Estresse salino em duas variedades de cana-de-açúcar: enzimas do sistema antioxidativo e fluorescência da clorofila

Salinity stress in two varieties of sugar cane: enzymes of the antioxidant system and chlorophyll fluorescence

FITOTECNIA

Estresse salino em duas variedades de cana-de-açúcar: enzimas do sistema antioxidativo e fluorescência da clorofila

Salinity stress in two varieties of sugar cane: enzymes of the antioxidant system and chlorophyll fluorescence

Lilia Willadino^I,*; Ronaldo Alves de Oliveira Filho^II; Elias Arcanjo da Silva Junior^III; Artur Gouveia Neto^IV; Terezinha Rangel Camara^V

^IDepartamento de Biologia/UFRPE, Rua dom Manoel de Medeiros s/n, Recife-PE, Brasil, 52.511-900; [e-mail]

^IIGraduando do curso de Agronomia/UFRPE, Rua dom Manoel de Medeiros s/n, Recife-PE, Brasil, 52.511-900

^IIIPrograma de Pós-Graduação em Física Aplicada/UFRPE, Rua dom Manoel de Medeiros s/n, Recife-PE, Brasil, 52.511-900

^IVDepartamento de Física/UFRPE, Rua dom Manoel de Medeiros s/n, Recife-PE, Brasil, 52.511-900

^VDepartamento de Química/UFRPE, Rua dom Manoel de Medeiros s/n, Recife-PE, Brasil, 52.511-900

RESUMO

O Brasil destaca-se por ser o maior produtor de cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.) e por dominar todos os estágios da tecnologia de produção de açúcar e etanol. Atualmente se observa a expansão dessa cultura para a região semiárida brasileira, a qual apresenta solos propensos à salinização. O presente trabalho objetivou avaliar a resposta à salinidade de duas variedades de cana-de-açúcar. O ensaio foi implantado em casa de vegetação, em delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial 2 x 8 com cinco repetições, correspondendo a duas variedades de cana-de-açúcar (RB867515 e RB863129) e oito níveis de NaCl (0; 25; 50; 75; 100; 125; 150; 200 mM de NaCl). A salinidade induziu aumento na fluorescência e diminuição na concentração de clorofila em ambas as variedades. A redução da clorofila, entretanto, foi maior na variedade RB867515. Observou-se, nesta mesma variedade, aumento da atividade da peroxidase do ascorbato (APX) e da catalase (CAT), enquanto na variedade RB863129 ocorreu redução na atividade dessas enzimas. Esses resultados indicam que a variedade RB867515 apresenta um mecanismo mais eficiente na proteção da planta contra danos no aparato fotoquímico e contra a ação de espécies reativas de oxigênio, em particular o H₂O₂.

Palavras-chave: Catalase. Fluorescência da clorofila. Peroxidase. Saccharum officinarum.

ABSTRACT

Brazil is seen as being the largest producer of sugarcane (Saccharum officinarum L.) and of mastering all stages in the production of sugar and ethanol. Currently this production is being expanded into the semi-arid regions of Brazil, where there are soil-types prone to salinity. This study aimed to evaluate the response to salinity in two sugarcane genotypes, RB867515 and RB863129. Salinity caused an increase in chlorophyll fluorescence and a reduction of chlorophyll concentration in both varieties. The reduction of chlorophyll however was higher in RB867515. In this same type, an increase in the activity of ascorbate peroxidase (APX) and catalase (CAT) was observed, while in genotype RB863129 there was a reduction in the activity of these two enzymes. These results show that RB867515 has a mechanism which better protects the plant against damage to the photochemical system and the action of reactive oxygen species, particularly H₂O₂.

Keywords: Chlorophyll fluorescence. Peroxidase. Catalase. Saccharum officinarum.

Introdução

As áreas de cultivo de cana-de-açúcar têm se expandido para a região semiárida brasileira. Esta região caracteriza-se por apresentar condições edafoclimáticas favoráveis à salinização dos solos. Os efeitos da salinidade sobre as plantas incluem restrição na assimilação do CO₂ e queda no teor de clorofila (SILVA et al., 2010), resultando, frequentemente, na redução do crescimento da planta (MUNNS et al., 2002). Todo estresse ambiental pode acarretar estresse oxidativo, resultado do acúmulo de espécies reativas e citotóxicas de oxigênio (O₂^•-, H₂O₂,^•OH) (MITTLER, 2002).

As plantas possuem um mecanismo de defesa antioxidativo que atua mediante a ativação de um sistema enzimático (AGARWAL; PANDEI, 2004) e que inclui a peroxidase do ascorbato (APX), a catalase (CAT) e a peroxidase (POD). Essas enzimas catalisam a decomposição do H₂O₂, desempenhando um papel fundamental no equilíbrio redox (MITTLER, 2002).

É frequente o aumento da atividade de uma ou mais enzimas do sistema antioxidativo, em função do incremento da salinidade, como registrado para a APX (BOR et al. 2003; KOCA et al., 2007; MAIA et al., 2010), CAT (ABOGADALLAH et al, 2010; AGARWAL; PANDEI, 2004; KOCA et al., 2007) e POD (ABOGADALLAH et al., 2010). O aumento da atividade dessas enzimas minimiza os efeitos deletérios do H₂O₂ sobre a célula e suas estruturas (MAIA, 2002).

Este trabalho teve como objetivo avaliar a resposta de duas variedades de cana-de-açúcar ao estresse salino, mediante a variação da atividade das enzimas do sistema antioxidativo (CAT, POD, APX), da fluorescência e do teor de clorofila.

Material e métodos

O experimento foi conduzido em casa de vegetação da Universidade Federal Rural de Pernambuco - UFRPE, em Recife - PE. Foram utilizadas duas variedades de cana-de-açúcar, RB863129 e RB867515. As mudas foram procedentes do Centro de Tecnologia Estratégicas do Nordeste (CETENE), em Recife - PE. Ambas as variedades foram submetidas a oito níveis de salinidade (0; 25; 50; 75; 100; 125; 150; 200 mM de NaCl) em esquema fatorial 2 x 8, inteiramente casualizado. Foram mantidas cinco repetições por tratamento. Trinta dias após a diferenciação do experimento, a massa fresca das plantas foi determinada por meio de balança de precisão (Kern410) e as plantas congeladas em nitrogênio líquido para análises bioquímicas. Foi avaliada a atividade de enzimas do sistema antioxidativo, o teor de clorofila, e a fluorescência induzida por laser. Para obtenção do extrato enzimático, macerou-se 0,2g de massa fresca em nitrogênio líquido. As atividades enzimáticas foram expressas em unidade enzimática. Uma unidade da enzima é definida como a quantidade de enzima que causa um aumento de 0,001 unidade de absorbância por minuto e expressas como U min^-1 mg^-1 de proteína solúvel.

A atividade da catalase foi determinada pela adição de 100 µL do extrato enzimático a 2,9 mL de uma solução contendo H₂O₂ (12,5 mM) e tampão fosfato de potássio (50 mM), com pH 7,0. A absorbância foi medida a 240 nm, usando espectrofotômetro UV-VIS (HAVIR; MCHALE, 1987). Para a determinação da atividade da peroxidase foram adicionados 100 µL do extrato enzimático bruto a 0,9 mL da mistura de reação contendo tampão fosfato de potássio 25 mM, pH 6,8, acrescida de pirogalol a 20 mM e H₂O₂. a 20 mM. A absorbância, medida a 420 nm, foi obtida 60 segundos após o início da reação (KAR; MISHRA, 1976). A atividade da peroxidase do ascorbato foi determinada mediante a adição de 100 µL do extrato ao meio de reação constituído por 2,7 mL de tampão fosfato de potássio a 50 mM, pH 6,0, e 75 µL de ácido L-ascórbico 0,8 mM. A absorbância foi medida a 290 nm (NAKANO; ASADA, 1981, modificado por KOSHIBA, 1993). A determinação do teor de clorofila seguiu o método de Arnon (1949): o tecido vegetal foi macerado, utilizando-se acetona a 80%, e centrifugado por cinco minutos a 2000 g. A absorbância foi medida a 663 nm e 645 nm.

As medidas de fluorescência da clorofila foram realizadas utilizando-se uma fonte de excitação no UV, azul, verde, vermelho ou infravermelho associada a um sistema de coleta de sinal de fluorescência por cabos de fibras ópticas, acoplado a um espectrômetro com fotodetector. Os dados foram tratados e analisados usando o software Ocean Optics USB HR4000.

Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância pelo teste 'F' e regressão. Para o fator "dose de salinidade" realizou-se análise de regressão, por ser um fator quantitativo. Para o fator "variedade", por ser qualitativo, as médias foram comparadas pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade, utilizando-se o programa estatístico ASSISTAT (SILVA; AZEVEDO, 2002).

Resultados e discussão

Ambas as variedades apresentaram redução na biomassa fresca da parte aérea em função do incremento dos níveis de sal na solução nutritiva (FIG. 1), entretanto, destaca-se o melhor desempenho da variedade RB867515 (TAB. 1). O efeito deletério da salinidade sobre o crescimento da planta já está bem documentado e, frequentemente, em uma mesma espécie, a cultivar sensível apresenta maior redução do crescimento do que a tolerante (MUNNS et al., 2002; KOCA et al., 2007; CORREIA et al., 2009).

A redução de produção de massa fresca, à medida que ocorreu um incremento dos níveis de sal na solução, foi acompanhada pelo aumento na fluorescência das moléculas de clorofila (FIG. 2 e 3), indicando que houve perturbação no processo fotossintético. Em condições de estresse a taxa de fluorescência (FR) das bandas de emissão da clorofila no vermelho e vermelho distante, denotadas pela relação F690/F735, é aumentada (SCHREIBER, 1983; STOBER; LICHTENTHALER, 1992). O aumento dessa relação F690/F735 indica que a capacidade de captação da luz é superior à capacidade de aproveitamento fotoquímico, resultando na emissão de fluorescência.

Paralelamente ao aumento da fluorescência observou-se um decréscimo no teor de clorofila. O coeficiente de correlação negativa entre essas duas variáveis foi altamente significativa tanto na variedade RB863129 (-0,847) como na variedade RB867515 (-0,854). A variedade RB867515, entretanto, apresentou um maior incremento na fluorescência e uma maior redução no teor de clorofila do que a variedade RB863129 (TAB. 1). A variedade RB867515, portanto, apresenta uma maior aclimatação ao estresse imposto, visto que a maior redução do teor de clorofila é um mecanismo de defesa por reduzir a captação de energia luminosa e consequentemente diminuir o fluxo de elétrons para a cadeia de transferência de elétrons, uma vez que essa está altamente reduzida favorecendo a redução parcial do oxigênio que resulta na formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) (BROSCHÉ et al., 2010). A redução do teor de clorofila em função do incremento do nível de sal é uma resposta frequente em várias espécies vegetais, entre elas Grewia tenax (HUNSCHE et al., 2010), Jatropha curcas (SILVA et al., 2010) e Tamarindus indica (HUNSCHE et al., 2010). É interessante destacar que algumas espécies, como o Arachis hipogaea, não apresentam alteração significativa nos parâmetros associados à emissão da fluorescência sob condições de estresse (CORREIA et al., 2009).

A condição de desequilíbrio entre a atividade fotoquímica e bioquímica da fotossíntese favorece a geração de ROS (SOUZA et al., 2005), o que resulta numa maior demanda por um eficiente mecanismo antioxidante de defesa para evitar o estresse oxidativo (CAVALCANTI et. al., 2004). No que se refere à decomposição de espécies reativas, e mais especificamente do H₂O₂, observou-se, de uma maneira geral, o incremento na atividade da APX e da CAT em ambas as variedades quando submetidas a até aproximadamente 100 mM de NaCl. A partir de 100 mM de NaCl, estresse salino severo, observou-se uma queda progressiva nas atividades dessas enzimas (FIG. 4 e 5).

As variedades de cana-de-açúcar RB867515 e RB863129 apresentaram valores similares da atividade da peroxidase do ascorbato (APX) no tratamento controle e no de 25 mM de NaCl (FIG. 4). No entanto, os valores de atividade divergem entre as duas variedades em função do aumento da concentração salina. Na variedade RB863129 a atividade da APX decaiu em aproximadamente 190 U min^-1 mg^-1 de proteína solúvel, a cada incremento de 25 mM de NaCl. Por outro lado, na variedade RB867515 ocorreu um incremento da atividade dessa enzima, com valores máximos atingidos a 75 e 100 mM de NaCl. As APXs são consideradas as enzimas mais importantes na eliminação de H₂O₂ tanto no citosol quanto nos cloroplastos (INZÉ; VAN MONTAGU, 1995). Geralmente o maior incremento na atividade da APX caracteriza variedades com maior tolerância ao NaCl como constatado em Sesamum indicum (KOCA et al., 2007), Beta vulgaris (BOR et al. 2003 ), Lycopersicon (MITTOVA et al. 2002), e Vigna unguiculata (MAIA et al., 2010). A partir de 100 mM de NaCl observou-se o decréscimo da atividade da APX na variedade RB 867515. Segundo Munns et al. (2002) níveis de NaCl superiores a 100 mM provocam a inibição de uma vasta gama de enzimas.

Da mesma forma que a APX, a atividade da CAT foi maior na variedade RB867515 (TAB. 1, FIG. 5). Em diversas espécies como Sesamum indicum (KOCA et al., 2007), Cassia angustifolia (AGARWAL, PANDEI, 2004), Echinochloa crusgalli L. (ABOGADALLAH et al, 2010) e Chenopodium álbum (YAO et al., 2010) foi observado um incremento da atividade da CAT, sendo o mesmo considerado uma habilidade para fazer frente às espécies reativas de oxigênio. Na variedade RB863129, foi observado decréscimo moderado da atividade da CAT quando as plantas foram submetidas ao estresse salino.

A atividade da POD, na variedade RB867515, tendeu a se manter constante até a concentração de 100 mM de NaCl, a partir da qual detectou-se o incremento da atividade dessa enzima (FIG. 6). A variedade RB863129, por sua vez, também apresentou tendência de aumento da atividade da POD a partir de 100 mM de NaCl. O aumento da atividade da peroxidase minimiza os efeitos prejudiciais do estresse salino e, ademais, responde pela regulação fina da concentração do H₂O₂ em função da grande afinidade com esta ROS (MITTLER, 2002; ABOGADALLAH et al., 2010).

Os resultados indicam a maior capacidade de aclimatação da variedade RB867515, uma vez que apresentou uma menor redução da massa fresca associada ao maior incremento da atividade da peroxidase do ascorbato (APX) e da catalase (CAT), além de redução do teor de clorofila, caracterizando sua estratégia de aclimatação.

Conclusão

A relação entre a maior atividade enzimática e o maior crescimento indica uma melhor aclimatação da variedade RB867515 quando comparada à variedade RB863129 sob estresse salino, na fase inicial de crescimento. Observa-se, em ambas as variedades, um aumento na fluorescência paralelo à redução do teor de clorofila à medida que ocorre incremento dos níveis de sal, indicando a perturbação no processo fotossintético.

Recebido para publicação em 31/08/2010; aprovado em 31/01/2011

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Autor para correspondência

Trabalho submetido e selecionado no primeiro Simpósio Brasileiro de Salinidade realizado de 12-15/10/2010 em Fortaleza, Ceará, Brasil; Pesquisa financiada pela CAPES e CNPq

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Maio 2011
• Data do Fascículo
  Jun 2011

Histórico

• Aceito
  31 Jan 2011
• Recebido
  31 Ago 2010