CARACTERIZACIÓN BIOQUIMICA Y PERFIL DE SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO DE MUESTRAS DE BURKHOLDERIA MALLEI AISLADAS DE ÉQUIDOS DE LA REGIÓN NORDESTE DE BRASIL

CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E PERFIL DE SENSIBILIDADE ANTIMICROBIANA IN VITRO DE AMOSTRAS DE BURKHOLDERIA MALLEI ISOLADAS DA REGIÃO NORDESTE DO BRASIL.

RESUMEN

En este estudio fueron aisladas y caracterizadas bioquímicamente siete muestras deBurkholderia mallei de secreción de nódulos cutáneos cerrados de equinos y asininos naturalmente infectados por la B. mallei y procedentes del Estado de Pernambuco, Nordeste de Brasil. Las muestras de B. mallei fueron sometidas a pruebas bioquímicas para su clasificación y posteriormente a varias pruebas de sensibilidad in vitro a diferentes drogas antimicrobianas. Se observo variación en el bioquimismo entre las muestras bacterianas, principalmente referente a la fermentación de los carbohidratos. Se observácion además, mayor sensibilidad in vitro al clorofenicol, doxaciclina, enrofloxacina, florfenicol, gentamicina, netilmicina, nitrofurantoína, oxalinato, sulfa+trimetoprim y tetraciclina. A pesar de la sensibilidad observada para algunos antimicrobianos, no se indica el tratamiento de los animales enfermos con estos por la posibilidad de que se tornen portadores y mantenedores de la bacteria en el ambiente.

PALABRAS CLAVE
Muermo; Burkholderia mallei ; équidos; antimicrobianos; sensibilidad

RESUMO

Neste estudo foram isoladas e caracterizadas bioquimicamente sete amostras de Burkholderia mallei de secreção de nódulos cutâneos fechados de eqüinos e asininos naturalmente infectados pela B. mallei procedentes do Estado de Pernambuco, Nordeste do Brasil. As amostras de B. mallei foram submetidas a provas bioquímicas de classificação e posteriormente a vários testes de sensibilidade in vitro a diferentes drogas antimicrobianas. Foi observada variação no bioquimismo entre as amostras, principlamente no que se refere a fermentação dos carboidratos. Também se observou maior sensibilidade in vitro ao clorofenicol, doxaciclina, enrofloxacina, florfenicol, gentamicina, netilmicina, nitrofurantoína, oxalinato, sulfa+trimetoprim e tetraciclina. Apesar da sensibilidade observada para alguns antimicrobianos, o tratamento dos animais contaminados não é indicado pela possibilidade de que estes se tornem portadores e mantenedores da bactéria no ambiente.

PALAVRAS-CHAVE
Mormo; Burkholderia mallei ; eqüinos; antimicrobianos; sensibilidade

INTRODUCCIÓN

La Burkholderia mallei, un bacilo Gram negativo, causa severa enfermedad infecto contagiosa en solípedos, pero la infección accidental puede ocurrir también en humanos, a través del suelo contaminado o el contacto directo con animales enfermos, por vía digestiva, respiratoria o a través de heridas en la piel (DANCE, 1991). El primer relato de la enfermedad, fue realizado por Aristóteles y Hipócrates en los seglos 3 y 4 a.C. (WILKINSON, 1981; BLANCOU, 1994; ALIBASOGLU et al., 1986; NEUBAUER et al., 1997). La incidencia de esta enfermedad se encuentra en declive en todo el mundo debido a la disminución del uso de animales de tracción, que son los más susceptibles a la infección, aunque todavía existen relatos de casos en África, Asia, América Central y del Sur (KENNY et al., 1998).

En Brasil, se creía que la enfermedad se había erradicado aproximadamente a 40 años atrás, pero fue recientemente diagnosticada por MOTA et al. (2000) donde fue descripta la infección en la población de équidos de diferentes áreas de los Estados de Pernambuco y Alagoas. Debido a la disminución de los casos, en algunas regiones del mundo existen pocas referencias en la microbiología actual sobre la sensibilidad de B. mallei a antibióticos utilizados actualmente en la medicina (IPATENKO, 1972; AL-IZZI & AL-BASSAM, 1989; BATMANOV, 1993; BATMANOV, 1994; MANZENIUK, 1994). Otras especies de Burkholderia spp pueden causar melioidosis en el hombre como la B. pseudomallei, que es una de las mayores causas de morbidez y mortandad humana en algunas regiones de los trópicos (HOWE et al., 1971; DANCE, 1991) y la B. cepacea, siendo ambas especies, patógenos oportunistas (HOLMES et al., 1996). El diagnóstico diferencial de B. mallei con otras especies y el perfil de sensibilidad microbiana, es esencial debido a la similitud de su antigenicidad, bioquimismo y patogenicidad, particularmente con respecto a su supervivencia intracelular (PRUKSACHARTVUTHI et al., 1990).

La caracterización bioquímica de las muestras de B. mallei (AL-ANI et al., 1998; EUZEBY, 1998) y la susceptibilidad antimicrobiana (AL-IZZI & AL-BASSAM, 1989; KENNY et al., 1999; RUSSEL et al., 2000; KENNY et al., 2001) fueron realizadas en varios países, y a pesar del poco éxito en el tratamiento de los animales, la sensibilidad a las drogas pueden auxiliar en el tratamiento terapéutico humano, como también la utilización de pruebas serológicas modernos (VERMA et al., 1990) y la biología molecular (BAUERNFEIND et al., 1998; DESHAZER et al., 2001) como instrumento de diagnóstico más específico y rápido o para un mejor conocimiento estructural de las variantes moleculares de B. mallei.

Investigaciones rusas demostraron que las cepas de B. mallei son resistentes a las fluoroquinolonas y tetraciclinas (MANZENIUK et al., 1995). Algunos estudios recientes relataron la sensibilidad de la B. mallei, B. pseudomallei y B. cepacea, a la ciprofloxacina, ceftazidime (cefalosporina), doxaciclina, imipenem (B-lactâmico) y piperacilin (penicilina semi-sintética) (KENNY et al., 1999).

Considerando la importancia económica que la enfermedad asume para los équidos de la región nordeste de Brasil y su aspecto reemergente, además de la completa ausencia de datos en la literatura nacional sobre este tema, dicho estudio tuvo como objetivo la clasificación bioquímica de muestras brasileñas de B. malleiy el establecimiento del perfil de sensibilidad a antimicrobianos utilizados en la clínica veterinaria y humana.

MATERIAL Y MÉTODOS

Los aislados de Burkholderia mallei fueron obtenidos de équidos naturalmente infectados y serológicamente positivos para el muermo a la prueba de fijación del complemento y clínicamente enfermos, provenientes de la Región Metropolitana de Recife y de la Mata del estado de Pernambuco. Fueron colectadas siete muestras de secreción purulenta, a través de punción aspiratoria de nódulos cutáneos cerrados, utilizando agujas hipodérmicas 40/12 mm. Las muestras fueron enviadas en cajas isotérmicas al Laboratorio de Bacteriología de Animales Domésticos del Departamento de Medicina Veterinaria de la UFRPE, siendo cultivadas en ágar base enriquecido con sangre de carnero al 10% y ágar patata glicerinado e incubadas a 37º C por 72h.

Las colonias bacterianas aisladas, con características morfotintoriales semejantes a B. mallei, fueron sometidas a pruebas bioquímicas de catalasa, oxidasa, indol, producción de H₂S, rojo de metilo, Voges Proskauer, motilidad, crecimiento a 42º C, producción de pigmento, lisina descarboxilasa, gas de D-glucosa, citrato, ureasa y fermentación de carbohidratos (glucosa, maltosa, galactosa, lactosa, fructosa, manosa, sacarosa y manitol) según AL-ANI et al. (1998). Después de la identificación bacteriana, las muestras de B. mallei fueron inoculadas en cobayos (Cavia porcellus) machos y adultos, por vía intraperitoneal (prueba de Strauss) según LANGENEGGER et al. (1960).

Para la realización del estudio de sensibilidad a los antimicrobianos se utilizó la técnica de difusión en discos según BAUER et al. (1966), utilizando la oxicilina, nitrofurantoína, carbenicilina (100 mcg), florfenicol (30 mcg), enrofloxacina (25 mcg), clidamicina (2 mcg), cotrimazina+espiramicina (100 + 25 mcg), flumequina (30 mcg), polimixina, doxaciclina, ácido nalidíxico (3 mcg), rifampicina, cloranfenicol (30 mcg), ácido pipemídico (20 mcg), oxolinato, tetraciclina (30 mcg), norfloxacina (10 mcg), josamicina, furaltadona (300 mcg), cotrimazole, kanamicina, gentamicina (10 mcg), tobramicina (10 mcg), amicacina, furazolidona, netilmicina (30 mcg), cefalotina (30 mcg), espectinomicina+lincomicina y sulfa+trimetropim (25 mcg). Las cepas de B. mallei fueron inoculadas en caldo infusión de cerebro y corazón (BHI), incubadas a 37º C, en estufa de rotación a 200 rpm por 24h o hasta el padrón 1UFC de la escala de MacFarland. Posteriormente fueron inoculadas en ágar Mueller-Hinton, utilizando "swabs"; los discos de antimicrobianos fueron colocados en placas, respetando el espacio necesario para la formación de los halos, siendo incubadas a 37ºC por 24-48 horas. Para la interpretación de los halos de inhibición se siguió la recomendación del laboratorio fabricante de los antimicrobianos.

Tabla 1
Caracterización bioquímica de las cepas de B. mallei aisladas de équidos naturalmente infectados. Pb-Brasil, 2004.

Bioquimismo	1	2	3	4	5	6	7
Catalasa	+	+	+	+	+	+	+
Oxidasa	+	+	+	+	+	+	+
Indol	-	-	-	-	-	-	-
H2S	-	-	-	-	-	-	-
V.M.	-	-	-	-	-	-	-
V.P.	-	-	-	-	-	-	-
Motilidad	-	-	-	-	-	-	-
Crecimiento 42º C	-	-	-	-	-	-	-
Producción de pigmento	-	-	-	-	-	-	-
Lisina	+	+	+	+	+	+	+
Gás de D-glucosa	-	-	-	+1	+1	+1	+1
Citrato	-	-	-	-	-	-	-
Ureasa	-	-	-	-	-	-	-
Glucosa	+	+	+	+	+	+	+
Maltosa	-	-	-	-	-	-	-
Galactosa	+/-	+/-	+/-	+	+	+	+
Lactosa	-	-	-1	+	-	-	-1
Fructosa	-	-	-	-1	-	-	-
Manosa	-	-	-	-	-	-	-
Sacarosa	-	-	+	+	-	+	-
Manitol	-	-	-	-	-	-	-

• V.M.: rojo de metilo, V.P.: Voges Proskauer, (+¹) levemente positivo, (-¹) levemente negativo, (+/-) más de 80% positivo.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los animales utilizados en este estudio, presentaron durante el examen clínico, descarga nasal muco-purulenta (uni o bilateral) a veces con sangre, úlceras en la mucosa de los septos nasales, cicatrices en forma de estrella en la mucosa nasal, hipertermia, disnea, estertores pulmonares, debilidad, inapetencia, cansacio al realizar esfuerzo físico, linfangitis, nódulos subcutáneos firmes o fluctuantes a lo largo del trayecto de los vasos linfáticos; algunos animales presentaron edema en los miembros posteriores y prepucio, además del adelgazamiento en los casos crónicos de la enfermedad. Fueron aislados siete bacilos Gram negativos, no esporulados, inmóviles, aeorobios, clasificados bioquímicamente como Burkholderia mallei segundo AL-ANI et al. (1998). Todas las muestras inoculadas en los cobayos provocaron la prueba de Strauss, comprobada por el aumento el tamaño testicular 48-72h después de la inoculación. En la necropsia de los cobayos fueron observadas orquitis purulenta, hemorragia y adherencia entre las túnicas vaginal y albuginea, túnicas hiperémicas con necrosis de caseificación y microabscesos, bolsa escrotal cianótica y edematizada, piogranulomas, hígado con áreas de fibrosis y adherido al diafragma, microabscesos hepáticos y eventualmente congestión; pulmones enfisematosos, a veces congestionados con microabscesos, absceso en el punto de inoculación, esplecnomegalia, omento mayor con abscesos, riñones congestionados y aumentados, congestión del mesenterio, ganglios mesentéricos con abscesos y vejiga hiperémica; a partir de algunas lesiones fueron reaisladas las muestras de B. mallei.

El diagnóstico bioquímico diferencial de B. mallei con B. pseudomallei y B. cepacea no fue realizado, puesto que estas últimas dos especies no son patogénicas y no causan infección en los animales (KENNY et al., 1999).

Con relación al patrón bioquímico, se observó que las cepas de B. mallei presentaron algunas variaciones referentes a la fermentación de los carbohidratos fructosa, manosa y lactosa, semejantes a aquellas relatadas por REDEFEARN et al. (1966), AL-ANI et al. (1998) y EUZEBY (1998). Se observó, también, variaciones en la fermentación de la sacarosa y ninguna cepa fermentó la maltosa, situación diferente con relación a las muestras estudiadas por AL-ANI et al. (1998) (Tabla 1).

La susceptibilidad in vitro de B. mallei frente a los antimicrobianos utilizados en este estudio, demostró que el derivado del aminoácido B-lactámico cefalotina, la lincosamina clindamicina, kanamicina, rifampicina, tobramicina y la furaltadona fueron los menos efectivos, entre tanto, resultado distinto fue encontrado por AL-IZZI & AL-BASSAM (1989), que relataron efectividad para todas las muestras a la rifampicina, kanamicina y tobramicina. El propanodiol cloranfenicol, los aminoglicosídeos gentamicina y netilmicina, el derivado de acetato y proprionato tetraciclina, fueron efectivos para todas las muestras estudiadas. In vitro las drogas que actúan en la síntesis de proteínas (gentamicina, cloranfenicol y tetraciclina); los quimioterápicos (ácido nalidíxico y ácido pipemídico) y las drogas antimetabólicas (sulfa+trimetoprim) demostraron mayor efectividad, concordando con los hallados de NAGY et al. (1966), IPATENKO (1972) & AL-IZZI & AL-BASSAM (1989), que relataron la sensibilidad de muestras de B. mallei a estas drogas (Tabla 2).

Tabla 2
Susceptibilidad in vitro de las diferentes cepas de Burkholderia mallei a los antimicrobianos. PB-Brasil, 2004.

Antibiótico	Sensibilidad
	F.A.		F.R.%
Ácido nalidíxico	6		85,71
Ácido pipemídico	6		85,71
Amicacina	5		71,43
Carbenicilina	2		28,57
Cefalotina	0		0,00
Clidamicina	0		0,00
Cloranfenicol	7		100,00
Cotrimazina+Espir.	4		57,14
Doxaciclina	7		100,00
Enrofloxacina	7		100,00
Espect.+Lincomic.	5		71,43
Florfenicol	7		100,00
Flumequina	6		85,71
Furaltadona	0		0,00
Furazolidona	4		57,14
Gentamicina	7		100,00
Josamicina	6		85,71
Kanamicina	6		85,71
Netilmicina	7		100,00
Nitrofurantoína	0		0,00
Norfloxa	5		71,43
Oxacilina	5		71,43
Oxalinato	7		100,00
Polimixina	3		42,86
Rifampicina	2		28,57
Sulfa+trimetoprim	7		100,00
Tetraciclina	7		100,00
Tobramicina	5		71,43

• F.A.: frequencia absoluta, F.R.%: frequencia relativa

Todas las cepas de B. mallei fueron sensibles a la doxaciclina y gentamicina, coincidiendo con los hallados de HOWE et al. (1971) y KENNY et al. (1999) que sugirieron la utilización de estos antimicrobianos en el tratamiento del muermo y en la melioidosis humana, ya que casos clínicos de muermo fueron descriptos en propietarios (MACGILVRAY, 1944) y en técnicos de laboratorio (ALIBASOGLU et al., 1986) que manosearon la bacteria. La doxaciclina puede ser utilizada en el tratamiento, debido a la comprobada sensibilidad in vitro de B. mallei frente a esta droga, asociada a otros antimicrobianos sistémicos para el tratamiento de las melioidosis (KENNY et al., 1999) asi como la ciprofloxacina (LUMBIGANOM et al., 1989 y CHAOWAGUL et al., 1997). A pesar de la eficiencia in vitro de la gentamicina, la droga no actúa en el medio intracelular, pudiendo tornar inaccesible también la utilización de otros antibióticos (RUSSEL et al., 2000).

En los tejidos, el bacilo del muermo es encontrado en el interior de nódulos firmes que caracterizan una reacción inflamatoria crónica, por este motivo ocurre una baja penetración de los antibióticos en estos sitios, dificultando la destrucción del agente. En estos casos, la efectividad del antibiótico in vitro no es la misma que en las condiciones in vivo, pudiendo justificar la reaparición de la enfermedad una vez cesado el tratamiento con antibióticos (MUHAMMAD et al., 1998). A pesar de que las cepas de Burkholderia mallei utilizadas en este estudio presentaron sensibilidad in vitro para algunas drogas, principalmente al clorofenicol, doxaciclina, enrofloxacina, florfenicol, gentamicina, netilmicina, nitrofurantoína, oxalinato, sulfa+trimetoprim y tetraciclina, no se recomienda la utilización de esos principios en el tratamiento de los équidos enfermos debido al hecho de que estos animales constituyen un serio riesgo para los animales sanos y para la salud pública y por este motivo el tratamiento del muermo es prohibido en muchos países (WINTZEZ, 1986 & MUHAMMAD et al., 1998). Así mismo, estudios de esta naturaleza con el objetivo de caracterizar el perfil de sensibilidad de las muestras brasileñas a los antimicrobianos, se justifican, una vez que la enfermedad es reemergente en el país y casi nada se sabe sobre este aspecto como también para facilitar el tratamiento de posibles casos de la enfermedad en humanos.

CONCLUSIÓN

Con base en el estudio bioquímico de las muestras de B. mallei aisladas de équidos de los Estados de Pernambuco y Alagoas-Brasil, se verificó poca variación entre las bacterias estudiadas. Este hallado podría ser confirmado con el estudio molecular de las mismas muestras en otros estudios. Hasta el momento todavía no fueron notificados casos de la enfermedad en humanos en las regiones estudiadas, pero el perfil de susceptibilidad in vitro a diferentes antimicrobianos demostró el potencial de utilización de algunos antibióticos como el Cloranfenicol, Doxaciclina, Enrofloxacina, Florfenicol, Gentamicina, Netilmicina, Nitrofurantoína, Oxalinato, Sulfa+trimetoprim y Tetraciclina si la enfermedad viene a tornarse un problema de salud pública en este país.

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Fechas de Publicación

• Publicación en esta colección
  01 Abr 2021
• Fecha del número
  Jan-Mar 2005

Histórico

• Recibido
  11 Mar 2005
• Acepto
  31 Mar 2005