Germinação in vitro e desenvolvimento pós-seminal de Ruta graveolens L. sob influência de fenantreno e benzo[a]pireno

In vitro germination and post-seminal development of Ruta graveolens L. under the influence of phenanthrene and benzo[a]pyrene

RESUMO

A exposição a contaminantes orgânicos como os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos tem atraído considerável atenção devido aos efeitos dessas substâncias sobre a saúde humana, o ambiente e o desenvolvimento vegetal. O presente estudo objetivou avaliar a influência do fenantreno e do benzo[a]pireno sobre a germinação e o desenvolvimento pós-seminal in vitro de R. graveolens. Sementes comerciais descontaminadas foram inoculadas em tubos de ensaio com meio MS suplementado com 0 (controle); 1,0; 5,0 e 10,0 mg L^-1 de fenantreno e 0 (controle); 0,001; 0,01 e 0,1 mg L^-1 de benzo[a]pireno. Foram avaliados a porcentagem de sementes germinadas, o índice de velocidade de germinação e a entropia. Após dois meses, avaliou-se o comprimento da parte aérea e radicular e contabilizou-se o número de folhas desenvolvidas. Durante o primeiro mês, a presença do fenantreno não alterou o processo germinativo, enquanto que o benzo[a]pireno na concentração de 0,01 mg L^-1 proporcionou aumento significativo da germinação (p≤0,05). Durante o segundo mês, as concentrações de 5,0 mg L^-1 de fenantreno e de 0,001 mg L^-1 benzo[a]pireno resultaram em desenvolvimento radicular significativamente superior. Não foram detectadas diferenças significativas quanto à fitomassa, ao desenvolvimento da parte aérea e número de folhas por plântulas. Tais resultados sugerem potencial para o cultivo de R. graveolens em áreas contaminadas, nos níveis investigados.

Palavras-chave:
Arruda; Bioindicador; Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

ABSTRACT

Exposure to organic contaminants, such as polycyclic aromatic hydrocarbons, has attracted considerable attention due to the effects of these substances on human health, the environment and plant development. This study aimed to evaluate the influence of phenanthrene and benzo[a]pyrene on the germination and post-seminal in vitro development of R. graveolens. Decontaminated commercial seeds were inoculated in test tubes with an MS medium supplemented with 0 (control), 1.0, 5.0 and 10.0 mg L^-1 phenanthrene and 0 (control), 0.001, 0.01 and 0.1 mg L^-1 benzo[a]pyrene. The percentage of germinated seeds, germination speed index and entropy were evaluated. After two months, shoot and root length were all evaluated, and the number of developed leaves was counted. During the first month, the presence of phenanthrene did not alter the germination process, whereas benzo[a]pyrene at a concentration of 0.01 mg L^-1 gave a significant increase in germination (p≤0.05). During the second month, the concentrations of 5.0 mg L^-1 phenanthrene and 0.001 mg L^-1 benzo[a]pyrene resulted in significantly greater root development. No significant differences were found in biomass, shoot development or number of leaves per seedling. Such results suggest the potential for growing R. graveolens in contaminated areas at the levels studied.

Key words:
Rue; Bioindicator; Polycyclic aromatic hydrocarbons

INTRODUÇÃO

A resposta vegetal a diferentes contaminantes orgânicos, tais como os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, tem atraído considerável atenção devido a exposição a estas substâncias estarem relacionadas a efeitos mutagênicos, carcinogênicos e teratogênicos (AHAMMED et al., 2012; ALKIO et al., 2005; MEIRE et al., 2007). Estas substâncias são produzidas pela combustão incompleta de combustíveis fósseis ou em decorrência de acidentes envolvendo petróleo e derivados. Dentre os vários hidrocarbonetos policíclicos aromáticos descritos na literatura, o fenantreno é considerado "composto modelo" para estudos de degradação ambiental por não ser mutagênico ou carcinogênico, sendo encontrado em altas concentrações em amostras ambientais contaminadas por hidrocarbonetos policíclicos aromáticos. As suas características químicas são semelhantes a outros hidrocarbonetos policíclicos aromáticos que são carcinogênicos (GARCÍA; DORANTES, 2008), como o benzo[a]pireno, lipossolúvel e rapidamente absorvido pelo organismo, o qual foi descrito como passível de metabolização em culturas in vitro de diferentes espécies vegetais (LUTTRELL; THOMAS, 2007).

Sabe-se que a resposta fitotóxica a um xenobiótico é, em linhas gerais, caracterizada como uma resposta de estresse que envolve processos de reconhecimento de sinais moleculares para proteção, reparo e tolerância (AHAMMED et al., 2012; ALKIO et al., 2005; GAO et al., 2012). Sendo assim, as pesquisas geobotânicas e a triagem de espécimes vegetais expostas aos xenobióticos são necessárias à identificação de espécies potenciais (AHAMMED et al., 2012; DIÉZ LÁZARO et al., 2006; ZHANG et al., 2010); (AHAMMED et al. 2012). Ensaios sob condições controladas, como ocorre sob condições in vitro, demonstram que as respostas vegetais podem ser exclusivas da espécie em estudo, anulando os efeitos das variações sazonais e favorecendo a produtividade de plantas e substâncias de interesse (REYNOSO-CUEVAS et al., 2008; SINGH; CHATURVEDI, 2012). Além de visar respostas morfogênicas específicas, os sistemas in vitro também são indicados nos estudos relacionados à avaliação da capacidade de as células vegetais tolerar, detoxificar e armazenar/imobilizar substâncias orgânicas contaminantes, sendo possível estudar os fitormônios ativos sob tais condições, viabilizando a realização de testes de toxicidade com contaminantes orgânicos, em concentrações controladas (DEBIANE et al., 2008). Dentre os estudos de desenvolvimento vegetal in vitro, a germinação tem se mostrado uma estratégia importante visto que a própria composição do meio pode influenciar no início do processo e no estabelecimento in vitro de plantas (LENCINA et al., 2014), alterando parâmetros morfológicos e fisiológicos (VICTÓRIO; LAGE, 2009). Os estudos de germinação e desenvolvimento pós-seminal in vitro têm se mostrado de relevância também para o conhecimento de exigências fisiológicas das espécies, sobretudo as de interesse medicinal, viabilizando o fornecimento de material juvenil em condições assépticas para estudos biotecnológicos (CASTRO et al., 2014).

Ruta graveolens L., conhecida por arruda, é uma planta mencionada em farmacopeias de 28 países, cujo uso medicinal deve-se à presença de metabólitos secundários, com destaque para flavonoides (quercitina e rutina), cumarinas (psoraleno e bergapteno), ácidos orgânicos (ácido anísico e caprínico), terpenoides (limoneno e pineno), lactonas e várias classes de alcaloides (BENZARTI et al., 2008; FAISAL et al., 2005; KUZOVKINA et al., 2009). A presença dessas substâncias confere a essa espécie propriedades estimulante, diurética, anti-inflamatória e antitumoral, além de ter seu uso investigado no tratamento de dermatoses, como psoríase e vitiligo (DIWAN et al., 2012; MASSOT et al., 2000; OLIVA et al., 2002).

Tendo em vista a carência de estudos sobre o efeito dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos em espécies vegetais sob condição in vitro (KUMMEROVÁ et al., 2010), este trabalho objetivou avaliar a germinação e o desenvolvimento pós-seminal sob condições in vitro de R. graveolens em meio de cultura contaminado artificialmente com fenantreno e benzo[a]pireno.

MATERIAL E MÉTODOS

A germinação in vitro foi conduzida no Laboratório de Biotecnologia de Plantas (LABPLAN) do Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes (IBRAG), Campus Maracanã da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ), de junho de 2013 a fevereiro de 2014.

O meio de cultura utilizado foi o MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), contendo 30 g L^-1 de sacarose e 8 g L^-1 de ágar, com pH ajustado para 5,8. Após esterilização por autoclavagem à temperatura de 121 ºC e pressão de 1 atm por 15 min, o meio de cultura foi suplementado com fenantreno ou benzo[a]pireno, ambos com 98% de pureza (Sigma Aldrich® Brasil) e dissolvidos em diclorometano (Tedia grau HPLC) (REYNOSO-CUEVAS et al., 2008). As concentrações de fenantreno utilizadas foram: 1,0 mg L^-1 (FEN1); 5,0 mg L^-1 (FEN2); 10,0 mg L^-1 (FEN3). E para benzo[a]pireno foram: 0,001 mg L^-1 (B[a]P1); 0,01 mg L^-1 (B[a]P2); 0,1 mg L^-1 (B[a]P3). Para cada substância (fenantreno ou benzo[a]pireno), foram realizados dois controles: (i) meio MS sem nenhuma suplementação (MS0) e (ii) meio MS contendo apenas diclorometano (MSDCM). A adição do contaminante em tubos de ensaio (15 cm x 2,5 cm) com 10 mL de meio de cultura foi realizada em capela de fluxo laminar. Os tubos vedados com folha dupla de papel alumínio e selados com filme plástico foram mantidos em sala climatizada a 26 ± 2 ºC, com 16 h de fotoperíodo por três dias para garantir a ausência de contaminação microbiana.

Sementes adquiridas comercialmente (ISLA®) foram lavadas em água corrente (5 min), imersas em solução de água/detergente comercial (10%), sob agitação (10 min), cujo processo de descontaminação em condições estéreis seguiu o protocolo de Figueiredo et al. (2001). Após secas em papel de filtro estéril, as sementes descontaminadas foram inoculadas em tubos de ensaio e mantidas nas mesmas condições descritas anteriormente.

O processo germinativo foi avaliado semanalmente, durante quatro semanas, em dias alternados, sendo registrado o número de sementes germinadas em cada tratamento. Foram consideradas germinadas as sementes que apresentaram protrusão da radícula e avaliadas as seguintes variáveis: porcentagem de sementes germinadas, índice de velocidade de germinação e a entropia (índice de sincronização). O índice de velocidade de germinação foi calculado através da fórmula (Equação 1):

(1)

onde: G₁, G₂ e G_n correspondem ao número de sementes germinadas nos dias 1, 2 e n, respectivamente, e o N₁, N₂ e N_n correspondem ao número de dias após a semeadura (MAGUIRE, 1962).

A entropia do processo germinativo foi calculada segundo as fórmulas (2) e (3).

(2)

onde: fi corresponde à frequência relativa da germinação e,

(3)

sendo: n o número de sementes germinadas nos dias analisados, e K corresponde ao último dia de observação da germinação (LABOURIAU; AGUDO, 1987).

O desenvolvimento pós-seminal foi avaliado após dois meses, quando as plântulas foram retiradas do meio de cultura, onde permaneceram por este período, e pesadas em balança analítica eletrônica de precisão (Toledo Brasil modelo AR2140). Foram avaliados os comprimentos das partes aérea e radicular com régua milimétrica e contabilizado o número de folhas desenvolvidas.

O experimento foi delineado em seis tratamentos e quatro controles, cada um com quatro repetições e 80 sementes/tratamento, sendo inteiramente casualizados. Os resultados foram processados utilizando o software Microsoft® Office Excel, interpretados estatisticamente por meio da análise de variância utilizando o programa IBM SPSS Statistics 20® e as médias comparadas pelo teste DMS (Diferença Mínima Significativa) ao nível de 95% (p≤0,05), indicado para comparar a precisão experimental de experimentos com médias semelhantes.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Não foram observadas diferenças significativas para o parâmetro porcentagem de germinação em relação à exposição das sementes ao fenantreno, porém houve aumento nas taxas de germinação no tratamento com MSDCM e B[a]P1 (Tabela 1). Da mesma forma, a presença da mistura de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, em concentrações variando entre 500 mg kg^-1 e 5000 mg kg^-1, não promoveu a alteração da germinação de cinco espécies de gramíneas em meios de cultura contaminado (REYNOSO-CUEVAS et al., 2008).

Tabela 1
Germinação, índice de velocidade de germinação (IVG) e entropia de sementes de arruda (Ruta graveolens L.) germinadas em meio de cultura MS contaminado artificialmente com fenantreno (FEN) e benzo[a]pireno (B[a]P). O ni representa o número de sementes germinadas em cada substrato após quatro semanas

Contaminante	Tratamento*	ni	Média da germinação	Germinação (%)	IVG	Entropia
Fenantreno (FEN)	MS0	73	18 ± 1,0	91,3 a	2,52 ± 0,51 a	2,10 ± 0,29 a
	MSDCM	66	17 ± 1,3	82,5 a	2,18 ± 0,46 a	1,98 ± 0,26 ab
	FEN1	73	18 ± 1,5	91,3 a	2,53 ± 0,28 a	1,72 ± 0,34 ab
	FEN2	66	17 ± 0,6	82,5 a	2,51 ± 0,17 a	1,62 ± 0,29 b
	FEN3	73	18 ± 1,7	91,3 a	2,55 ± 0,28 a	1,88 ± 0,24 ab
Benzo[a]pireno (B[a]P)	MS0	44	11 ± 1,4	55,0 b	0,90 ± 0,15 a	2,28 ± 0,34 a
	MSDCM	58	15 ± 0,6	72,5 a	1,64 ± 0,13 a	2,00 ± 0,28 a
	B[a]P1	59	15 ± 1,0	73,8 a	1,55 ± 0,15 a	1,91 ± 0,29 a
	B[a]P2	57	14 ± 0,5	71,3 ab	1,42 ± 0,12 a	2,16 ± 0,10 a
	B[a]P3	50	13 ± 3,0	62,5 ab	1,23 ± 0,39 a	2,06 ± 0,7 a

• ^*
  MS0: MS sem suplementação; MSDCM: MS + 1 μL de diclorometano; FEN1: MS + 1,0 mg L^-1 de fenantreno; FEN2: MS + 5,0 mg L^-1 de fenantreno; FEN3: MS + 10,0 mg L^-1 de fenantreno; B[a]P1: MS + 0,001 mg L^-1 de benzo[a]pireno; B[a]P2:MS + 0,01 mg L^-1 de benzo[a]pireno; B[a]P3: MS + 0,1 mg L^-1 de benzo[a]pireno. Letras iguais na coluna em cada contaminante não apresentam diferença significativa segundo o teste DMS (p≤0,05) através da comparação das médias de cada tratamento

Não houve variação no parâmetro índice de velocidade de germinação nas concentrações de fenantreno e benzo[a]pireno testadas, porém houve alteração do equilíbrio da germinação (entropia) de R. graveolens no tratamento FEN2 (Tabela 1). Este índice é um marcador de vigor, sendo que a germinação lenta pode ser interpretada como uma resposta ao estresse ambiental e, através deste parâmetro, pode-se avaliar a sensibilidade e qualidade das sementes às condições adversas (MENESES et al., 2011; PEREIRA et al., 2010; RIGON et al., 2012). O valor reduzido da entropia reflete a organização eficiente dos fenômenos para a germinação, assim como a sincronia do sistema vegetal neste momento (LOPES; FRANKE, 2011; PEREIRA et al., 2010).

A análise do desenvolvimento radicular das plântulas revelou que no início do processo (7 dias), os tratamentos com fenantreno mostraram resultados equivalentes, enquanto que o uso de benzo[a]pireno resultou num comportamento diferenciado (Tabela 2). Aos 21 dias, o tratamento FEN2 proporcionou melhor desenvolvimento radicular, diferenciando-se estatisticamente aos 28 dias, do tratamento em MS0 (Figuras 1A e 1B, respectivamente). Na exposição ao benzo[a]pireno, aos 7 dias, as sementes do tratamento MSDCM (Figura 1C) resultaram em plântulas que apresentaram o melhor desenvolvimento radicular. Ao final de quatro semanas, não apresentaram diferença significativa em relação à exposição ao B[a]P1 (Figura 1D). O desenvolvimento radicular das plântulas de R. graveolens obtidas por germinação na presença dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos demonstra que a espécie tem um comportamento distinto de várias espécies citadas na literatura. Plântulas de Brassica rapa e Cucumis sativus expostas ao fenantreno sob condições in vitro apresentaram inibição do desenvolvimento radicular (AHAMMED et al., 2012), assim como plântulas de Cichorium intybus expostas a diferentes concentrações de antraceno sob condições in vitro apresentaram redução do tamanho radicular (DEBIANE et al., 2008).

Tabela 2
Desenvolvimento radicular de plântulas de arruda (Ruta graveolens L.) germinadas em meio de cultura MS contaminado artificialmente com fenantreno (FEN) e benzo[a]pireno (B[a]P), durante quatro semanas

Contaminante	Tratamento*	7 dias	14 dias	21 dias	28 dias
Fenantreno (FEN)	MS0	0,9 ± 0,1 a	2,1 ± 0,5 ab	2,7 ± 0,6 b	3,6 ± 0,5 b
	MSDCM	0,6 ± 0,2 b	1,8 ± 0,3 b	3,0 ± 0,4 ab	3,9 ± 0,6 b
	FEN1	0,6 ± 0,2 ab	2,2 ± 0,2 a	3,1 ± 0,5 ab	4,0 ± 0,5 ab
	FEN2	0,8 ± 0,3 ab	2,4 ± 0,2 a	3,5 ± 0,4 a	4,8 ± 0,5 a
	FEN3	0,7 ± 0,2 ab	2,2 ± 0,1 a	2,8 ± 0,1 b	3,5 ± 0,3 b
Benzo[a]pireno (B[a]P)	MS0	0,1 ± 0,1 b	1,7 ± 0,6 b	2,9 ± 0,4 c	4,0 ± 0,5 c
	MSDCM	0,3 ± 0,1 a	2,7 ± 0,2 a	3,9 ± 0,3 a	4,7 ± 0,4 a
	B[a]P1	0,2 ± 0,1 ab	2,6 ± 0,3 ab	3,7 ± 0,4 a	4,7 ± 0,6 ab
	B[a]P2	0,1 ± 0,1 ab	2,2 ± 0,7 ab	3,6 ± 0,4 ab	4,6 ± 0,5 b
	B[a]P3	0,1 ± 0,1 ab	2,1 ± 0,2 ab	3,2 ± 0,3 bc	4,1 ± 0,6 c

• ^*
  MS0: MS sem suplementação; MSDCM: MS + 1 μL de diclorometano; FEN1: MS + 1,0 mg L^-1 de fenantreno; FEN2: MS + 5,0 mg L^-1 de fenantreno; FEN3: MS + 10,0 mg L^-1 de fenantreno; B[a]P1: MS + 0,001 mg L^-1 de benzo[a]pireno; B[a]P2:MS + 0,01 mg L^-1 de benzo[a]pireno; B[a]P3: MS + 0,1 mg L^-1 de benzo[a]pireno. Letras iguais na coluna em cada contaminante não apresentam diferença significativa segundo o teste DMS (p≤0,05) através da comparação das médias de cada tratamento

Figura 1
Desenvolvimento radicular in vitro de plântulas de arruda (Ruta graveolens L.) em meio de cultura MS contaminado artificialmente com fenantreno e benzo[a]pireno em quatro semanas: (A) MS0 (MS sem suplementação); (B) MS + 5,0 mg L^-1 de fenantreno; (C) MS + 1 μL de diclorometano e; (D) MS + 0,001 mg L^-1 de benzo[a]pireno). Desenvolvimento da parte aérea aos 45 dias em (E) MS + 0,001 mg L^-1 de benzo[a]pireno; (F) MS + 0,01 mg L^-1 de benzo[a]pireno. Desenvolvimento radicular após dois meses em (G) MS + 1,0 mg L^-1 de fenantreno e (H) MS + 5,0 mg L^-1 de fenantreno

Aos 45 dias, as plântulas foram avaliadas em relação às respostas morfofisiológicas. Não foi observado diferença significativa (p≤0,05) nas plântulas expostas ao fenantreno em relação ao comprimento da parte aérea (Figura 2A). Resultados semelhantes foram descritos em plântulas de P. sativum obtidas por germinação em meio de cultura contendo fluoranteno, suplementado com o fitormônio ácido indol-acético, que não apresentaram alteração no seu desenvolvimento (KUMMEROVÁ et al., 2010). Entretanto, as plântulas expostas a menores concentrações B[a]P1 e B[a]P2 (Figuras 1E e 1F, respectivamente), apresentaram indução significativa do crescimento no mesmo período (Figura 1B). Fato este descrito com plantas de Baumea juncea, Baumea articulata, Schoenoplectus validus e Juncus subsecundus que apresentaram maior desenvolvimento quando expostas a baixas concentrações de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos no cultivo hidropônico (ZHANG et al., 2010).

Figura 2
Desenvolvimento de plântulas de arruda (Ruta graveolens L.) obtidas por germinação em meio de cultura MS contaminado artificialmente com fenantreno (A) e benzo[a]pireno (B), aos 15, 30 e 45 dias. MS0: MS sem suplementação; MSDCM: MS + 1 μL de diclorometano; FEN: MS + 1,0 mg L^-1 de fenantreno; FEN2: MS + 5,0 mg L^-1 de fenantreno; FEN3: MS + 10,0 mg L^-1 de fenantreno; B[a]P1: MS + 0,001 mg L^-1 de benzo[a]pireno; B[a]P2:MS + 0,01 mg L^-1 de benzo[a]pireno; B[a]P3: MS + 0,1 mg L^-1 de benzo[a]pireno. Barras com letras iguais não apresentam diferença significativa segundo o teste DMS (p≤0,05) através da comparação das médias de cada tratamento

Após dois meses de cultivo, as plântulas expostas ao fenantreno e ao benzo[a]pireno não apresentaram diferença significativa (p≤0,05) entre os tratamentos em relação ao desenvolvimento da parte aérea (Figura 3A e 3B). Plantas de Arabdopsis thaliana expostas a fenantreno in vitro nas concentrações de 0,008 mg L^-1 a 0,13 mg L^-1 apresentaram redução do desenvolvimento aéreo, o que poderia ser atribuído à redução da atividade celular durante o seu desenvolvimento (ALKIO et al., 2005).

Figura 3
Desenvolvimento após dois meses das partes aérea e radicular de plântulas de arruda (Ruta graveolens L.) obtidas por germinação em meio de cultura MS contaminado artificialmente com fenantreno (a) e benzo[a]pireno (b). MS0: MS sem suplementação; MSDCM: MS + 1 μL de diclorometano; FEN1: MS + 1,0 mg L^-1 de fenantreno; FEN2: MS + 5,0 mg L^-1 de fenantreno; FEN3: MS + 10,0 mg L^-1 de fenantreno; B[a]P1: MS + 0,001 mg L^-1 de benzo[a]pireno; B[a]P2:MS + 0,01 mg L^-1 de benzo[a]pireno; B[a]P3: MS + 0,1 mg L^-1 de benzo[a]pireno. Barras seguidas pelas mesmas letras maiúsculas não são significativamente diferentes, segundo o teste DMS (p≤0,05) através da comparação das médias de cada tratamento

Em relação ao desenvolvimento radicular, durante dois meses de observação, as plântulas expostas ao FEN1 e FEN2 (Figuras 1G e 1H, respectivamente) apresentaram melhor resposta, não havendo diferença significativa (p≤0,05) entre os tratamentos com benzo[a]pireno (Figura 3A). Trabalhos anteriores com plantas expostas a hidrocarbonetos policíclicos aromáticos in vitro, indicam a redução no crescimento radicular, formação de brotos e fitomassa radicular (ALKIO et al., 2005; DEBIANE et al., 2008; KUMMEROVÁ et al., 2008; KUMMEROVÁ et al., 2010; REYNOSO-CUEVAS et al., 2008).

Em relação à massa fresca e ao número de folhas formadas por plântulas ao final do processo de análise, isto é, aos dois meses de exposição ao fenantreno e ao benzo[a]pireno, não foi observado diferença significativa entre os tratamentos (dados não mostrados), sendo que estas plântulas já apresentavam as características morfológicas que permitem o seu estabelecimento ex vitro.

CONCLUSÕES

1. As sementes de R. graveolens germinam in vitro gerando plântulas normais nas concentrações máximas testadas de 10 mg L^-1 de fenantreno e de até 0,1 mg L^-1 de benzo[a]pireno;

2. O uso de contaminantes favorece o desenvolvimento pós-seminal in vitro, viabilizando a transferência das plantas de R. graveolens para condição ex vitro e posterior aclimatização;

3. Os resultados revelam o potencial de produção de fitomassa de R. graveolens em áreas contaminadas com hidrocarbonetos policíclicos aromáticos e de cultivo da espécie nestes ambientes.

• Parte da Tese de Doutorado em Ciências Ambientais da primeira autora apresentada à Universidade do Estado do Rio de Janeiro/UERJ

AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) pelo apoio financeiro.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Oct-Dec 2016

Histórico

• Recebido
  31 Ago 2015
• Aceito
  15 Mar 2016