DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE PLEUROTUS SPP. SOB A INFLUÊNCIA DE DIFERENTES SUBSTRATOS E DEXTROSE

IN VITRO DEVELOPMENT OF PLEUROTUS SPP. UNDER THE EFFECT OF SUBSTRATES AND DEXTROSE

RESUMO

O cogumelo comestível Pleurotus spp. (shimeji) é cultivado em diferentes substratos lignocelulósicos, sendo que conforme a formulação do meio de cultivo, maior produtividade poderá ser obtida. Este trabalho teve como objetivo avaliar a velocidade de crescimento e a produção de massa miceliana de duas linhagens de Pleurotus ostreatus (BF24 e DF33) e uma de P. ostreatoroseus (POR01/03) no cultivo in vitro à base de diferentes substratos com ou sem suplementação de dextrose, sob temperatura constante de 28º C. Avaliou-se diariamente o diâmetro da colônia e a massa miceliana por dissolvição em água fervente. A linhagem POR01/03 apresentou maior velocidade de crescimento, e a linhagem BF24 maior biomassa. O meio à base de capim-elefante favoreceu a maior velocidade de crescimento e biomassa formada, principalmente quando foi adicionada dextrose no meio de cultivo.

PALAVRAS-CHAVE
Velocidade de crescimento; massa miceliana; cogumelo; shimeji

ABSTRACT

Various lingo-celullosic substrates are used to cultivate the edible fungus Pleurotus spp. (shimeji), and better yields are obtained in media with different formulations. The objective of this study was to evaluate the in vitro growth rate and mass mycelium production of two Pleurotus ostreatus (BF24 and DF33) strains and from one P. ostreatoroseus (POR01/03) strain using different substrates with or without dextrose. During the study daily observations of colony diameter and mycelium mass were analyzed. We observed that the strain POR01/03 had the fastest growth rate and the strain BF24 had the highest mycelium mass among the strains in study. We also observed that all strains had a better growth rate and mycelium mass in the elephantgrass media, principally when dextrose was added.

KEY WORDS
Growth rate; mycelium mass; mushroom; shimeji

INTRODUÇÃO

Pesquisas no cultivo de cogumelos visam o aprimoramento de técnicas que proporcionem a redução dos custos da produção, que resulte em redução do preço ao consumidor e conseqüente aumento do consumo mundial. O cultivo de cogumelos comestíveis vem tomando maior importância no Brasil, principalmente, devido a descobertas científicas que tem demonstrado o seu potencial uso medicinal, sendo considerado um produto com propriedades farmacológicas atribuídas a polissacarídeos e outros compostos, que desempenham possível atividade antitumoral, imunomodulatória, antiviral, antibacteriana e antiparasitária (MIZUNO et al., 1990; DENADAI et al., 1998; MENOLI et al., 2001; BARBIZAN et al., 2002). Além disso, seu alto valor protéico e baixo valor calórico o torna uma opção de alimento saudável (PARK et al., 2003).

Para o cultivo de cogumelos podem ser aproveitados resíduos agroindustriais como substratos à base de cana-de-açúcar, palha de trigo, palha de arroz, gramíneas, serragens, polpa e casca de frutas, folhas de bananeira etc. (EICKER, 1995; EIRA, 2003). Entre os principais cogumelos comestíveis cultivados se encontram Agaricus bisporus, Agaricus brasiliensis, Lentinula edodes e Pleurotus spp. O Pleurotus se desenvolve em temperaturas de 15 a 28º C (CHANG, 1980; MARINO, 1997), produzindo uma série de enzimas ligno-celulases, que os permite degradar facilmente a lignina e a celulose da madeira, assim como outros substratos vegetais utilizados para o seu cultivo (BONONI et al., 1991; CAPELARI, 1996).

Na produção de cogumelos, várias etapas devem ser seguidas, sendo que estas vão desde a obtenção do inóculo ("spawn") até a comercialização do produto. Na pesquisa com linhagens isoladas, um aspecto importante a ser estabelecido é a escolha do substrato adequado para a multiplicação deste fungo e, obtenção de crescimento miceliano suficiente para dar seqüência às etapas seguintes da produção. O desenvolvimento miceliano dos fungos pode ser avaliado de diferentes formas, como: crescimento radial, vigor, velocidade de crescimento e massa de micélio. Fatores como característica nutricional do substrato, bem como linhagem do fungo, luminosidade, temperatura e outros afetam o seu cultivo (MARINO, 1997).

Este trabalho teve como objetivo avaliar a produção de massa miceliana e velocidade de crescimento de duas linhagens de P. ostreatus e uma de P. ostreatoroseus sob o efeito de diferentes substratos e adição de dextrose.

MATERIAIS E MÉTODOS

O experimento foi desenvolvido no Laboratório de Micologia do Departamento de Microbiologia e Parasitologia do Instituto de Biologia da Universidade Federal de Pelotas, RS. As culturas iniciais foram obtidas a partir das linhagens POR01/03 de P. ostreatoroseus procedente da UFSC-SC e BF24 e DF33 de P. ostreatus, originada da UNESP-SP (MARINO, 2002). Para o estabelecimento dos tratamentos, os fungos, preservados em micoteca, foram repicados para meios de cultivo à base de batata-dextrose-ágar (BDA) e incubados a 28º C por 10 dias.

Os substratos utilizados foram bagaço de cana-deaçúcar (Saccharum officinarum), palha de soja (Glycine max), sabugo de milho (Zeae mays) e capim-elefante (Pennisetum sp.). De cada substrato seco foram utilizados 30 g, sendo fervidos em 1 L de água destilada por 30 min e, em seguida, filtrado com o auxílio de um pedaço de gaze e o volume completado para 1 L. Logo após foram adicionados 15 g de ágar para posterior esterilização em autoclave por 20 min a 121º C. O pH dos meios foi ajustado para 5,5 (EIRA & MINHONI, 1997), sendo depois vertido em placas de Petri previamente esterilizadas. Para os tratamentos com suplementação de dextrose foi adicionada 10 gL^-1 juntamente com o ágar.

Discos miceliano de cultura inicial em BDA, de 10 mm de diâmetro, foram repicados para os meios correspondentes aos incubados nas mesmas condições. Transcorrido o crescimento miceliano novos discos foram repicados para cada meio correspondente.

O crescimento miceliano foi medido com o auxílio de uma régua, em 8 direções ortogonias, a cada 24h durante a incubação até o momento que uma colônia atingiu a proximidade das bordas da placa em um dos tratamentos, o que ocorreu no 4 dia de incubação. Após a última avaliação do crescimento, o meio de cultura foi dissolvido em água fervente, aproximadamente 500 mL, recolhendo-se a massa miceliana úmida (Mmu), a qual foi seca em estufa a 50º C por 24h, para a obtenção da massa miceliana seca (Mms). A diferença entre Mms e Mmu resultou na biomassa miceliana.

O delineamento experimental foi inteiramente ao acaso com fatorial A x B x C, sendo 3 linhagens, 4 substratos e 2 níveis de dextrose para a variável massa miceliana e A x B x C x D x E sendo 3 linhagens, 4 substratos, 2 níveis de dextrose e 4 dias de incubação e 5 repetições para a variável velocidade de crescimento. A unidade experimental constou de uma placa, sendo 5 repetições/tratamento. Os resultados obtidos foram submetidos à análise da variação e teste de Duncan para comparação das médias, utilizandose o programa estatístico Sanest.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Pela análise da variação pode-se observar que para a variável massa miceliana houve diferenças significativas para a interação entre os fatores linhagens, substratos e dextrose. A análise das médias através do teste de Duncan (Tabela 1) mostrou que para a linhagem POR01/03 o meio à base de capim elefante adicionado ou não de dextrose foi superior aos meios à base dos demais substratos. Para a linhagem BF24, quando foi adicionada dextrose ao meio à base de capim-elefante, este foi superior aos demais, entretanto, quando dextrose não foi adicionada, capim-elefante não diferiu de palha de soja e de sabugo de milho. A linhagem DF33 apresentou comportamento diferente, onde o meio sem dextrose e a base de cana-de-açúcar foi superior aos demais sem dextrose, já quando dextrose foi adicionada os meios à base de capim-elefante e palha de soja apresentaram maiores médias de massa miceliana, sendo superiores aos demais.

Tabela 1
Média de massa miceliana (g) das linhagens de P. ostreatoroseus (POR01/03) e P. ostreatus (BF4 e DF33), quando cultivadas em diferentes meios de cultura com e sem dextrose.

Substrato	Linhagens
	POR01/03	BF24	DF33
Sem dextrose
Capim elefante	0,0034 a B	0,0150 a A	0,0050 b B
Palha de soja	0,0062 a A	0,0078 b A	0,0038 b A
Cana-de-açúcar	0,0030 a B	0,0126 ab A	0,0104 a A
Sabugo de milho	0,0032 a B	0,0106 ab A	0,0040 b B
Com dextrose
Capim elefante	0,0246 a B	0,0306 a A	0,0198 a B
Palha de soja	0,0142 b AB	0,0136 c B	0,0188 a A
Cana-de-açúcar	0,0134 b AB	0,0148 bc A	0,0090 b B
Sabugo de milho	0,0100 b B	0,0190 b A	0,0084 b B

• Médias seguidas de mesma letra minúscula, nas colunas, e maiúscula, nas linhas, não diferem entre si pelo teste de Duncan, ao nível de 5%.

Nas linhagens de Pleurotus pesquisadas foram médias maiores em todos os meios que foi adicionada a dextrose, mostrando sua importância como fator estimulador do crescimento. O meio à base de capim-elefante mostrou-se mais apropriado para esta finalidade dentre os analisados, sendo um substrato abundante, facilmente produzido durante todo o ano e menos sujeito a conter resíduos tóxicos, a exemplo da palha de soja e sabugo de milho, em decorrência do maior uso de agrotóxicos no cultivo destes cereais. Na maioria dos substratos utilizados nos meios de cultura a linhagem que apresentou maior massa miceliana foi a BF24, sendo superior às demais, com exceção de quando se utilizou meio de cultura com substrato à base de palha de soja sem dextrose, onde esta linhagem não diferiu das demais, quando se utilizou o meio à base de palha de soja com dextrose a linhagem DF33 foi superior a BF24 (Tabela 1).

Tabela 2
Média da velocidade de crescimento (cm.dia^-1) das linhagens de P. ostreatoroseus (POR01/03) e P. ostreatus (BF4 e DF33), quando cultivadas em diferentes meios de cultura com e sem dextrose.

Substrato	Linhagens
	POR01/03	BF24	DF33
Sem dextrose
Capim elefante	3,2230 a A	2,3815 a B	2,0020 a C
Palha de soja	2,9475 b A	1,9155 b B	1,6355 b C
Cana-de-açúcar	2,6780 c A	1,6500 c B	0,9295 c C
Sabugo de milho	3,0845 ab A	0,9370 d B	0,8585 c B
Com dextrose
Capim elefante	3,3020 a A	2,4125 a B	1,8250 a C
Palha de soja	3,0925 b A	1,7340 b B	1,6135 b C
Cana-de-açúcar	2,7140 c A	1,7805 b B	1,1375 c C
Sabugo de milho	3,1640 ab A	1,0690 c B	0,9395 d B

• Médias seguidas de mesma letra minúscula, nas colunas, e maiúscula, nas linhas, não diferem entre si pelo teste de Duncan, ao nível de 5%.

Em seu metabolismo os fungos secretam exoenzimas durante o desenvolvimento degradando compostos para obtenção de carbono, nitrogênio, enxofre e outros nutrientes necessários para seu crescimento. Conforme observado nos resultados, mesmo nos tratamentos em que a suplementação com dextrose foi suprida, houve desenvolvimento miceliano, porém inferior aos tratamentos com adição de dextrose. Conforme evidenciado por REGINA et al. (2001), o bagaço de cana-de-açúcar é um substrato que possui maior teor de celulose que os demais, sendo que a celulose provê glicose para o fungo e quando cessa esta fonte de açúcar, o fungo diminui o crescimento, necessitando de açúcares facilmente metabolizáveis provenientes de polissacarídeos do substrato. De acordo com estes mesmos autores, o bagaço de cana-de-açúcar utilizado no cultivo de shiitake precisa ser suplementado, pois se torna mais viável para a produção de cogumelos comestíveis.

A suplementação com dextrose no substrato bagaço de cana-de-açúcar mostrou resultados inferiores do que quando utilizado a suplementação no capimelefante, provavelmente em decorrência do maior teor de carbono no primeiro substrato. Porém, SILVA et al. (2004) utilizando resíduos de frutas como substrato adicionado ao meio mineral para otimizar o crescimento miceliano de Pleurotus sajor-caju, observaram que as maiores médias de biomassa miceliana foram encontradas quando utilizaram bagaço cana-de-açúcar, casca de maracujá, casca e coroa de abacaxi.

Tabela 3
Média da velocidade de crescimento (cm.dia^-1) da linhagem de P. ostreatoroseus (POR01/03), quando cultivada em diferentes meios de cultura com e sem dextrose.

Substrato	Período de incubação (dias)
	1	2	3	4
Sem dextrose
Capim elefante	0,8960 a	2,3620 a	4,0820 a	5,5520 a
Palha de soja	0,7320 ab	2,0580 bc	3,7440 b	5,2560 b
Cana-de-açúcar	0,6320 b	1,8420 c	3,3860 c	4,8520 c
Sabugo de milho	0,9160 a	2,1640 ab	3,8140 ab	5,4440 ab
Com dextrose
Capim elefante	0,8820 a	2,3860 a	4,1680 a	5,7720 a
Palha de soja	0,8360 ab	2,1980 a	3,7980 b	5,5380 b
Cana-de-açúcar	0,6460 b	1,9340 b	3,4140 c	4,8620 c
Sabugo de milho	0,9160 a	2,3080 a	3,9740 ab	5,4580 b

• Médias seguidas de mesma letra minúscula, nas colunas, não diferem entre si pelo teste de Duncan, ao nível de 5%.

Tabela 4
Média da velocidade de crescimento (cm.dia^-1) da linhagem de P. ostreatus (BF24), quando cultivada em diferentes meios de cultura com e sem dextrose.

Substrato	Período de incubação (dias)
	1	2	3	4
Sem dextrose
Capim elefante	0,2640 a	1,4440 a	3,0820 a	4,7360 a
Palha de soja	0,2240 a	1,0680 b	2,5120 b	3,8580 b
Cana-de-açúcar	0,2280 a	0,9240 b	2,1000 c	3,3480 b
Sabugo de milho	0,1080 a	0,5620 c	1,0840 d	1,9940 d
Com dextrose
Capim elefante	0,2980 a	1,4280 a	3,1580 a	4,7660 a
Palha de soja	0,2380 a	0,8920 b	2,1540 b	3,6520 b
Cana-de-açúcar	0,2220 a	0,9940 b	2,2920 b	3,6140 b
Sabugo de milho	0,1580 a	0,6260 c	1,2440 c	2,2480 c

• Médias seguidas de mesma letra minúscula, nas colunas, não diferem entre si pelo teste de Duncan, ao nível de 5%.

Tabela 5
Média da velocidade de crescimento (cm.dia^-1) da linhagem de P. ostreatus (DF33), quando cultivada em diferentes meios de cultura com e sem dextrose.

Substrato	Período de incubação (dias)
	1	2	3	4
Sem dextrose
Capim elefante	0,2260 a	1,3640 a	2,6060 a	3,8120 a
Palha de soja	0,2540 a	1,0840 b	2,1620 b	3,0420 b
Cana-de-açúcar	0,1720 a	0,5800 c	1,1380 c	1,8280 c
Sabugo de milho	0,1520 a	0,5480 c	1,1240 c	1,6100 d
Com dextrose
Capim elefante	0,3520 a	1,2460 a	2,3060 a	3,3960 a
Palha de soja	0,3260 a	1,0920 a	2,0990 a	2,9380 b
Cana-de-açúcar	0,1820 a	0,7620 b	1,3980 b	2,2080 c
Sabugo de milho	0,1760 a	0,6580 b	1,2220 b	1,7020 d

• Médias seguidas de mesma letra minúscula, nas colunas, não diferem entre si pelo teste de Duncan, ao nível de 5%.

Para a variável velocidade de crescimento miceliano diário, a análise da variação mostrou diferenças significativas para a interação entre linhagens, substratos, dextrose e dias de avaliação. A análise das médias pelo teste de Duncan mostrou que para todas as linhagens estudadas o meio à base de capim-elefante adicionado ou não de dextrose foi superior aos demais, não diferindo apenas dos meios à base de sabugo de milho na linhagem POR01/03. Para as linhagens de Pleurotus, a que apresentou maiores médias na velocidade de crescimento diário foi a POR01/03, estatisticamente superior as demais em todos os meios analisados (Tabela 2), evidenciando que cada linhagem é um isolado diferente possuindo, assim, características genéticas e expressão de genes diferentes umas das outras. De acordo com BILAY et al. (2000) ao testaram o crescimento de 30 espécies de cogumelos comestíveis e medicinais em diferentes meios de cultura, concluíram que o crescimento miceliano destas espécies estudadas é diferente e depende do tipo de meio utilizado e do pH.

Durante o período de incubação pode-se observar que a linhagem POR01/03 apresentou maiores médias de crescimento quando cultivada em meio à base de capim elefante, não diferindo estatisticamente de sabugo de milho quando não foi adicionada a dextrose. Quando a dextrose foi adicionada, este substrato não apresentou diferenças significativas de palha de soja e sabugo de milho nos dois primeiros dias de incubação e de sabugo de milho no terceiro dia. Os meios à base de cana-de-açúcar também mostraram médias inferiores aos demais meios durante a incubação (Tabela 3).

Já para a linhagem BF24, observou-se que durante o período de incubação que os meios de cultura à base do substrato capim-elefante adicionados ou não de dextrose foram superiores aos demais meios a partir do segundo dia de incubação, e quando esta linhagem foi cultivada nos meios à base de sabugo de milho apresentaram médias inferiores aos demais meios para a velocidade de crescimento (Tabela 4).

Fig. 1
Velocidade de crescimento da linhagem POR01/03 em meios com diferentes substratos adicionados ou não de dextrose.

Fig. 2
Velocidade de crescimento da linhagem BF24 em meios com diferentes substratos adicionados ou não de dextrose.

Fig. 3
Velocidade de crescimento da linhagem DF33 em meios com diferentes substratos adicionados ou não de dextrose.

Para a linhagem DF33 observou-se que durante o período de incubação o meio à base de capim elefante sem adição de dextrose mostrou-se superior aos demais, já quando dextrose foi adicionada os meios à base de capim elefante e à base de palha de soja foram superiores aos demais não diferindo entre si (Tabela 5).

Os dados referentes a velocidade de crescimento diário do micélio foram ajustados a um modelo linear. Para todas as linhagens, o meio à base do sustrato capim-elefante propiciou maior velocidade de crescimento, adicionados ou não de dextrose, quando comparados aos demais meios de cultura utilizados (Figs. 1, 2 e 3). Na Figura 1 verifica-se que o meio à base do substrato cana-de-açúcar foi o que apresentou a menor velocidade de crescimento para a linhagem POR01/03. Já para a outras linhagens estudadas, a menor velocidade de crescimento foi obtida em meio à base do substrato sabugo de milho.

O maior desenvolvimento do micélio no meio de cultivo à base de capim-elefante pode ser associado ao fato dos fungos basidiomicetos do gênero Pleurotus degradarem, facilmente, através da liberação de exoenzimas ligno-celulases e a ausência de compostos inibitórios ao crescimento, conforme verificado por SCHMIDT et al. (2003), ao inocular este fungo em feno de Brachiaria decumbens observaram diminuição no teor de hemicelulose do substrato.

Como observado na presente pesquisa, a utilização de capim-elefante pode ser uma alternativa, em função dos resultados serem superiores quando comparados à cana-de-açúcar. De acordo com DIAS et al. (2003), os cogumelos do gênero Pleurotus são cultivados tradicionalmente em bagaço de cana-de-açúcar, sendo que mesmo em regiões produtoras este resíduo tem-se tornado escasso, sendo de extrema importância a realização de pesquisas que busquem novos substratos como alternativa para o cultivo destes cogumelos.

Ao utilizar substratos à base de serragem de eucalipto e cana-de-açúcar no cultivo de L. edodes, REGINA (2001) observou que embora a serragem tenha se mostrado o melhor substrato para o cultivo deste cogumelo, o bagaço de cana-de-açúcar proporcionou inicialmente velocidades maiores. Segundo esta pesquisadora isso se deve a quantidade de nutrientes solúveis extraídos do bagaço de cana-de-açúcar, que possibilitou velocidade inicial superior. Isto não foi evidenciado neste experimento de cultivo com Pleurotus. Entretanto, corroboram com os dados publicados por MONTINI (2001), no cultivo de L. edodes em diferentes meios de cultivo, no qual observou que em uma das linhagens estudadas (LE98/51) a adição de bagaço de cana-de-açúcar ao meio de cultivo aumentou a velocidade de crescimento instantânea, assim como observado por REGINA (2001). Porém, em outra linhagem (LE98/53) desta mesma espécie estudada por MONTINI (2001) foi observado que a adição de bagaço de cana-de-açúcar ao meio de cultivo reduziu a velocidade instantânea de crescimento. Estes dois autores concluíram que a cinética de crescimento miceliano em superfície independe de linhagens e substratos.

Neste experimento com linhagens de Pleurotus spp. foram encontradas médias de crescimento miceliano de 58mm na linhagem POR01/03 em meio á base de capim-elefante e dextrose. KHAN et al. (1991) ao avaliarem o efeito de diferentes fontes de nitrogênio e carbono no crescimento radial de L. edodes, observaram que as melhores fontes de carbono foram sacarose, galactose e glicose, onde obtiveram o máximo crescimento radial de 17,6 mm. No cultivo de diferentes linhagens de Lyophyllum decastes em meio à base de batata-dextrose-ágar, KINUTA (1991) utilizou seis linhagens que foram incubadas a 24º C e outras cinco linhagens que foram incubadas a 27º C, após seis dias de cultivo avaliou o diâmetro da colônia formada e observou que o crescimento miceliano da linhagem NLD003 foi o maior de todas as estudadas, onde se obteve diâmetro de colônia de 34 mm a 24º C e 41 mm a 27º C.

CONCLUSÕES

De acordo com os resultados obtidos na presente pesquisa pode-se concluir que o capim-elefante se sobressai como o substrato mais promissor para o preparo de meio de cultivo das linhagens estudadas dentre os substratos testados. A suplementação do meio de cultura com dextrose aumenta a velocidade de crescimento e a massa miceliana das linhagens de Pleurotus. Dentre as linhagens testadas, destaca-se POR01/03 conferindo maior velocidade de crescimento miceliano.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Abr 2022
• Data do Fascículo
  Jul-Sep 2005

Histórico

• Recebido
  10 Ago 2005
• Aceito
  11 Set 2005