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Revista Ciência Agronômica

Print version ISSN 0045-6888On-line version ISSN 1806-6690

Rev. Ciênc. Agron. vol.47 no.1 Fortaleza Jan./Mar. 2016

http://dx.doi.org/10.5935/1806-6690.20160018 

Crop Science

Rustificação in vitro em diferentes ambientes e aclimatização de microplantas de Comanthera mucugensis Giul. subsp. mucugensis1

In vitro hardening in different enviroment and acclimatization of microplants of Comanthera mucugensis Giul. subsp. mucugensis

Lima-Brito Alone2  * 

Mara Marcia Sampaio Albuquerque2 

Sheila Vitoria Resende3 

Claudia Elena Carneiro2 

José Raniere Ferreira Santana2 

2Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Feira de Santana, Feira de Santana-BA, Brasil, lima_brito@yahoo.com.br, mara_fsa@hotmail.com, carneiro@uefs.br, jose.raniere@gmail.com

3Instituto de Botânica, Universidade Federal da Bahia, Campus de Ondina, Salvador-BA, Brasil, svresende@yahoo.com.br

RESUMO

Neste estudo foi avaliada a influência da radiação fotossinteticamente ativa (RFA) e do fechamento do recipiente de cultivo na rustificação das plantas in vitro e na sobrevivência das mudas aclimatizadas de Comanthera mucugensis Giul. subsp. mucugensis, tendo em vista aumentar a taxa de sobrevivência durante a aclimatização. Os brotos micropropagados em meio MS ½ foram mantidos sob três RFAs: 60; 120 e 300 µmol m-2 s-1. Após 40 dias da inoculação, o filme PVC utilizado para fechar os tubos foi substituído por três tipos de fechamento: PVC, tampa plástica e algodão. Aos 60 dias de cultivo, foram realizadas análises anatômicas, de perda de água e do crescimento das plantas. Para a aclimatização, parte das plantas foram transferidas para viveiro e cobertas com garrafas PET. As maiores taxas de crescimento e sobrevivência in vitro foram obtidas a 60 µmol m-2 s-1 de RFA. Os resultados de crescimento para a maioria dos parâmetros avaliados não diferiram entre PVC e tampa plástica, sendo significativamente superiores às médias obtidas no tratamento com algodão, independente da RFA. A espécie não demonstrou plasticidade fenotípica para os caracteres foliares avaliados. As maiores médias para porcentagem de sobrevivência na aclimatização foram obtidas nas plantas oriundas dos tratamentos com PVC (76.12%) e tampa (73.28%) sob RFA de 60 µmol m-2 s-1. Estes resultados indicam que a micropropagação convencional é um método viável para a produção de mudas de C. mucugensis subsp. mucugensis.

Palavras-chave: Sempre-viva; Rustificação; Aeração; Luz

ABSTRACT

The present study evaluated the influence of photon flux density and the type of culture vessel seal on the hardening of in vitro plants and on the survival of seedlings acclimatized of C. mucugensis subsp. mucugensis, in order to increase the survival during acclimatization. Micropropagated shoots were maintained under three different levels of photosynthetically active radiation (PAR): 60; 120 and 300 µmol m-2 s-1. Forty days after inoculation, the PVC that was used to close the tubes was exchanged for three different types of seals: PVC, caps and cotton. At 60 days of cultivation the plants were analyzed as anatomy, loss of water and growth. For acclimatization, some plants were transferred to green houses and covered with the top halves of PET bottles. The greatest in vitro growth and survival rates were obtained at light intensities of 60 µmol.m-2.s-1 of PAR. The results observed for all of the variables did not differ with the use of PVC or cap closures, but were significantly inferior when cotton closures were used, independent of the light regime. The species did not demonstrate phenotypic plasticity among the leaf characters examined. The best survival percentage results during acclimatization were obtained with the plants grown using PVC (76.12%) and caps (73.28%) under PAR intensities of 60 µmol m-2 s-1. These results indicated that conventional micropropagation is a viable method for producing plantlets of C. mucugensis subsp. mucugensis.

Key words: Sempre-viva; Hardening; Aeration; Light

INTRODUÇÃO

Comanthera mucugensis Giul. subsp. mucugensis, sempre-viva de Mucugê, é uma herbácea ornamental endêmica do município de Mucugê na Chapada Diamantina na Bahia (CERQUEIRA; FUNCH; BORBA, 2008). A ameaça de extinção a que esta espécie está exposta e a significativa importância para o comércio de flores secas ornamentais do Brasil e do exterior justifica o investimento em estudos que estabeleçam metodologias para a sua propagação e conservação.

A micropropagação tem sido indicada como uma alternativa viável para a produção de mudas desta espécie (LIMA-BRITO et al., 2011) e de outras sempre-vivas, como Syngonanthus elegantulus (PEGO; PAIVA; PAIVA, 2013) e Syngonanthus elegans (PEGO; PAIVA; PAIVA, 2014). Esta técnica envolve quatro etapas: estabelecimento da cultura in vitro, multiplicação, enraizamento dos brotos e aclimatização das mudas (GRATAPPAGLIA; MACHADO, 1998).

A aclimatização representa para algumas espécies um fator limitante na produção, em decorrência dos altos índices de mortalidade, baixa taxa de crescimento e desuniformidade das mudas micropropagadas (HAZARIKA, 2006; OLIVEIRA et al., 2010; ROCHA et al., 2008; SILVA et al., 2011).

O déficit hídrico resultante da elevada transpiração das plantas durante a transferência para a condição ex vitro, é uma das principais causas da mortalidade das mudas na etapa de aclimatização (BARBOZA et al., 2006). Essa baixa regulação da perda de água ocorre porque, em geral, as plantas in vitro possuem estômatos pouco funcionais, além de reduzido espessamento da cutícula e da parede das células epidérmicas, pequeno desenvolvimento do mesófilo foliar, com muitos espaços intercelulares e ausência ou reduzido número de tricomas na epiderme (HAZARIKA, 2006; KHAN et al., 2003).

Em adição a regulação hídrica, a transição do metabolismo heterotrófico para autotrófico desempenha papel fundamental na etapa de aclimatização. A atividade fotossintética das plantas in vitro é limitada principalmente pela reduzida intensidade luminosa, baixa concentração de CO2 no recipiente de cultivo e presença de sacarose no meio de cultura que é, em geral, a única ou principal fonte de carbono para o crescimento e desenvolvimento das plantas in vitro (DECCETTI et al., 2008).

Assim, a transferência do ambiente in vitro para o ambiente ex vitro requer alterações nas plantas micropropagadas, a fim de reduzir o estresse causado pelas diferenças entre as condições ambientais (BARBOZA et al., 2006; SILVEIRA et al., 2013). Em geral, essas alterações são induzidas em uma fase denominada rustificação, que consiste na exposição gradual das plantas às condições externas ao ambiente de cultivo, e pode ocorrer in vitro e/ou durante o período de aclimatização (BATAGIN et al., 2009). Entre os procedimentos que induzem tais alterações in vitro, destacam-se o aumento na intensidade luminosa, a aeração das culturas e a redução ou eliminação da sacarose do meio de cultura (BADR et al., 2011; ERIG; SCHUCH, 2005; SILVA et al., 2014).

Após a retirada das culturas da condição in vitro, a manutenção de temperaturas amenas, alta umidade relativa do ar e a redução da incidência direta de luz sobre as plantas favorecem a sua adaptação à condição ex vitro, evitando o estresse (MACIEL; SILVA; PASQUAL, 2000).

O objetivo deste estudo foi avaliar a influência da RFA e do fechamento do recipiente de cultivo na rustificação in vitro e na aclimatização das plantas de C. mucugensis subsp. mucugensis.

MATERIAL E MÉTODOS

No experimento foram utilizados, como explantes, brotos com aproximadamente 20 mm de comprimento, obtidos por organogênese direta em meio de cultura MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) com metade da concentração salina (MS ½).

Os brotos foram inoculadas em meio MS ½, contendo 7 gL-1 de ágar, 15 gL-1 de sacarose e 4,9 µM de AIB. O pH do meio foi ajustado para 5,7 antes da autoclavagem (121 ºC por 15 minutos). Todos os procedimentos de inoculação in vitro foram feitos em câmara de fluxo laminar horizontal.

Os recipientes utilizados foram tubos de ensaio (25 x 150 mm), fechados com película de polivinilcloreto (PVC). Após 40 dias da inoculação, o PVC foi trocado por três tipos de fechamento dos tubos: PVC, tampa plástica e tampão de algodão.

As culturas foram mantidas na sala de crescimento a 25 ± 3 ºC, fotoperíodo de 16 horas, sob três radiações fotossinteticamente ativas (RFA): 60; 120 e 300 µmol m-2 s-1. A iluminação foi fornecida por lâmpadas fluorescentes do tipo branca fria e a RFA foi ajustada em função do número de lâmpadas nas estantes. As medidas da irradiância de fótons foram realizadas com um IRGA (LCi/ADC).

Aos 60 dias de cultivo foi avaliada a porcentagem de sobrevivência das plantas; e dez plantas de cada tratamento foram submetidas à análise da perda de água e do crescimento.

Para verificar a perda de água avaliou-se a matéria fresca da planta no momento da retirada do recipiente de cultivo e após 30; 60; 90 e 120 minutos de exposição às condições ambientais, com base na metodologia de Mills e Tal (2004).

Para análise do crescimento das plantas avaliou-se a porcentagem de enraizamento, o número de raízes, o comprimento da maior raiz, o número de folhas verdes e senescentes, o comprimento da maior folha e a matéria seca das plantas.

As análises histológicas foram realizadas em quatro plantas de cada tratamento, das quais foram retiradas as primeiras folhas totalmente expandidas. A região mediana de cada folha foi seccionada transversalmente à mão livre, com auxilio de lâmina de barbear, sendo utilizadas duas secções por folha, em um total de oito amostras por tratamento. Utilizou-se como controle plantas desenvolvidas em condições naturais no Parque Municipal de Mucugê (12º59’83’’ S e 42º20’91’’ W).

As amostras foram clarificadas em hipoclorito de sódio 3% por 15 minutos, lavadas em água destilada e coradas com solução aquosa de 0,1% de safranina e 0,1% de astra azul (BUKATSCH, 1972). Os cortes foram observados e fotografados em microscópio Olympus mod. BX 40 acoplado a uma câmara digital Olympus 5.1 megapixel, mod. Camedia C5060.

Para as observações ao microscópio eletrônico de varredura (MEV), foram utilizados segmentos de aproximadamente 0,5 cm2 da região mediana das duas primeiras folhas, completamente expandidas, de quatro plantas de cada tratamento, em um total de oito amostras por tratamento.

As amostras foram fixadas em Karnovisk modificado e desidratadas em série etílica crescente, sendo em seguida secas ao ponto crítico CPD 030 (Balzers). Posteriormente, as amostras foram afixadas em fita dupla face de carbono e em suporte metálico, submetidas à metalização com ouro em “sputtering” SCD 050 (Balzers) e eletromicrografadas em microscópio eletrônico de varredura LEO 1430 VP (Carl Zeiss do Brasil). Para a avaliação da densidade estomática, diâmetro polar (DP) e equatorial (DE) do estômato - para o cálculo da relação DP/DE - foram utilizados dois campos por amostra, sendo observados dezesseis campos por tratamento. A densidade estomática foi expressa em mm2 (LABOURIAU; OLIVEIRA; SALGADO-LABORIAU, 1961).

As plantas foram transferidas para potes plásticos contendo 500 g de substrato composto de solo + areia + vermiculita (1:1:1) e cobertas com garrafas “PET” (2L), as quais foram destampadas aos 15 dias e retiradas aos 30 dias após a transferência. As plantas foram mantidas em viveiro, tipo telado com sombrite a 50% de luminosidade. A irrigação foi feita diariamente e a porcentagem de sobrevivência das plantas foi determinada 90 dias após a transferência para a condição ex vitro.

O delineamento experimental da etapa in vitro foi inteiramente casualizado (DIC), em arranjo fatorial 3 x 3 (fechamento x RFA), com dez repetições e quatro tubos por repetição (um explante por tubo). Na etapa de aclimatização utilizou-se o DIC em arranjo fatorial 3 x 2 (fechamento x RFA), com quatro repetições e cinco plantas por repetição.

Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo Teste Tukey a 5% de probabilidade, utilizando o software SISVAR 4.3 (FERREIRA, 2003).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Em todos os tratamentos testados, a perda de água por transpiração foi maior nos primeiros 30 minutos de exposição ao ambiente, com um decréscimo nos períodos subsequentes (Tabela 1).

Tabela 1 Valores médios para redução da matéria fresca (%) de plantas de Comanthera mucugensis Giul. subsp. mucugensis aos 30 minutos, entre 30 e 60, entre 60 e 90, entre 90 e 120 minutos, após exposição a condições ambientais, em função do tipo de fechamento do recipiente de cultivo e da radiação fotossintética ativa (RFA) 

RFA (μmol m-2 s-1) PVC Tampa Algodão Média
30 minutos
60 8,78 Aa 6,66 Ab 2,51 Ac 5,98 A
120 8,03 ABa 5,30 ABb 1,80 ABc 5,04 AB
300 7,51 Ba 4,45 Bb 1,30 Bc 4,44 C
Média 8,11 a 5,47 b 1,87 c
30 a 60 minutos
60 6,54 Aa 6,55 Aa 2,33 Ab 5,14 A
120 5,95 Aba 5,30 Ba 1,78 ABb 4,35 B
300 5,45 Ba 4,21 Cb 1,06 Bc 3,57 C
Média 5,98 a 5,35 a 1,72 b
60 a 90 minutos
60 5,67 Ab 6,41 Aa 1,96 Ac 4,68 A
120 4,38 Bb 5,40 Ba 1,68 ABc 3,82 B
300 3,57 Ca 3,92 Ca 1,08 Bb 2,99 C
Média 4,54 a 5,24 a 1,57 b
90 a 120 minutos
60 4,56 Ab 5,84 Aa 1,83 Ac 4,07 A
120 3,82 Ba 4,38 Ba 1,05 ABb 3,08 B
300 2,98 Ca 3,54 Ca 0,84 Bb 2,46 C
Média 3,78 a 4,59 a 1,24 b
Média Geral 22,41 a 20,65 a 6,40 b

Médias seguidas pela mesma letra, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas linhas, não diferem significativamente entre si pelo teste Tukey (p≤0,05)

Não houve interação entre o tipo de fechamento e a RFA para a redução de matéria fresca das plantas (p≤0,05). Aos 30 minutos de exposição às condições ambientais, as maiores médias para esta variável foram obtidas nos tratamentos com PVC, em todas as RFAs testadas. Nos demais períodos as médias obtidas nos tratamentos com PVC e tampa não diferiram entre si, sendo significativamente superiores aos resultados observados para plantas mantidas em tubos fechados com algodão (Tabela 1).

Após 120 minutos de exposição ao ambiente, houve uma redução total da matéria fresca de, aproximadamente, 20% para as plantas dos tratamentos com PVC e tampa, o que representa uma perda de água 70% maior do que as plantas oriundas de tubos fechados com algodão (Tabela 1).

Em todos os períodos analisados, as médias obtidas para redução da matéria fresca das plantas expostas a 60 µmol m-2 s-1 foram significativamente superiores a 300 µmol m-2 s-1, independente do tipo de fechamento utilizado (Tabela 1). Ao final dos quatro períodos de exposição às condições ambientais, as plantas submetidas a 60 µmol m-2 s-1 apresentaram uma redução total de 19,87% em relação a sua matéria fresca inicial, o que representa uma perda de água aproximadamente 33% maior que as plantas submetidas a 300 µmol m-2 s-1 (13,46%).

O decréscimo da transpiração observado nas plantas de C. mucugensis subsp. mucugensis, em função do aumento do período de exposição às condições ambientais, pode estar relacionado a ativação do controle estomático em resposta à demanda evaporativa do ambiente. Quando expostas à condição ex vitro, as plantas cultivadas em tubos fechados com algodão apresentaram uma menor perda de água em comparação às oriundas dos tubos vedados com PVC ou tampa, corroborando os resultados obtidos para Ortophytum mucugense por Bellintani et al. (2007). De acordo com os autores, a redução de aproximadamente 50% da transpiração obtida nos tratamentos com algodão em relação aos tratamentos com PVC, seria decorrente das alterações anatômicas de Ortophytum mucugense, em resposta ao aumento das trocas gasosas e redução da umidade nos recipientes de cultivo vedados com tampas permeáveis.

Em C. mucugensis subsp. mucugensis, a menor perda de água observada nos tratamentos utilizando algodão em comparação aos demais tipos de fechamento dos tubos, não está relacionada a alterações anatômicas, uma vez que não foram encontradas diferenças para as características da epiderme e dos estômatos entre as plantas submetidas às diferentes condições de cultivo, o que é resultante da manutenção das características xeromórficas in vitro de C. mucugensis subsp. mucugensis. A reduzida transpiração pode ser atribuída ao déficit hídrico pré-existente das plantas cultivadas em tubos fechados com algodão. A permeabilidade do algodão às trocas gasosas permite a evaporação da água do meio de cultura, o que reduz o potencial hídrico do meio e, consequentemente, da planta.

As análises anatômicas realizadas demonstraram que as folhas de C. mucugensis subsp. mucugensisin vitro apresentam adaptações ambientais xeromórficas, tais como células epidérmicas com paredes espessadas; cutícula, mesófilo compacto, hipoderme, parênquima aquífero e estômatos distribuídos na face abaxial (Figura 1). O xeromorfismo é relatado para o gênero Comanthera como uma resposta adaptativa das plantas a ambientes secos, ventos fortes e alta intensidade luminosa, próprios dos campos rupestres brasileiros, onde ocorrem as espécies deste gênero (SCATENA; VICHI; PARRA, 2004).

Figura 1 Secção transversal da folha de Comanthera mucugensis Giul. subsp. mucugensis, cultivada em recipiente vedado com PVC à 60 µmol m-2 s-1 A. vista geral da folha, B. margem da folha com hipoderme, C. mesófilo com parênquima aqüífero e clorofiliano. D. feixe vascular, E. epiderme adaxial, F. epiderme abaxial, G. cutícula ornamentada, H. estômato. be- bainha externa, bi- bainha interna, c- cutícula, cs- câmara subestomática, e- epiderme, eab- epiderme abaxial, ead- epiderme adaxial, es- estômato h- hipoderme, pa- parênquima aqüífero, pc- parênquima clorofiliano. (barra: A. 0,5 mm; B-H 0,1 mm) 

A manutenção das características xeromórficas em C. mucugensis subsp. mucugensis contradiz diversos trabalhos que descrevem a anatomia das plantas in vitro. Em geral, as plantas in vitro não possuem mecanismos contra a perda de água, em função de sua adaptação ao ambiente com elevada umidade e baixa irradiância de fótons (BELLINTANI et al., 2007; COSTA et al., 2009; SANTANA et al., 2008).

A similaridade anatômica observada nas plantas de C. mucugensis subsp. mucugensis submetidas às diferentes condições de cultivo in vitro e as plantas in vivo demonstra que esta espécie não possui plasticidade fenotípica para os caracteres foliares analisados, o que pode estar relacionado a reduzida variabilidade genética da espécie e ao seu endemismo restrito a condições de clima árido (CERQUEIRA; FUNCH; BORBA, 2008; PEREIRA; BORBA; GIULIETTI, 2007).

Os resultados observados para densidade estomática e relação DP/DE não diferiram entre os tratamentos analisados (Tabela 2). As médias obtidas para relação DP/DE (1,92 µm) estão relacionadas a forma elíptica apresentada pelos estômatos. Resultados similares foram obtidos para espécies do gênero Cymbidium in vitro (BOSA et al., 2003). Diferente do observado em C. mucugensis subsp. mucugensis, a maioria das plantas cultivadas in vitro apresenta estômatos com formato esférico e uma baixa relação DP/DE, quando comparadas com plantas do ambiente natural (HAZARIKA, 2006). Em geral, os estômatos elípticos são funcionais e os esféricos possuem baixa funcionalidade (KHAN et al., 2003).

Tabela 2 Valores médios para densidade estomática e relação DP/DE dos estômatos de plantas de Comanthera mucugensis Giul. subsp. mucugensis, em função do tipo de fechamento do recipiente de cultivo e da radiação fossinteticamente ativa (RFA) durante a pré-aclimatização 

RFA (μmol m-2 s-1) PVC Tampa Algodão Média Geral
Densidade estomática (nr/mm2)
60 55,85 Aa 56,06 Aa 56,50 Aa 56,14 A
120 56,10 Aa 55,85 Aa 56,25 Aa 56,07 A
300 55,80 Aa 56,00 Aa 55,00 Aa 55,60 A
Média Geral 55,92 a 55,97 a 55,91 a
Relação DP/DE
60 1,91 Aa 2,08 Aa 1,93 Aa 1,97 A
120 1,98 Aa 1,79 Aa 1,95 Aa 1,91 A
300 1,90 Aa 1,84 Aa 1,94 Aa 1,89 A
Média Geral 1,93 a 1,90 a 1,94 a

Médias seguidas pela mesma letra, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas linhas, não diferem significativamente entre si pelo teste Tukey a 5% de probabilidade

Os estômatos, presentes apenas na face abaxial, apresentaram-se elípticos, fechados e dispostos em faixas contínuas paralelas ao maior eixo das folhas (Figura 2). A presença dos estômatos fechados em todas as amostras analisadas comprova o seu funcionamento e diverge dos resultados encontrados para diversas espécies vegetais cultivadas in vitro, que apresentaram estômatos abertos (BARBOZA et al., 2006; ZOBAYED; ARMSTRONG; ARMSTRONG, 2001).

Figura 2 Eletromicrografia da folha de Comanthera mucugensis Giul. subsp. mucugensis, cultivada em recipiente vedado com PVC à 60 µmol m-2 s-1. A. estômato; B. tricoma malpiguiáceo; C. epiderme abaxial com estômatos em faixas paralelas e tricomas; D. epiderme adaxial sem estômatos e com. tricomas nas margens 

Estudos têm relatado a variação da densidade dos estômatos nas plantas in vitro em função de diferentes níveis de intensidade luminosa e sistemas de fechamento dos recipientes de cultivo (DECCETTI et al., 2008; ZOBAYED; ARMSTRONG; ARMSTRONG, 2001). Entretanto, para C. mucugensis subsp. mucugensis, não foram encontradas diferenças significativas entre os tratamentos para esta variável, o que deve estar relacionado a ausência de plasticidade fenotípica na espécie estudada. O valor médio para a densidade estomática, obtido em todos os tratamentos, foi de aproximadamente 56 estômatos por mm2, média similar a obtida para plantas de Ananas comosus L. in vitro (54), e inferior a observada para a mesma espécie em casa de vegetação (62) por Barboza et al. (2006), que consideraram estes dados baixos para espécies xeromórficas.

Em todos os tratamentos in vitro observou-se a presença de tricomas malpighiáceos unicelulares, ramificados, com dois braços opostos (Figura 2B). Os tricomas distribuíam-se em maior quantidade na face abaxial das folhas, com uma grande concentração nas margens foliares (Figura 2C-D).

A ocorrência de tricomas malpighiáceos nas plantas pode representar uma adaptação à perda de água pelas folhas, por meio da regulação da temperatura pela reflexão da luz (LARCHER, 2000). No entanto, embora os tricomas observados em C. mucugensis subsp. mucugensis sejam relatados para outras herbáceas in vitro, sua função não pode ser atribuída às condições do ambiente de cultivo, que caracteriza-se pela baixa luminosidade e alta umidade no recipiente de cultivo (BARBOZA et al., 2006; BATAGIN et al., 2009).

Os valores obtidos para as variáveis porcentagem de sobrevivência das plantas, comprimento da maior folha, matéria seca da planta e número de folhas verdes não diferiram entre os tipos de fechamentos PVC e tampa, sendo significativamente superiores às médias obtidas no tratamento com algodão, em todas as RFAs testadas (Tabela 3). Estes resultados podem ser atribuídos ao déficit hídrico das plantas, resultante da evaporação da água do meio de cultura no recipiente com maior aeração (algodão) em relação aos demais fechamentos testados. O défict hídrico é um importante fator limitante do crescimento e desenvolvimento da planta, levando a modificações morfológicas, bioquímicas e fisiológicas, e consequentemente afetando a sua sobrevivência (GIROTTO et al., 2012; HOMAYOUN; DALIRI; MEHRAB, 2011).

Tabela 3 Valores médios para porcentagem de sobrevivência das plantas, comprimento da maior folha, matéria seca da planta, número de folhas verdes e senescentes, porcentagem de enraizamento, comprimento da maior raiz e número de raízes por plantas de Comanthera mucugensis Giul. subsp. mucugensis em função do tipo de fechamento do recipiente de cultivo e da radiação fotossinteticamente ativa (RFA) durante o período da pré-aclimatização 

RFA (μmol m-2 s-1) PVC Tampa Algodão Média Geral
Sobrevivência das plantas (%)
60 100,00 Aa 100,00 Aa 86,00 Ab 95,33 A
120 92,50 Aa 90,00 Aa 80,00 Ab 87,50 A
300 56,00 Ba 50,00 Ba 25,50 Bb 43,83 B
Média Geral 82,83 a 80,00 a 63,83 b
Comprimento da maior folha (mm)
60 24,80 Aa 22,60 Aa 18,00 Ab 21,80 A
120 23,50 Aa 21,70 Aa 17,80 Ab 21,00 A
300 10,50 Ba 10,60 Ba 4,50 Bb 8,53 B
Média Geral 19,60 a 18,30 a 13,43 b
Matéria seca da planta (mg)
60 67,87 Aa 65,26 Aa 53,70 Ab 62,28 A
120 55,36 Ba 54,41 Ba 42,54 Bb 50,77 B
300 31,17 Ca 34,20 Ca 19,70 Cb 28,36 C
Média Geral 51,47 a 51,29 a 38,65 b
Número de folhas verdes
60 29,00 Aa 28,35 Aa 18,75 Ab 25,37 A
120 22,75 Ba 21,75 Ba 14,45 Ab 19,65 B
300 15,83 Ca 14,10 Ca 6,45 Bb 12,13 C
Média Geral 22,53 a 21,40 a 13,22 b
Número de folhas senescentes
60 8,45 Cc 11,95 Bb 18,70 Ba 13,03 C
120 15,85 Bb 17,35 ABb 23,60 Aa 18,93 B
300 20,45 Aa 22,89 Aa 23,75 Aa 22,36 A
Média Geral 14,92 a 17,60 a 15,35 a
Enraizamento (%)
60 97,80 Aa 98,00 Aa 96,43 Aa 97,41 A
120 96,74 Aa 97,40 Aa 96,00 Aa 96,71 A
300 95,48 Aa 95,82 Aa 94,39 Aa 95,23 A
Média Geral 96,67 a 97,07 a 95,61 a
Comprimento da maior raiz (mm)
60 15,60 Aa 15,20 Aa 16,10 Aa 15,60 A
120 13,70 Aa 13,40 Aa 15,60 Aa 14,20 A
300 4,10 Ba 5,70 Ba 5,00 Ba 4,90 B
Média Geral 1,11 a 1,14 a 1,22 a
Número de raízes por planta
60 14,55 Aa 14,10 Aab 11,02 Ab 13,22 A
120 13,70 Aa 13,15 Aa 9,60 Ab 12,15 A
300 8,35 Ba 7,58 Ba 6,80 Ba 7,58 B
Média Geral 12,20 a 11,61 a 9,14 b

Médias seguidas pela mesma letra, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas linhas, não diferem significativamente entre si pelo teste Tukey a 5% de probabilidade

As maiores médias para taxas de sobrevivência e crescimento foram obtidas à 60 µmol m-2 s-1, que diferiram significativamente de 300 µmol.m-2 s-1, independente do tipo de fechamento, o que pode estar relacionado ao estresse foto oxidativo das plantas submetidas a alta intensidade luminosa. Para porcentagem de sobrevivência das plantas e comprimento da maior folha, não foram observadas diferenças significativas entre as médias obtidas nos tratamentos com 60 e 120 µmol m-2 s-1 (Tabela 3).

A interação “tipo de fechamento x RFA” influenciou significativamente o número de folhas senescentes (p≤0,05). As menores médias para esta variável foram obtidas nos tratamentos com PVC a 60 µmol m-2 s-1. Comparando os tipos de fechamento para esta variável, observou-se que o uso de algodão determinou médias significativamente superiores aos demais tratamentos nas plantas submetidas a 60 µmol m-2 s1 (18,70) e 120 µmol m-2 s-1 (23,60). Nas plantas mantidas à 300 µmol m-2 s-1, não houve diferença significativa entre os tipos de fechamentos para número de folhas senescentes (Tabela 3). Entre as irradiâncias de fótons testadas, as menores médias para esta variável foram obtidas à 60 µmol m-2 s-1 e as maiores à 300 µmol m-2 s-1 (Tabela 3).

As plantas apresentaram uma alta porcentagem de enraizamento, não havendo diferenças significativas entre os tratamentos (Tabela 3). O comprimento da maior raiz não foi influenciado pelo tipo de fechamento, entretanto, o aumento da RFA influenciou negativamente esta variável. Não houve diferença significativa para o comprimento da maior raiz entre as médias observadas em 60 µmol m-2 s-1 (15,60mm) e 120 µmol m-2 s-1 (14,20mm), as quais foram significativamente superiores as obtidas a 300 µmol m-2 s-1 (4,90mm) (Tabela 3).

Em C. mucugensis subsp. mucugensis, as menores médias para comprimento da maior raiz, obtidas nas plantas submetidas a maior intensidade luminosa e aeração, bem como o reduzido número de raízes observados com o fechamento com algodão na maior irradiância de fótons testada, podem ser atribuídas ao déficit hídrico e/ou estresse foto oxidativo nestes tratamentos.

As médias observadas para número de raízes nas plantas submetidas a 300 µmol m-2 s-1 foram significativamente inferiores aos valores obtidos nas irradiâncias de fótons 60 e 120 µmol m-2 s-1, os quais não diferiram entre si em todos os fechamentos (Tabela 3). Os valores obtidos no tratamento com algodão foram significativamente inferiores aos observados no tratamento com PVC sob 60 e 120 µmol m-2 s-1 de RFA. Nas plantas mantidas a 300µmol m2 s-1 não houve diferença significativa entre os fechamentos para esta variável (Tabela 3). Estes resultados indicam que o enraizamento in vitro de C. mucugensis é obtido em condições convencionais de cultivo (tubos fechados com PVC e 60 de RFA µmol m-2 s-1). A indução de raízes in vitro é um importante evento organogênico que irá garantir a sobrevivência das mudas durante a aclimatização.

Na etapa de aclimatização foram utilizadas, apenas, as plantas cultivadas sob RFA de 60 e 120 µmol m-2 s-1, em decorrência das reduzidas porcentagens de sobrevivência obtidas nos tratamentos submetidos a 300 µmol m-2 s-1 de RFA. Aos 90 dias da aclimatização, as médias para porcentagem de sobrevivência das plantas oriundas dos tubos fechados com PVC (70,32%) e tampa (66,73%) foram significativamente superiores ao tratamento com tampão de algodão (38,69%), independente da intensidade luminosa (Tabela 4). Comparando-se as RFAs, os resultados obtidos a 60 µmol m-2 s-1 foram significativamente superiores a 120 µmol m-2 s-1, nos três tipos de fechamento testados (Tabela 4).

Tabela 4 Valores médios para sobrevivência das plantas aclimatizadas de Comanthera mucugensis Giul. subsp. mucugensis, 90 dias após transferência para a condição ex vitro, em função do tipo de fechamento do recipiente de cultivo e da radiação fotossinteticamente ativa (RFA) durante o período de pré-aclimatização 

RFA (μmol m-2 s-1) PVC Tampa Algodão Média Geral
% de sobrevivência das plantas
60 76,12 Aa 73,28 Aa 42,35 Ab 63,92 A
120 64,53 Ba 60,19 Ba 35,04 Bb 53,25 B
Média Geral 70,32 a 66,73 a 38,69 b

Médias seguidas pela mesma letra, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas linhas, não diferem significativamente entre si pelo teste F a 5% de probabilidade

O efeito negativo do aumento da irradiância de fótons sobre a perda de água, sobrevivência, desenvolvimento da parte aérea e comprimento e número de raízes em C. mucugensis subsp. mucugensis durante a pré-aclimatização, pode estar relacionado ao estresse foto oxidativo tendo em vista que os brotos foram oriundos de um menor nível de RFA (60 µmol m-2 s-1). Resultados semelhantes foram observados para Musa spp (COSTA et al., 2009).

As porcentagens de sobrevivência das plantas aclimatizadas, oriundas do cultivo heterotrófico in vitro com tampa (76,12%) e PVC (73,28%) sob 60 µmol m-2 s-1, sugerem que C. mucugensis subsp. mucugensis não necessita de tratamentos de rustificação in vitro e que a mudança de metabolismo heterotrófico para autotrófico não é um fator limitante para a aclimatização desta espécie (Tabela 4).

Estes resultados podem estar relacionados as características xeromórficas mantidas pelas folhas e a funcionalidade dos estômatos, o que impediu a perda de água durante a aclimatização. Além disso, a aclimatização pode ter sido favorecida pela utilização de garrafas PET, as quais permitiram a manutenção de alta umidade relativa no microambiente, reduzindo o risco de déficit hídrico das plantas.

CONCLUSÕES

  1. O aumento da intensidade luminosa e da aeração das culturas afetou negativamente o crescimento in vitro e a sobrevivência das plantas durante a aclimatização;

  2. C. mucugensis subsp. mucugensis não possui plasticidade fenotípica para os caracteres foliares analisados em função dos tipos de fechamento e intensidade luminosa testados, mantendo as características foliares xeromórficas apresentadas no ambiente natural;

  3. As plantas micropropagadas de C. mucugensis subsp. mucugensis podem ser transferidas para a condição ex vitro sem passar por uma fase de rustificação in vitro;

  4. O sucesso na etapa de aclimatização indica que a micropropagação é um método viável para a produção de mudas de C. mucugensis subsp. mucugensis.

Parte da Tese de Doutorado da primeira autora, apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Botânica da Universidade Estadual de Feira de Santana/UEFS, pesquisa financiada pela FAPESB

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Recebido: 27 de Junho de 2014; Aceito: 16 de Outubro de 2015

* Autor para correspondência

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