PESQUISA DE LISTERIA MONOCYTOGENES E MICRORGANISMOS INDICADORES HIGIÊNICO-SANITÁRIOS EM QUEIJO DE COALHO PRODUZIDO E COMERCIALIZADO NO ESTADO DE PERNAMBUCO

SURVEY OF LISTERIA MONOCYTOGENES E MICRORGANISMS INDICATIVE OF HIGIÊNIC AND SANITÁRY CONDITIONS IN "QUEIJO DE COALHO" CHEESE PRODUCED AND SOLD IN THE STATE OF PERNAMBUCO, BRAZIL

RESUMO

Em função da importância socioeconômica do queijo de coalho um produto típico do Nordeste brasileiro e os riscos que seu consumo pode causar à saúde foi realizado o presente estudo para avaliar a incidência de Listeria monocytogenes, Salmonella sp. e microrganismos indicadores de contaminação fecal, utilizando-se a metodologia preconizada pela Coordenação de Laboratório Animal do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento. Foram analisadas 127 amostras de queijo de coalho, produzidos e comercializados no Estado de Pernambuco das quais 9,5% foram positivas para Listeria sp. e 5,5% positivas para Listeria monocytogenes, 5,5% para Salmonella sp. e com relação a contaminação por coliformes totais, 44,1% das amostras apresentaram mais de 500 UFC/g, e encontravam-se fora do limite aceitável pela legislação, 44,1% das amostras para coliformes termotolerantes. Os resultados apresentados demonstram que a presença de Salmonella sp. e Listeria monocytogenes associada a grande prevalência de coliformes, são indicativos da baixa qualidade higiênica podendo favorecer a presença de microrganismos patogênicos no produto.

PALAVRAS-CHAVE
Queijo de coalho; Listeria monocytogenes ; Salmonella sp.; indicadores de higiene

ABSTRACT

Considering the social and economic importance of "queijo de coalho", a typical cheese very popular in the brazilian northwest, associated with the risk produced by its consumption, the aim of this study was to survey the occurrence of Listeria monocytogenes, Salmonella sp. and microorganisms fecal coliform. The cheeses were examined as recommended in official methodologies from the Coordenação Geral de Laboratório Animal (CGLA) of the Ministerio da Agricultura Pecuaria e Abastecimento (MAPA). In 127 samples of "queijo de coalho" produced and commercialized in the state of Pernambuco that were analyzed, 9.5% of them were positive for Listeria sp., 5.5% positive for Listeria monocytogenes, and 5.5% for Salmonella sp. In relation to coliforms counting, 44.1% of the samples were found to have more than 500 UFC/ g, and 44.1% of samples were found to be outside the standards for heart-resistant coliforms according to the RDC 12 MS. The results demonstrate that Salmonella sp. and Listeriamonocytogenes, associated with the high prevalence of coliforms, are indicates of improper hygienic and sanitary conditions that may allow for the presence of pathogenic microorganisms in this kind of cheese.

KEY WORDS
Cheese; Listeria monocytogenes ; Salmonella sp.; hygiene indicators

INTRODUÇÃO

Com o advento da globalização houve uma maior integração econômica entre os países, acompanhada de alta mobilidade populacional e de mercado, resultando em mudanças de costumes e hábitos alimentares, como a preferência pelo consumo de alimentos e produtos típicos tradicionais (DUARTE, 2005).

Os alimentos obtidos por processos artesanais têm grande possibilidade de se apresentarem contaminados, devido ao uso de matérias-primas de fontes não seguras, utensílios mal higienizados ou contami nados, elaboração em condições impróprias e do armazenamento e comercialização em temperatura inadequada, que são fatores que contribuem para aumentar o risco de causarem enfermidades (RYSER & MARTH, 1990).

O queijo de coalho é um produto típico da região Nordeste, produzido artesanalmente em pequenas indústrias, na maioria das vezes, produzido com leite cru, sem nenhum cuidado higiênico-sanitário, tornando-se um produto susceptível de estar contaminado com microrganismos patogênicos dentre estes destacamos a Listeria monocytogenes, Salmonella sp. e microrganismos do grupo coliformes (DUARTE, 1999).

A Listeria monocytogenes é agente causador de enfermidades graves para homens e animais, amplamente distribuída na natureza, tem como característica a capacidade de multiplicação em temperatura de refrigeração e a relativa resistência térmica (ICMSF, 1996). Alguns relatos têm demonstrado o envolvimento de produtos lácteos em surtos alimentares, causando listeriose (LINNAN et al., 1988; BILLE, 1990; CDC, 2001; SANAA, 2004).

Outro agente responsável por casos de toxinfecções alimentares é a Salmonella sp. comumente observada em queijos de coalho (FLORENTINO, 1999; FEITOSA et al., 2003). Normalmente, encontrada no trato intestinal de animais domésticos e selvagens, especialmente, aves e répteis, tem como principais veículos de disseminação alimentos e a água (JAY, 1992). A contaminação dos alimentos pode ocorrer devido ao controle inadequado de temperatura, manipulação incorreta ou contaminação cruzada (FORSYTHE, 2002).

Contagens elevadas de microrganismos do grupo coliformes são freqüentemente observadas nos queijos de coalho, sugerindo que os mesmos foram produzidos em condições de higiene insatisfatória. Segundo ALMEIDA et al. (1996) a presença de coliformes fecais ou termotolerantes em alimento é indicativa que o mesmo entrou em contato direto com material fecal.

Considerando a grande importância socioeconômica do queijo do coalho para a região, das condições precárias em que é produzido e comercializado, do risco à saúde do consumidor pela presença de patógenos e da indisponibilidade de informações epidemiológicas sobre a qualidade do produto em questão realizou-se a presente pesquisa com o objetivo de avaliar a ocorrência de Listeria monocytogenes, Salmonella sp. e microrganismos indicadores de contaminação fecal no queijo de coalho.

MATERIAL E MÉTODOS

Obtenção e Processamento das amostras

Foram analisadas 127 amostras de queijo de coalho, coletadas em estabelecimentos comerciais de 21 municípios do Estado de Pernambuco, as quais foram fracionadas, pesadas e acondicionadas em sacos plásticos identificadas e armazenadas em caixas isotérmicas e transportadas para o laboratório.

De cada amostra foram pesadas três alíquotas de 25 ± 0,2 g em sacos tipo stomacher previamente identificados, destinadas à pesquisa de Listeria, Salmonella, e para contagem de coliformes totais e termotolerantes. As amostras foram analisadas segundo as metodologias preconizadas pela Coordenação de Laboratório Animal (CLA), do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (BRASIL, 2003).

Detecção de Listeria sp.

Para a pesquisa de Listeria sp., homogeneizou-se 25 g de cada amostra assepticamente em 225 mL de caldo para enriquecimento de Listeria incubadas a 30º C ± 1º C. Após 24h alíquotas de 0,1 mL foram transferidas para tubos com 9 mL de caldo Fraser, incubados a 30º C ± 1º C/24-48h. Tubos presuntivos (enegrecido) foram semeados em ágar Oxford, e ágar Triptose com acido nalidíxico (ATN), incubados a 30º C ± 1º C/24-48h. Colônias cinza azuladas no ágar ATN (observadas sob incidência de luz oblíqua) e enegrecidas no Oxford, foram re-isoladas em ágar triptose e incubadas 30º C ± 1º C/24h. Colônias características foram repicadas em ágar estoque (ágar nutriente fosfatado, utilizado para manutenção de cepas) incubado a 30º C ± 1º C/24h. Após crescimento foram submetidas às provas de catalase, motilidade (25º C ± 1º C/72h), β-hemólise (ágar Columbia com 5% sangue desfibrinado de carneiro), Camp-test Ágar Columbia 5% sangue desfibrinado de cobaia ou carneiro em sobrecamada, incubado a 36º C ± 1º C/ 72h em 2-5% de CO_2, reação com S. aureus, redução de nitrato e Voges-Proskauer. Colônias suspeitas foram submetidas à fermentação dos carboidratos (xilose, manitol e ramnose, incubadas 30º C ± 1º C/36h). As compatíveis com o gênero Listeria foram submetidas ao Kit miniaturizado de identificação bioquímica API Listeria, e encaminhadas para sorotipagem na Fundação Osvaldo Cruz. Doze amostras foram positivas para Listeria innocua sorovar 6b e 7 destas apresentaram também resultado positivo para L. monocytogenes sorovar 1/2a. Utilizou-se como controle durante as provas, cepas de Listeria monocytogenes 4b (isolada de alimento - LARA/RS 4921), Listeria innocua (isolada de alimentos LARA/RS 666/90), Listeria welshimeri da coleção de culturas de referência européia e Listeria ivanovii (NTCC 11007).

Detecção de Salmonella sp.

Foi homogeneizado 25 g de queijo em 225 mL de solução salina peptonada 1% tamponada (APT) e incubado 36º C ± 1º C/16-20h (pré-enriquecimento), posteriormente, 1 mL e 0,1 mL foram transferidos do pré-enriquecimento para tubos contendo 9 mL de caldo Selenito Cistina e caldo Rappaport-Vassiliadis, respectivamente, e incubados a 41 ± 0,5º C em banho-maria com movimentação (enriquecimento seletivo). Após 24h foram realizados repiques em ágar manitol lisina cristal violeta verde bile (MLCB) e ágar vermelho de fenol lactose sacarose (BPLS), com novobiocina, e incubados a 36º C ± 1º C/18-24h. Colônias suspeitas foram reisoladas em BPLS sem novobiocina e no ágar Rambach. Cinco culturas puras foram submetidas às provas de oxidase e pyrase. As amostras negativas para ambos os testes foram submetidas à identificação bioquímica, teste de soro aglutinação e ao Kit miniaturizado API 20E. Foram encontrados 3 perfis bioquímicos de Salmonella spp.: 1) inositol negativo, sorbitol negativo (perfil 6704152); 2) inositol negativo, sorbitol positivo (perfil 6704552); e 3) inositol positivo, sorbitol positivo (perfil 6704752). A Salmonella Typhimurium ATCC 14028, foi utilizada como controle.

Enumeração de coliformes totais e termotolerentes

A etapa presuntiva foi realizada com inoculação de cinco diluições sucessivas de cada amostra de queijo em ágar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA), incubados a 36º C ± 1º C/18/24h e contagem das colônias lactose positivas (presuntivas). Para a etapa confirmativa foram contadas separadamente colônias típicas e atípicas. A prova confirmativa dos coliformes totais foi realizada por meio da inoculação de 3 colônias típicas e 3 atípicas, em caldo verde brilhante bile 2% lactose com posterior incubação a 36º C ± 1º C/24-48h. A presença de gás nos tubos de Durhan ou efervescência quando agitados suavemente indicarão positividade. Para confirmação dos coliformes termotolerantes, as colônias suspeitas foram inoculadas em caldo Escherichia coli (caldo EC) e incubadas a 45º C ± 0,2º C/24-48h, as culturas que apresentaram formação de gás (mínimo 1/10 do volume total do tubo) ou efervescência quando agitadas suavemente foram consideradas positivas. Como controle utilizou-se Escherichia coli ATCC 25922 e Enterobacter aerogenes ATCC 13048.

Análise estatística

Foi realizada através de distribuições absolutas e percentuais para as variáveis nominais e as medidas estatísticas: valor mínimo, valor máximo, média geométrica e mediana para as variáveis numéricas (Número de coliformes totais e temotolerantes) e utilizado o teste T-Student para amostras independentes, na decisão dos testes estatísticos, o nível de significância utilizado foi de 5% (0,05).

RESULTADO E DISCUSSÃO

Das 127 amostras de queijo de coalho analisadas, 12 foram positivas para Listeria innocua (9,5%) sorovar 6b, e 7 amostras dessas 12 também apresentaram positividade para Listeria monocytogenes (5,5%), sorovar 1/2a. A prevalência de colônias de Listeria innocua sobre as de L. monocytogenes, também foi verificado na Itália por MASSA et al. (1990) em queijos moles, nos Estados Unidos por RYSER & MARTH (2001) no queijo Jalisco e no Rio Grande do Sul por SCHWAB et al. (1996) em queijo colonial artesanal. Estes resultados são justificados segundo VARNAM & EVANS (1991) pelo fato de que ambas possuem o mesmo habitat. A detecção em 9,5% das amostras, de Listeria innocua pode ser indicativo do risco da Listeria monocytogenes, estar presente contaminando o alimento onde somente foi isolada a Listeria innocua. SOUZA (2002) e RAMOS & COSTA (2003) analisando amostras de queijo de coalho artesanal comercializado em Fortaleza, CE, e Manaus, AM, isolaram Listeria sp. em 17,1% (12/70) e 3,4% (2/58), respectivamente, e L. monocytogenes em 1,4% (1/70) e 1,7% (1/58) das amostras. FEITOSA et al. (2003) no Rio Grande do Norte, detectaram Listeria sp. em 9% (1/11) dos queijos analisados. A presença de Listeria sp. em amostras de leite e derivados, em locais de processamento vem sendo confirmada através de estudos como os de SILVA et al. (2003) que analisaram 218 amostras ao longo da linha de produção e encontraram 13 amostras positivas para Listeria sp. Segundo RYSER & DONNELLY (2001) a não detecção da L. monocytogenes, podem estar muitas vezes relacionadas a fatores de estresse celular, número inicial relativo de células de L. monocytogenes e Listeria innocua, ou durante a seleção das colônias para confirmação bioquímica, passo analítico em que todas as espécies se apresentam com características semelhantes, foram selecionadas somente colônias de Listeria innocua

No que se refere à pesquisa de Salmonella das 127 amostras de queijo de coalho, sete amostras (5,5%) se encontravam contaminadas por estes microrganismos, corroborando com os resultados obtidos por SENA et al. (1999), MENDES (1999), DUARTE et al. (2001) e FEITOSA et al. (2003), que obtiveram presença de Salmonella em 8,4% (9/107), 73,3% (77/105), 4,7% (7/148) e 9,1% (1/11) das amostras testadas, respectivamente. No entanto, estes dados estão em desacordo com os obtidos em Pernambuco por MORAIS (1995) que avaliou amostras de queijo de coalho durante todas as etapas tecnológicas e não obteve nenhuma amostra positiva, o que também foi observado por TRAVASSOS (1998), na Paraíba, ao avaliar amostras de queijo de coalho artesanal elaborado com leite pasteurizado.

A detecção de Salmonella em 5,5% das amostras analisadas demonstra que o consumo deste tipo de queijo pode representar risco a saúde da população nordestina, já que este é um alimento típico e acessível à maioria das classes sociais.

Tabela 1
Análise estatística dos valores obtidos n a análise das amostras de queijo em relação a presença de Listeria sp. e a contagem de coliformes totais. Recife, PE, 2004.

Análise	Número de coliformes totais			Valor de p
	Listeria sp.
	Positiva	Negativa	Grupo total
Valor mínimo	300	< 10	< 10
Valor máximo	1.000.000	37.000.000	37.000.000
Média geométrica	28.512,15	1039,18	371.535,22	p1 = 0,0025*
Mediana	26.000,00	4.600,00	6.000,00

• ^*
  Diferença significante ao nível de 5%.
• ¹
  Através do teste t-Student com variâncias desiguais para o logaritmo dos dados.

Tabela 2
Análise estatística dos valores obtidos na análise das amostras de queijo em relação a presença de Listeria sp. e contagem de coliformes termotolerantes. Recife, PE, 2004.

Análise	Coliformes termotolerantes			Valor de p
	Listeria sp.
	Positiva	Negativa	Grupo total
Valor mínimo Valor máximo	< 10 1.000.000	<10 21.000.000	< 10 21.000.000
Média geométrica	9069,43	180,96	20.892.961,31	p 1 = 0,0361*
Mediana	18.000,00	100,00	120,00

• ^*
  Diferença significante ao nível de 5%.
• ¹
  Através do teste t-Student com variâncias iguais para o logaritmo dos dados.

Com relação aos níveis de contaminação por coliformes totais nas 127 amostras de queijo analisados, 56 (44,1%) foram negativas, 15 (11,8%) apresentaram contagem entre 10 e 500 UFC/g e 56 (44,1%) tinham mais de 500 UFC/g. Das amostras de queijo de coalho analisadas, 56 (44,1%) encontravam-se acima do limite aceitável que é 5,0 x 10² UFC/g de amostra para os coliformes termotolerantes segundo a RDC n ^o 12 do Ministério da Saúde, (BRASIL, 2001). Resultados apresentados por PAIVA & CARDONHA (1999), FLORENTINO & MARTINS (1999) e BORGES et al. (2003), demonstraram níveis de 1100 NMP/g, 39000 NMP/g e 501 a = 2400 NMP/g de coliformes fecais respectivamente, todos acima do estabelecido pela legislação em amostras de queijos de coalho.

Correlacionando os microrganismos em relação às amostras analisadas, nenhuma foi simultaneamente positiva para pesquisa de Listeria sp. e Salmonella sp., porém, verificando a média geométrica e a mediana do número de coliformes totais (Tabela 1), estas foram mais elevadas entre as amostras positivas do que entre as amostras negativas para L. monocytogenes, comprovando-se estatisticamente a diferença significante (p < 0,05) entre os dois subgrupos em relação ao número de coliformes totais. O número de coliformes termotolerantes também se apresentou mais elevado entre as amostras positivas do que entre as negativas para L. monocytogenes, com diferença significante entre os grupos, em relação aos coliformes termotolerantes (p < 0, 05) (Tabela 2).

CONCLUSÃO

Diante dos resultados obtidos neste estudo e considerando que o queijo de coalho é produzido, artesanalmente, geralmente em condições higiênicas precárias, concluiu-se que seu consumo constitui motivo de preocupação para as autoridades sanitárias regionais por representar um risco à saúde dos consumidores devido à presença de bactérias patogênicas como Salmonella sp. e L. monocytogenes, capazes de causar enfermidade grave no homem. Os achados de Salmonella sp. e Listeria monocytogenes associado à grande incidência de coliformes totais e fecais ou termotolerantes nas amostras analisadas podem ser indicativos da baixa qualidade higiênica do produto devido procedimentos higiênicos inadequados durante a fabricação, manutenção em temperatura inadequada e ao uso de matéria prima de baixa qualidade higiênica.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Abr 2022
• Data do Fascículo
  Jul-Sep 2005

Histórico

• Recebido
  05 Set 2005
• Aceito
  29 Set 2005