lu SH, Shyue SK, et al.
Inflammatory role of AMP-activated protein kinase signaling in an experimental model
of toxic smoke inhalation injury. Crit Care Med. 2013;41(1):120-32.
http://dx.doi.org/10.1097/CCM.0b013e318265f653
http://dx.doi.org/10.1097/CCM.0b013e3182...
) Estudos anteriores relataram que a fumaça tóxica pode aumentar o nível
intracelular de ERO em células pulmonares, embora o mecanismo permaneça
obscuro.(
3838. Lee TS, Liu YJ, Tang GJ, Yien HW, Wu YL, Kou YR. Wood smoke extract
promotes both apoptosis and proliferation in rat alveolar epithelial type II cells:
the role of oxidative stress and heme oxygenase-1. Crit Care Med.
2008;36(9):2597-606. http://dx.doi.org/10.1097/CCM.0b013e318184979c
http://dx.doi.org/10.1097/CCM.0b013e3181...
)
Em conclusão, nosso estudo mostra, pela primeira vez, que as alterações oxidativas nas proteínas musculares ocorrem no diafragma já em 7 dias de exposição à FC. Além disso, esse evento ocorreu concomitantemente às anormalidades parenquimatosas induzidas pela FC nos pulmões, sugerindo um efeito tóxico direto da FC nas proteínas do músculo esquelético. Porém, nossos dados também tornam mais óbvio que o enfisema pulmonar é uma doença complexa que tem impacto negativo no corpo inteiro. Ademais, verificou-se que o dano oxidativo causado pela exposição à FC ocorre primeiro no músculo esquelético e então no tecido pulmonar.
Agradecimentos
Agradecemos a nossos colegas do Laboratório de Bioquímica e Fisiologia do Exercício da Universidade do Extremo Sul de Santa Catarina, em Criciúma, a sua colaboração.
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Apoio financeiro: Este estudo recebeu apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Estado de Santa Catarina (FAPESC) e Universidade do Extremo Sul de Santa Catarina (UNESC).
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Trabalho realizado no Laboratório de Fisiopatologia do Exercício, Hospital de Clinicas de Porto Alegre, Porto Alegre (RS) Brasil.
Datas de Publicação
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Publicação nesta coleção
Jul-Aug 2014
Histórico
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Recebido
14 Mar 2014 -
Aceito
02 Jul 2014