DETECÇÃO DOS GENES DAS TOXINAS ALFA (α), BETA (β) E ÉPSILON (ε) EM AMOSTRAS DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS ISOLADAS DE BOVINOS PELA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

DETECTION OF ALFA, BETA AND EPSILON TOXINS GENES IN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS STRAINS ISOLATED FROM BOVINES BY THE POLIMERASE CHAIN REACTION

RESUMO

O Clostridium perfringens, microrganismo anaeróbio, está presente no solo e no trato intestinal dos mamíferos. Provoca gangrena gasosa e intoxicação alimentar nos seres humanos e doenças enterotoxêmicas nos animais domésticos. O C. perfringens é classificado em 5 tipos (A, B, C, D e E) mediante a produção de quatro toxinas principais (alfa-α, beta-β, gama-γ, delta-δ e épsilon-ε). A identificação destas toxinas é realizada através da reação de soroneutralização em animais utilizando anti-soros específicos, os quais, além do alto custo, são de difícil obtenção em laboratórios de referência internacionais. Visando contribuir para a tipificação de amostras de C. perfringens, em nosso meio, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a reação em cadeia da polimerase (PCR) na detecção dos genes que codificam as toxinas alfa (cpa), beta (cpb) e épsilon (etx) em isolamentos provenientes de bovinos. A sensibilidade analítica da técnica de PCR padronizada a partir do DNA total bacteriano foi de 2,27 ng/?L para o gene cpa e 227 pg/?L para os genes cpb e etx. Das 35 amostras de C. perfringens isoladas e tipificadas por PCR, 16 (45,7%) foram do tipo A, 18 (51,4%) foram do tipo C e 1 (2,9%) foi do tipo B.

PALAVRAS-CHAVE
Clostridium perfringens ; tipificação; bovinos; PCR

ABSTRACT

The Clostridium perfringens, an aerobic microorganism, is present in soil and intestinal tracts of mammals. It causes gaseous gangrene and food intoxication in human beings and enterotoxemic diseases in domestic animals.C. perfringens is classified into 5 types (A,B,C,D and E) according to the production of four main toxins: (alfa-α, beta-β, gama-γ, delta-δ e épsilon-ε). The identification of these toxins is made through serum neutralization test in animals, using specific anti-sera, however these reagents are of high cost and difficult to be obtained from international reference laboratories. To aid in the typing of the C. perfringens strains in our environment, the present work aimed to assess the use of the polymerase chain reaction (PCR) for the detection of the genes coding the alpha (cpa), beta (cpb) and epsilon (etx) toxins in bovines isolates.The analytical sensitivity of the PCR technique, standardized from the total bacterial DNA, was 2.27 ng/?L for the cpa gene and 227 pg/?L for the cpb and etx genes. Among the 35 C. perfringens isolates typed by PCR, 16 (45.7%) were of type A, 18 (51.4%) of type C, and 1 (2.9%) belonged to type B.

KEY WORDS
Clostridium perfringens ; typing; bovines; PCR

INTRODUÇÃO

A espécie Clostridium perfringens é um grupo heterogêneo de microrganismos anaeróbios, semelhantes nos aspectos bioquímicos e de cultura, que são diferenciados através da estrutura antigênica de suas toxinas (SMITH, 1979; NIILO, 1980; BEER, 1988).

O C. perfringens causa gangrena e intoxicação alimentar nos seres humanos e doença enterotoxêmica nos animais domésticos (ROOD, 1998).

As cepas de C. perfringens produzem 16 fatores de virulência: as toxinas alfa (a), beta (b), gama (g), delta (d), épsilon (e), eta (h), teta (q), iota (i), kapa (k), lambda (l), mu (m) e nu (n); neuraminidase; sialidase; enterotoxina; hemolisina não alfa-delta-teta. Mediante à produção de quatro toxinas principais, o C. perfringens é classificado em cinco tipos: A (α); B (α, β e ε); C (α e β); D (α e ε) e E (α e ɩ) (SMITH & HOBBS, 1974). O diagnóstico do C. perfringens exige cultivo do microrganismo em meios de cultura, isolamento e identificação da espécie através de provas bioquímicas (UZAL et al., 1996; BALDASSI, 1998). O cultivo de amostras em meios seletivos e a detecção do C. perfringens através de suas propriedades específicas é um processo lento e laborioso (VAHJEN et al., 2000).

A tipificação do C. perfringens é realizada pelo teste de soroneutralização em camundongos ou cobaias, empregando antitoxinas padrão (anti-á, anti-â, anti-å e anti-i) fornecidas por laboratórios de referência (STERNE & BATTY, 1975). A prova baseia-se na neutralização da letalidade das diferentes toxinas pelas anti-toxinas padrão, o que é verificado após 3 dias. Todavia, caso haja toxinas em quantidades suficientes, a neutralização da letalidade pode ser verificada em até 10h (WALKER, 1990).

A metodologia convencional para diagnóstico e tipificação do C. perfringens é onerosa, utiliza animais de laboratório e fornece resultados não totalmente satisfatórios (BUOGO et al., 1995). Esse procedimento requer antitoxinas específicas contra cada uma das toxinas principais do C. perfringens, as quais não estão diponíveis comercialmente (WARREN et al., 1999). Algumas variantes encontradas dentro dos 5 tipos do C. perfringens produzem pequenas quantidades de toxinas ou nem sequer são capazes de produzí-las, o que torna impossível a tipificação através do teste de neutralização em camundongos (UZAL et al., 1996; WARREN et al., 1999).

Os testes com animais não são adequados para estudos epidemiológicos em larga escala e não se prestam para a detecção rotineira de organismos toxigênicos (BALDASSI, 1998).

As técnicas moleculares foram introduzidas para o diagnóstico do C. perfringens com a finalidade de evidenciar os genes que codificam as toxinas principais. Elas são simples e rápidas para diagnosticar e tipificar esse microrganismo. A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma dessas técnicas (BUOGO et al., 1995; UZAL et al., 1996; UZAL et al., 1997; MEER & SONGER, 1997; WARREN et al., 1999; VAHJEN et al., 2000).

A correta identificação das variantes do C. perfringens é crítica para estudos epidemiológicos e para o desenvolvimento de medidas preventivas efetivas (PETIT et al., 1999).

A técnica da PCR é específica e sensível, permitindo o processamento de muitas amostras em um curto perído de tempo e uma determinação mais completa das variantes do C. perfringens (MEER & SONGER, 1997; PETIT et al., 1999; VAHJEN et al., 2000).

Em nosso meio, embora a técnica da PCR apresente as vantagens acima descritas, não foi possível verificar na literatura científica consultada qualquer trabalho que mencionasse a aplicação dessa metodologia para o diagnóstico e tipificação do C. perfringens.

Tendo em vista a problemática de tipificação de amostras de C. perfringens, decorrente da indisponibilidade de antitoxinas padrão em nosso meio, o presente trabalho teve como objetivo padronizar a técnica de PCR para a detecção dos genes que codificam as toxinas á, â e å do C. perfringens e tipificar amostras deste patógeno isoladas de bovinos pelo Centro de Sanidade Animal do Instituto Biológico da Secretaria de Agricultura e Abastecimento do Estado de São Paulo, SAA.

MATERIAL E MÉTODOS

Amostras padrão de C. perfringens

Foram utilizadas amostras padrão de C.perfringens dos Tipos A, B, C e D do Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Animal do Instituto Biológico, SAA.

Amostras de campo de C. perfringens

Foram estudadas 35 amostras de campo de C. perfringens isoladas pelo Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Animal do Instituto Biológico, SAA, a partir de amostras de fezes e orgãos (fígado, rim, músculo e coração) de bovinos.

Cultivo das amostras padrão e de campo de C. perfringens

A metodologia para o cultivo das amostras padrão e de campo de C. perfringens foi baseada naquela descrita por BALDASSI (1998).

Metodologia de diagnóstico pela técnica da PCR

O protocolo para a técnica da PCR foi baseado naquele descrito por MEER & SONGER (1997).

Extração do DNA

As bactérias das culturas de C. perfringens em caldo de carne cozida foram colhidas por meio de centrifugação (5.000 x g, por 15 min), lavadas uma vez com água de Milli-Q (Millipore) e ressuspendidas em 1,5 mL da solução TE. Desta suspensão bacteriana foram tomados 100 mL e adicionados a igual volume de tampão de lise (AUSUBEL et al., 1999) contendo 20 mL de pK 20 mg/mL, 20 mL SDS a 10% e 40 mL de tampão (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM EDTA, 250 mM de NaCl) e mantido a 56º C por 90min. A seguir foi realizada a extração descrita por CHOMKZYNSKY (1993).

Amplificação e visualização de DNA alvo

Os primers utilizados na técnica da PCR foram os descritos por MEER & SONGER (1997). Para a Toxina-α(gene cpa): fragmento amplificado com 324 pb; 5’GCTAATGTTACTGCCGTTGACC-3’posição 14381457 e 5’-TCTGATACATCGTGTAAG-3’posição 17621743. Para a Toxina-β (gene cpb): fragmento amplificado com 196 pb; 5’-GCGAATATGCTGAATCATCTA-3’ posição 871-891 e 5’-GCAGGAACATTAGTATATCTTC-3’ posição 1067-1046. Para a Toxina-ε (gene etx): fragmento amplificado com 655 pb; 5’GCGGTGATATCCATCTATTC-3’-posição 227-246 e 5’CCACTTACTTGTCCTACTAAC-3’ posição 882-862.

Para cada par de primers foi realizada uma PCR num volume final de 50μL contendo Triton a 0,5%, 1X Reaction Buffer, 0,2 mM de cada dNTP’s, 25 pmoles de cada primer, 2 mM de MgCl₂, 2,5U de Taq DNA polimerase e H₂0 ultrapura q.s.p. As condições de amplificação foram 94º C/ 3 min. e 40 ciclos de 94º C/30 seg., 53º C/30 seg., 72º C/30 seg. e uma extensão final de 72º C/10min. Um volume de 10 μL de cada produto obtido foi submetidoà eletroforese por 30 min a 100V em um gel de agarose a 1,5% contendo 0,5 μg de brometo de etídio/mL.

As bandas amplificadas foram visualizadas e fotografadas sob luz ultra-violeta. Um padrão de fragmentos de DNA com incrementos de 100 pb foi utilizado como referência.

Avaliação da sensibilidade analítica da técnica da PCR na detecção dos genes cpa cpb e etx

Para determinar a sensibilidade analítica da PCR, foi utilizada a amostra padrão de C. perfringens do tipo B, que contem os 3 genes.

Após extração (item 2.4.1.), o DNA bacteriano foi quantificado em espectrofotômetro e adicionado a tubos contendo TE de maneira a obter concentrações de 2.270 ng/μL a 227 pg/μL. Cada uma das diluições foi submetida a técnica de PCR acima descrita de modo a determinar a menor concentração de DNA bacteriano capaz de produzir uma reação positiva na PCR, para cada um dos genes.Todas as reações foram realizadas em duplicata.

Pesquisa dos genes cpa cpb e etx em amostras de C. perfringens isoladas de bovinos pela técnica de PCR

As 35 amostras de C. perfringens isoladas de bovinos foram submetidas a reação de PCR para pesquisa dos genes cpa, cpb e etx de acordo com o descrito no item 2.4.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A avaliação da sensibilidade analítica da reação de PCR para a detecção dos genes de C. perfringens estudados revelou os seguintes valores: gene cpa = 2,27 ng/µL; gene cpb = 227 pg/µL e gene etx= 227pg/µL (Fig. 1).

Fig. 1
Eletroforese em Gel de Agarose demonstrando a sensibilidade analítica (setas verticais) da reação de PCR na detecção dos genes cpa, cpb, e etx. a partir de quantidades decrescentes de DNA bacteriano (2.270 a 227 pg/μL). Canaletas 1 a 5 = Primers para cpa, com sensibilidade analítica de 2,27 ng/μL. Canaletas 6 a 10 = Primers para cpb, com sensibilidade analítica de 227 pg/μL. Canaletas 11 a 15 = Primers para etx, com sensibilidade analítica de 227 pg/μL. Canaleta L = Padrão de tamanhos de fragmentos com incrementos de 100 bp. As setas horizontais apontam os amplicons correspondentes aos diferentes genes.

A Figura 2 exemplifica os resultados de tipificação obtidos pela técnica de PCR de algumas amostras de C. perfringens isoladas.

Figura 2
Eletroforese em gel de agarose exemplificando a tipificação de amostras de C. perfringens pela técnica de PCR. Canaletas 1 a 3 = Amostra do tipo A (gene cpa na canaleta 1). Canaletas 4 a 6 = Amostra do tipo B (genes cpa na canaleta 4; cpb na canaleta 5 e etx na canaleta 6. Canaletas 7 a 9 = Amostra do tipo C (gene cpa na canaleta 7 e cpb na canaleta 8). Canaleta L = Padrão de tamanhos de fragmentos com incrementos de 100 bp. As setas horizontais apontam os amplicons correspondentes aos diferentes genes.

A Tabela 1 apresenta os resultados da tipificação, pela técnica de PCR, das amostras de C. perfringens isoladas de bovinos pelo Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Animal do Instituto Biológico, SAA.

Tabela 1
Resultados da tipificação, pela técnica de PCR, das amostras de C. perfringens isoladas de bovinos pelo Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Animal do Instituto Biológico,SAA, segundo a localidade e tipo de amostraclínica.

Nº	Município/Estado	Amostra clínica	PCR
1	Barra do Piraí/RJ	Fígado	C
2	Londrina/PR	Conteúdo intestinal	C
3	Pimenta Bueno/RO	Conteúdo intestinal	C
4	Jaguaruna/SC	Fezes	C
5	Registro/SP	Fezes	A
6	Jaguaruna/SC	Intestino	C
7	Nova Rezende/MG	Intestino	A
8	Guaratinguetá/SP	Fezes	A
9	Guaratinguetá/SP	Fezes	C
10	Guaratinguetá/SP	Fezes	C
11	São José dos Campos/SP	Canela	A
12	Uberlândia/MG	Fígado	A
13	Uberlândia/MG	Coração	A
14	São Paulo/SP	Intestino	C
15	Iguape/SP	Fezes	A
16	Paragominas/PA	Rim	A
17	João Teixeira/RO	Fígado	A
18	Borborema/SP	Fígado	A
19	Nova Mutum/MT	Intestino	A
20	Guará/SP	Fígado	B
21	Buri/SP	Fígado	C
22	Guarapuava/PR	Coração	A
23	Bonfim Paulista/SP	Fígado/Rim	C
24	Guará/SP	Intestino	A
25	Itu/SP	Gânglio	A
26	Guará/SP	Fezes	C
27	Franca/SP	Fígado/Rim	C
28	Guará/SP	Intestino	C
29	Fortaleza/CE	Fígado	C
30	Guarapuava/PR	Músculo	C
31	São João da Boa Vista/SP	Fígado	A
32	Bragança Paulista/SP	Fígado	A
33	Salgado de São Felix/PB	Rim	C
34	Iacre/SP	Intestino	C
35	Jacupiranga/SP	Canela	C

O presente estudo foi realizado com uma amostragem de conveniência, constituída pelas amostras isoladas pelo Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Animal do Instituto Biológico, SAA. Dessa forma, embora inferências quanto a prevalência dos tipos de C. perfringens isoladas de bovinos em nosso meio sejam improcedentes pela carência de desenho amostral, a seguir são feitas algumas considerações importantes do ponto de vista epidemiológico.

Das 35 amostras de campo de C. perfringens tipificadas por PCR, 16 (45,7%) foram do tipo A, 18 (51,4%) foram do tipo C e 1 (2,9%) foi do tipo B, não havendo detecção de amostras do tipo D. Essa distribuição mostra um forte predomínio das amostras do tipo A e C, o que discorda da literatura internacional que aponta os tipos B e D como os mais freqüentes para bovinos (MCDONEL, 1980; HATHEWAY, 1990). Estes autores basearam a tipificação em características fenotípicas (soroneutralização das toxinas), ressaltando a possibilidade de tipificações incorretas decorrentes do nível insuficiente de expressão das diferentes toxinas.

Na literatura compulsada, não pudemos verificar trabalhos que tenham objetivado tipificar amostras de C. perfringens isoladas de bovinos em nosso meio. Esta escassez de dados certamente é fruto das dificuldades (custo e disponibilidade) encontradas na obtenção de soros de referência específicos fornecidos por orgãos internacionais, para a realização da prova de soroneutralização. Dessa forma, no âmbito nacional, não há parâmetros para comparar a distribuição dos tipos de C. perfringens detectados pela reação de PCR neste estudo.

A reação de PCR avaliada demonstrou ser uma alternativa bastante eficiente na tipificação de amostras de C. perfringens, com a vantagem de dispensar o uso de animais e de soros anti-toxinas padrão, os quais são de difícil obtenção. Estas características poderão contribuir para uma melhor compreensão da epidemiologia desta bacteriose em nosso meio.

AGRADECIMENTOS

Este trabalho foi realizado com financiamento da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP Processo n. 02/04007-5

REFERÊNCIAS

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Abr 2022
• Data do Fascículo
  Jul-Sep 2005

Histórico

• Recebido
  29 Ago 2005
• Aceito
  30 Set 2005