ESTUDO COMPARATIVO ENTRE TÉCNICAS DE ISOLAMENTO E PCR PARA DETECÇÃO DE MYCOPLASMA E UREAPLASMA DIVERSUM EM MUCO PREPUCIAL E SÊMEN IN NATURA DE TOUROS DE MONTA NATURAL E CENTRAL DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL

COMPARATIVE STUDY BETWEEN ISOLATION TECHNIQUES AND PCR FORMYCOPLASMA AND UREAPLASMA DIVERSUM DETECTION IN PREPUCIAL MUCUS AND FRESH SEMEN FROM NATURAL BREEDING AND AI CENTER BOVINE BULLS.

RESUMO

Com o objetivo de aprimorar os métodos diagnósticos em micoplasmoses foi realizado um estudo utilizando-se muco prepucial e sêmen innatura de touros de monta natural e de uma central de inseminação artificial com o objetivo de reduzir o tempo necessário para a emissão de resultados e aumentar os níveis de detecção, assumindo o isolamento bacteriano, técnica dependente da viabilidade microbiana, como teste gold standard. Cento e setenta e cinco amostras de muco prepucial e 143 amostras de sêmen fresco foram estudadas. Através da técnica de PCR (Reação da Polimerase em Cadeia), uma triagem prévia das amostras foi realizada para detecção de Mollicutes, utilizando-se o sistema MGSP/GPO-1. Primers espécie-específicos para Mycoplasma bovigenitalium e Ureaplasma diversum foram posteriormente utilizados. Ao isolamento, foram observados 45,1% (79/175) de positivos para Mollicutes e 66,5% (115/173) para U. diversum em muco de prepucial. Comparativamente, a PCR revelou 63,7% (109/171) de amostras positivas através de sistema de MGSP/GPO-1, 42,6% (72/169) de amostras positivas para M. bovigenitalium e 72,9% (124/170) para U. diversum. O estudo das amostras de sêmen apresentou 22,5% (32/142) de positivos para Mollicutes e 51,7% (74/143) para U. diversum, através do isolamento. Pela PCR, foram detectadas 24,1% (33/137) de amostras positivas no sistema MGSP/GPO-1, 27,4% (34/124) de amostras positivas para M. bovigenitalium e 56,6% (73/129) para U. diversum. O teste de McNemar para presença de Mollicutes em muco de prepucial (p = 0,57), mostrou que o sistema MGSP/GPO-1 pode ter um valor considerável quando associado à detecção específica de U. diversum, apresentando uma boa sensibilidade (75,2%), porém baixa especificidade (58,9%). A análise estatística mostrou que o sistema MGSP/GPO-1 de triagem poderia substituir o isolamento preliminar para Mycoplasma spp. em amostras de sêmen (p = 0,86).

PALAVRAS-CHAVE
Mycoplasma ; Ureaplasma diversum ; touros; sêmen; diagnóstico

ABSTRACT

With the objective of improving the diagnostic methods in mycoplasmosis, a study was carried out using bovine prepucial mucus and fresh semen from natural breeding and one Artificial Insemination Center with the aim to reduce the time necessary for the emission of results and to increase the detection levels, assuming bacterial isolation, on technique that depends on microbial viability, as the gold standard test. One hundred and seventy-five prepucial mucus samples and 143 fresh semen samples were studied. By PCR (Polymerase Chain Reaction) technique, a previous screening using the MGSP/GPO-1 system was tested for Mollicutes detection. Species-specific primers for Mycoplasma bovigenitalium and Ureaplasma diversumwere used subsequently. By isolation there were observed 45.1% (79/175) of positivity for Mollicutes and 66.5% (115/173) for U. diversum in prepucial mucus. Comparatively, PCR revealed 63.7% (109/171) of positive samples by MGSP/GPO-1, 42.6% (72/169) of positive samples for M. bovigenitalium and 72.9% (124/170) for U. diversum. The semen samples study presented 22.5% (32/142) of positivity for Mollicutes and 51.7% (74/143) for U. diversum, by isolation. By PCR, 24.1% of positive samples were detected (33/137) using the MGSP/GPO-1 system, 27.4% (34/124) of positive samples for M. bovigenitalium and 56.6% (73/129) for U. diversum. The McNemar test for the Mollicutes presence in prepucial mucus (p = 0.57) showed that theMGSP/GPO-1 system can have a considerable value when associated with specific detection of U. diversum, showing good sensitivity (75.2%), however lower specificity (58.9%). The statistical analysis showed that the screening by MGSP/GPO-1 system could substitute the preliminary isolation of Mycoplasma spp. in semen samples (p = 0.86).

KEY WORDS
Mycoplasma ; Ureaplasma diversum ; bulls; semen; diagnosis

INTRODUÇÃO

Várias são as doenças infecciosas que afetam o desempenho reprodutivo de bovinos: brucelose, leptospirose, campilobacteriose, rinotraqueite infecciosa bovina, diarréia viral bovina e tricomoníase, estão entre as mais freqüentemente associadas à distúrbios reprodutivos (EAGLASOME et al., 1992; KIRKBRIDE, 1987). Ao lado destas doenças, várias outras, menos conhecidas e, conseqüentemente, pouco divulgadas, como as micoplasmoses, deveriam ser investigadas, pois resultam em quadro sintomatológico semelhante àquelas citadas acima, além de constar da lista B da Organização Internacional de Epizootias (OIE) como doenças suscetíveis de serem transmitidas pela inseminação artificial (THIBIER & GUERIN, 2000).

Mycoplasma e Ureaplasma diversum são conhecidas e ocorrem predominantemente na cavidade oral, tratos respiratório e urogenital de várias espécies animais e de humanos. Estes agentes estão comprovadamente envolvidas em casos de vesiculite seminal, balanopostite, epididimite (PILASZEK & TRUSZCYNSKI, 1988) e outras patologias responsáveis por alterações morfológicas e funcionais dos espermatozóides (EAGLESOME et al., 1992; PANANGALA et al., 1981), como diminuição da motilidade que resulta em baixa qualidade do sêmen (DOIG, 1981b; FISH et al., 1985; HALL & MCENTEE, 1981; HUFFMAN et al., 1985; JASPER, 1987; RAE et al., 1995).

A transmissibilidade venérea dos micoplasmas e ureaplasmas para fêmeas sãs, através de partidas de sêmen contaminado, é de relevante importância (KIRKBRIDE, 1987). Mycoplasma spp. e U. diversum têm distribuição mundial e podem ser disseminados através do comércio internacional de animais, sêmen industrializado e recentemente, de produtos de transferência de embriões (BRITTON et al., 1988; DOIG et al., 1981b; MILLER et al., 1994).

A aderência dos microrganismos interfere na espermatogênese, transporte espermático, capacitação e fecundação. Além disso, espermatozóides podem atuar como vetores na transmissão dos agentes, já que os antibióticos rotineiramente utilizados em Centrais de Inseminação não agem sobre micoplasmas e ureaplasmas (RAE et al., 1995).

A importância de Mycoplasma spp. e U. diversum em sêmen de touros de campo e de central de inseminação (CI) é caracterizada pela interferência com a maturação espermática e diminuição da resistência do espermatozóide ao choque causado pela congelação e descongelação. Infecções dos testículos ou epidídimo podem resultar em alterações morfológicas (ultra-estrutural) no espermatozóide e a motilidade pré-congelação pode diminuir (KIRKBRIDE, 1987).

Os métodos utilizados rotineiramente para a detecção de Mycoplasma e Ureaplasma estão restritos à técnicas de cultivo e identificação sorológica das cepas isoladas (Imunodifusão, Imunoperoxidase, Imunofluorescência e ELISA), métodos estes demorados, de difícil observação e dispendiosos (KUPPEVELD et al., 1992; SIMECKA et al., 1992). Apesar do cultivo ser considerado uma “técnica de certeza”, pois através dela é possível a visualização dos microrganismos, as dificuldades encontradas na coleta do material clínico à campo, onde sua contaminação por bactérias oportunistas é fato comum, e o tempo decorrido entre a coleta e o processamento laboratorial, podem alterar a viabilidade do microrganismo, prejudicando o cultivo em meios artificiais, o que torna os resultados dos exames incertos. Estes fatores têm determinado a implementação de técnicas mais sensíveis e específicas e ao mesmo tempo mais rápidas e econômicas como técnicas moleculares. APCR (Polymerase Chain Reaction/Reação da Polimerase em Cadeia), tem sido utilizada com a intenção de tornar o diagnóstico das micoplasmoses, em geral, mais eficiente.

Combinando-se o primer MGSO selecionado a partir da região 16Sr RNA com o oligonucleotídeo procariótico GPO-1, amplifica-se um fragmento de 715 pares de bases, o qual está presente em todos os organismos da classe Mollicutes (KUPPEVELD et al., 1992). No presente trabalho, estes primers foram utilizados com a intenção de testar sua eficiência em um processo de triagem das amostras clínicas, independentemente da utilização dos primers espécieespecíficos.

Com o objetivo de testar as técnicas diagnósticas para micoplasmoses da reprodução em bovinos, foi realizado um levantamento utilizando-se muco prepucial e sêmenin natura de touros com o intuito de reduzir o tempo para emissão dos resultados laboratoriais e melhorar os níveis de detecção dos agentes, assumindo o isolamento bacteriano laborioso, demorado e dependente de organismos viáveis, como teste gold standard.

MATERIAL E MÉTODOS

Os materiais clínicos utilizados para detecção da presença de Mycoplasma spp., M. bovigenitalium e U. diversum foram muco prepucial e sêmen in natura, colhidos de touros de quatro propriedades rurais e uma central de inseminação, localizadas no Estado de São Paulo.

As amostras de muco de prepúcio foram colhidas utilizando-se swabs, introduzidos no orifício prepucial após tricotomia e higienização local com água corrente. Os swabs foram conservados em meio de transporte A_3XB (CUNHA et al., 1987), e mantidos sob refrigeração (4º C) até o momento do processamento laboratorial, realizado em um período máximo de 48.

As amostras de sêmen foram colhidas por eletroejaculação, em tubos estéreis, e mantidas sob refrigeração.

Diagnóstico Laboratorial

O diagnóstico laboratorial foi realizado através de 2 métodos distintos de detecção bacteriana: o isolamento e a PCR. Primeiramente, as amostras de muco prepucial e sêmen, foram semeadas em meios de cultura específicos para cultivo de Mycoplasma e Ureaplasma, ágares M (Hayflick) e U, caldos M e U, segundo RUHNKE & ROSENDAL, 1994. Os ágares M e U foram friccionados com o swab e, posteriormente, a partir do meio de transporte contendo muco, o volume de 0,3 mL da suspensão foi utilizado para realização de 3 diluições decimais em caldos M e U, totalizando 2 placas e 6 tubos para leitura subseqüente, por amostra clínica processada. As placas de ágar foram incubadas por 15 dias, a 37º C em jarra de microaerofilia (GENOVEZ et al., 1989), sob atmosfera de 95% N₂ + 5% CO₂ e O₂ residual, após a remoção do ar do interior da jarra (-600 mmHg) utilizando-se bomba de vácuo. Os caldos foram incubados por até 15 dias a 37º C, em aerobiose.

As placas e os tubos foram observados diariamente por 15 dias consecutivos. As placas de agar foram lidas em lupa estereoscópica com aumento de 40X.

O crescimento de Mycoplasma e Ureaplasma foi caracterizado através de morfologia colonial típica, quando do crescimento sobre agar. O crescimento nos caldos foi observado através da alteração da coloração dos mesmos (pela mudança do pH, o caldo amarelo se torna róseo) e/ou através de sub-cultivos (caldo ⇨ agar) para confirmação do crescimento bacteriano.

Os cultivos positivos foram conservados sob congelamento (-70º C) para posterior caracterização das estirpes.

Foram consideradas negativas as culturas onde não foi observada alteração do pH do caldo e/ou não foram evidenciadas colônias características em agar.

PCR

O DNA genômico das amostras de muco prepucial foi extraído e purificado utilizando-se a técnica de Fenol - Clorofórmio (BARBEYRAC et al., 1996), a partir de 1 mL dos meios de transporte A_3XB contendo as amostras clínicas dos animais. Para as amostras de sêmen, foi utilizada a técnica de extração de DNA CTAB (ROGERS & BENDICH, 1994). Para a execução da PCR foram utilizados os protocolos de CARDOSO et al. (2000), KOBAYASHI et al. (1997), KUPPEVELD et al. (1992) e SUBRAMANIAN et al. (1998).

Como controles positivos de reação foram utilizadas estirpes padrão ATCC (American Type Culture Collection). O controle negativo foi realizado com uma alíquota da mistura de reação sem aplicação de amostra clínica ou estirpe padrão. Os produtos amplificados foram aplicados em gel de agarose, submetidos à eletroforese e corados com brometo de etídio para visualização em transiluminador.

Análise Estatística

As provas de McNemar (SIEGEL, 1975), utilizando χ², tabela 2 x 2, e índice Kappa (MACLURE & WILLET, 1987) foram utilizadas para análise comparativa entre as técnicas de cultivo e PCR, adotando-se o nível de confiança de 0,05.

A eficiência comparativa das técnicas de PCR e cultivo foi estabelecida com os índices relativos de sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivos e negativos (GALEN & GAMBINO, 1975).

RESULTADOS

Isolamentos e PCR

As porcentagens de detecção de Mycoplasma spp. e U. diversum obtidas pelo isolamento, são apresentadas na Tabela 1.

Tabela 1
Cultivos para isolamento de Mycoplasma spp. e U. diversum em bovinos, segundo o grupo experimental, o material clínico e o microrganismo investigado. São Paulo, 1999 - 2002.

Grupos1	Muco prepucial			Sêmen
	Mycoplasma spp. (%)2	U. diversum (%)		Mycoplasma spp. (%)	U. diversum (%)
Total	79/175 (45,1)	115/173 (66,5)		32/142 (22,5)	74/143 (51,7)
1	61/105 (58,1)	82/103 (79,6)		21/79 (26,6)	52/80 (65,0)
2	18/70 (25,7)	33/70 (47,1)		11/63 (17,5)	22/63 (34,9)

• ¹
  Grupo 1: reprodutores de campo; Grupo 2: reprodutores de central de inseminação.
• ²
  Proporção: número de positivos/número de examinados.

Na Tabela 2, constam os resultados da detecção de Mycoplasma spp., M. bovigenitalium e U. diversum obtidos pela técnica de PCR.

Tabela 2
Exames de PCR para Mycoplasma spp. ou M. bovigenitalium ou Ureaplasma diversum em bovinos, segundo o tipo de material clínico, o grupo experimental e o tipo de primer empregado. São Paulo, 1999 – 2002.

Materiais	Primers	Grupos
		11		2		Total
		Resultados
		Positivos/total (%)		Positivos/total (%)		Positivos/total (%)
	MGSO/GPO-1	67/88 (76,14)		42/82 (51,22)		109/170 (64,12)
Muco Prepucial	M. bovigenitalium	46/87 (52,87)		26/81 (31,09)		72/168 (42,85)
	U. diversum	78/87 (89,65)		51/83 (61,44)		129/170 (75,88)
	MGSO/GPO-1	14/36 (38,89)		5/59 (8,47)		19/95 (20,00)
Sêmen	M. bovigenitalium	17/36 (47,22)		4/52 (7,69)		21/88 (23,86)
	U. diversum	31/37 (83,78)		23/54 (42,59)		54/91 (59,34)

• ¹
  Grupo 1: reprodutores de campo; Grupo 2: reprodutores de central de inseminação.
• ²Proporção: número de positivos/número de examinados.

A Tabela 3 apresenta as freqüências de detecção de Mycoplasma spp. e U. diversum por isolamento e PCR.

Tabela 3
Comparação entre as freqüências de detecção de Mycoplasma spp. ou U. diversum por isolamento e PCR, segundo o material clínico e o grupo estudado. São Paulo, 1999 – 2002.

Grupos	Muco Prepucial						Sêmen
	Mycoplasma spp. (%)			U. diversum (%)			Mycoplasma spp. (%)			U. diversum (%)
	Isol1.	PCR2		Isol.	PCR		Isol.	PCR		Isol.	PCR
1	58,1	76,9		79,6	85,1		26,6	35,5		65,0	76,6
2	25,7	43,3		47,1	55,1		17,5	9,8		34,9	26,9

• ¹
  Isolamento.
• ²
  Reação da polimerase em cadeia.

Avaliação da eficiência do sistema MGSO/GPO-1 frente ao isolamento bacteriano

A eficiência do sistema MGSO/GPO-1 e dos primers espécie-específicos (Mbg e UD) utilizados na PCR, analisada pelos testes de sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivo e negativo, índice Kappa e c² de McNemar, nas amostras de muco prepucial e sêmen, pode ser observada nas tabelas 4 e 5, respectivamente.

No diagnóstico de muco prepucial, os valores de p ³ 0,05 foram encontrados na utilização do primer Mbg (M. bovigenitalium) frente ao isolamento de Mycoplasma spp. e do sistema MGSO/GPO-1, frente ao isolamento de U. diversum. Para o sêmen, p³ 0,05 foi observado no sistema MGSO/GPO-1 frente ao isolamento de Mycoplasma spp. e frente à PCR para M. bovigenitalium; na utilização dos primers para M. bovigenitalium e U. diversum frente aos isolamentos de Mycoplasma spp. e U. diversum, respectivamente.

Tabela 4
Análise comparativa entre o isolamento bacteriano e a PCR, técnicas utilizadas para detecção de Mycoplasma spp. ou M. bovigenitalium ou Ureaplasma diversum em muco prepucial bovino. São Paulo, 1999 – 2002.

Técnicas testadas	Sensibilidade	Especificidade	VP+1	VP-2	Teste	χ2 (McNemar)3	p4
	(%)	(%)	(%)	(%)	Kappa
PCR MGSO/GPO-1 e	76,62	46,81	54,13	70,97	0,2258	14,13	0,0002
Isolamento Mycoplasma spp.
PCR M. bovigenitalium e	49,35	63,44	52,78	60,20	0,1286	0,22	0,6397
Isolamento Mycoplasma spp.
PCR MGSO/GPO-1 e	75,22	58,93	78,70	54,10	0,3340	0,31	0,5754
Isolamento U. diversum
PCR U. diversum e	85,84	44,64	75,78	60,98	0,3269	4,17	0,0411
Isolamento U. diversum
PCR M. bovigenitalium e	57,80	86,44	88,73	52,58	0,3854	25,35	0,0000
PCR MGSO/GPO-1

• ¹
  Valor preditivo positivo.
• ²
  Valor preditivo negativo.
• ³
  Qui-Quadrado de McNemar.
• ⁴
  Probabilidade associada à hipótese de nulidade.

Tabela 5
Análise comparativa entre o isolamento bacteriano e a PCR, técnicas utilizadas para detecção de Mycoplasma spp. ou M. bovigenitalium ou Ureaplasma diversum em sêmen bovino. São Paulo, 1999 – 2002.

Técnicas testadas	Sensibilidade	Especificidade	VP+1	VP-2	Teste	χ2 (McNemar)3	p4
	(%)	(%)	(%)	(%)	Kappa
PCR MGSO/GPO-1 e	45,16	81,55	42,42	83,17	0,2613	0,03	0,8676
Isolamento Mycoplasma spp.
PCR M. bovigenitalium e	34,48	74,74	29,41	78,89	0,0870	0,37	0,5419
Isolamento Mycoplasma spp.
PCR MGSO/GPO-1 e	34,25	79,10	64,10	52,48	0,1308	17,56	0,0000
Isolamento U. diversum
PCR U. diversum e	71,88	50,77	58,97	64,71	0,2261	3,38	0,0660
Isolamento U. diversum
PCR M. bovigenitalium e	74,19	89,13	69,70	91,11	0,6200	0,06	0,8137
PCR MGSO/GPO-1

• ¹
  Valor preditivo positivo.
• ²
  Valor preditivo negativo.
• ³
  Qui-Quadrado de McNemar.
• ⁴
  Probabilidade associada à hipótese de nulidade.

DISCUSSÃO

CARDOSO, (1998) empregou a técnica de PCR, com primers obtidos da região 16S rRNA e condições de estringência específicas, para a pesquisa deU. diversum em muco vulvovaginal bovino. Através daPCR foram classificados como positivos 52,9% de 168 fêmeas estudadas, enquanto que pelo isolamento a taxa de detecção foi de 35,7%.

Um dos poucos trabalhos comparativos enfocando a detecção de micoplasmas através da PCR e de métodos de isolamento utilizando swabs penianos, pré-ejaculados e sêmen de 438 eqüinos, relatou taxa de 80% (352/438) de positivos pela PCR e 29% (125/438) pelo isolamento, mostrando uma diferença considerável, no entanto, estas discrepâncias estão de acordo com relatos que descrevem uma baixa sensibilidade para as técnicas de isolamento de micoplasmas a partir de amostras clínicas quando comparadas aos métodos moleculares (SPERGSER et al., 2002).

ALBERTSEN (1955), na Dinamarca, aventou a possibilidade de que microrganismos resistentes à antibióticos seriam responsáveis pela baixa fertilidade persistente em touros. Com o intuito de esclarecer esta hipótese, obteve 89% (76/85) de amostras de sêmen positivas ao isolamento, para microrganismos do gênero Mycoplasma.

A contaminação de sêmen e muco prepucial por U. diversum foi verificada em 1969, na Inglaterra, quando 10 culturas de muco prepucial e 84% de 32 amostras de sêmen in natura foram positivas para o agente (TAYLOR-ROBINSON et al., 1969). Posteriormente, ONOVIRAN et al. (1975), no Canadá, observaram 35% de 132 amostras de mucos prepuciais, 24% de 140 amostras de sêmen in natura e 14% de 42 amostras de sêmen processado, positivas para U. diversum. Na Tchecoslováquia, em 1978, foram observados 46,5% de positivos em 202 amostras de sêmen de touros de centrais de inseminação (DOIG, 1981a). BALL et al. (1987) examinaram 332 amostras de sêmen fresco e detectaram 46% de contaminação por Mycoplasma spp., destas, 32% também estavam contaminadas por U. diversum. RUHNKE (1994), no Canadá, reportou uma variação de 23 a 84% de touros positivos para U. diversum em sêmen fresco; contudo, as amostras de muco prepucial e secreção de uretra distal apresentaram uma variação de 29 a 100% de positivos sendo que a presença de ureaplasmas nestes sítios geralmente não está associada a sinais clínicos.

O primeiro registro da presença de Ureaplasma diversum em bovinos no Brasil foi efetuado por CARDOSO et al. (1997), a partir de muco vaginal de fêmeas que apresentavam vulvovaginite granular (VVG). Posteriormente, em levantamento realizado em sete propriedades da macro-região de Itapetininga, Estado de São Paulo, de 152 amostras colhidas de 59 vacas com sintomatologia clínica de VVG, houve 54 (91,5%) positivas para U. diversum (CARDOSO et al., 2000).

Na detecção de Mycoplasma spp., as amostras de muco prepucial do Grupo 1 apresentaram 58,1% (61/105) de positividade pelo isolamento e 76,9% (80/104) pela PCR; no Grupo 2, as positividades foram 25,7% (18/70) ao isolamento e 43,3% (29/67) à PCR. Nas amostras de sêmen, as freqüências de Mycoplasma spp. observadas foram 26,6% (21/79) ao isolamento e 35,5% (27/76) à PCR, para o Grupo 1; no grupo 2 as freqüências foram 17,5 (11/63) no isolamento e 9,8 (6/61) à PCR.

No Brasil, TERAZAKI et al. (1991) examinaram sêmen processado em centrais de inseminação e encontraram uma freqüência de 10% (11/110) de positivos para Mycoplasma spp., no entanto, POUMARAT & MARTEL (1987) registraram freqüências de isolamento para Mollicutes variáveis, de 40 à 80% e para U. diversum, de 10 à 47% em sêmen bovino. No presente estudo houve menores taxas de isolamento para Mollicutes e maiores para U. diversum. Contudo, RUHNKE & ROSENDAL (1994) referiram uma freqüência variável de 23 a 84% de positividade para U. diversum em sêmen in natura contaminado, o que coincide com o presente trabalho. Sugeriram ainda, a importância do sêmen como veículo na transmissão de ureaplasmas. Resultado compatível foi encontrado por FISH et al. (1985), que observaram 53,3% de Mycoplasma spp. e 48,8% de U. diversum e por HODGES & HOLLAND (1980), que encontraram 76% de positividade para ureaplasmas em amostras de muco prepucial bovino.

A espécie M. bovigenitalium foi encontrada em 56,4% (57/101) das amostras de muco prepucial no Grupo 1 e 22,1% (15/68) no Grupo 2. Nas amostras de sêmen, a freqüência encontrada foi de 43,2% (32/74) no Grupo 1 e 4,0% (2/50) no Grupo 2, confirmando os altos índices de infecção por tal agente. Dados similares foram relatados por BALL et al. (1987) que detectaram 48% de positivos para M. bovigenitalium e 72% de positivos para Ureaplasma em muco prepucial bovino enquanto que no sêmen, as taxas foram 20 e 32%, respectivamente.

As positividades encontradas pelaPCR dizem respeito à utilização do sistema MGSP/GPO-1, que detecta Mollicutes. As taxas de detecção de Mycoplasma spp. e U. diversum, pela PCR, foram menores (9,8 e 26,9%, respectivamente) que as encontradas ao isolamento (17,5 e 34,9%, respectivamente) nas amostras de sêmen colhidas nos animais do Grupo 2, contrariando o restante dos resultados, onde a PCR detectou maior número de positivos, como o esperado. O achado pode ser explicado pelo processo de extração do DNA cromossomal, que apesar de ter sido o mesmo utilizado com o restante das amostras processadas, pode ter sofrido influência de fatores inibidores. Como relatado por GUERIN et al. (1995), VAN ENGELENBURG et al. (1993) e XIA et al. (1995), componentes presentes no plasma seminal podem causar inibição à reação da PCR.

Na análise comparativa dos valores discordantes entre técnicas de processamento de muco prepucial (McNemar), não houve diferença estatisticamente significante, quando foram comparadas as técnicas: PCR por sistema MGSO/GPO-1 e isolamento de U. diversum (p = 0,5754), além de PCR para M. bovigenitalium e Isolamento para Mycoplasma spp. (p = 0,6397). No entanto, houve significância (p≤ 0,05) para os valores discordantes observados nos resultados dos testes efetuados em muco: PCR por sistema MGSO/ GPO-1 comparada ao isolamento de Mycoplasma spp. e comparada à PCR para M. bovigenitalium, além de PCR e isolamento para U. diversum. Observa-se, portanto, que apesar da técnica de PCR ter apresentado maiores freqüências de detecção que os isolamentos, na maioria dos grupos estudados, os testes de sensibilidade, especificidade e Kappa, não indicaram a utilização única de uma técnica molecular para a detecção bacteriana. Nas associações, onde os resultados discordantes entre dois procedimentos ficaram dentro da margem do acaso, a substituição de uma técnica pela outra seria razoável.

A possibilidade de substituição da técnica de isolamento pelo sistema MGSO/GPO-1 de PCR, foi encontrada para o diagnóstico inicial (triagem) de U. diversum em muco prepucial e, nas amostras de sêmen, para Mycoplasma spp. Apesar da comparação entre as técnicas ter apresentado esta possibilidade de substituição, novas investigações são indicadas com vistas à melhoria das características de sensibilidade e especificidade apresentadas.

Observou-se que no processamento de amostras de muco prepucial e sêmen, a PCR específica para M. bovigenitalium poderia substituir o isolamento, aprimorando sobremaneira o diagnóstico, já que a técnica de isolamento não é espécie-específica para esta bactéria, necessitando-se de uma prova sorológica para a tipagem bacteriana.

Em sêmen, foi constatado que a PCR espécieespecífica, para U. diversum, teria pouca possibilidade de ser uma alternativa ao isolamento (p = 0,066). A prova apresentou uma especificidade mediana (50,77%) e o índice Kappa apresentou um grau de concordância razoável (0,2261). CARDOSO et al. (2000), padronizaram a técnica de NESTED-PCR para o diagnóstico de vulvovaginite granular, selecionando os pares de primers UD, utilizados para detectar U. diversum em amostras de muco vaginal bovino. No referido trabalho, 52,9% das amostras testadas foram positivas resultando em 100% de sensibilidade, 73,1% de especificidade e 82,7% de eficiência para a técnica de PCR.

Os exames de sêmen apresentados na tabela 6 mostram que a PCR espécie-específica para M. bovigenitalium foi plenamente satisfatória (p = 0,8137) em relação ao sistema MGSO/GPO-1 de PCR, ou seja, a freqüência de valores discordantes observados está dentro da margem atribuída ao acaso. A técnica mostrou uma sensibilidade razoável (74,19%), uma boa especificidade (89,13%) e o índice Kappa apresentou concordância substancial (0,62).

Os resultados obtidos neste trabalho trouxeram informações relevantes para os laboratórios diagnósticos onde a padronização de técnicas de isolamento de micoplasmas pode ser difícil. A baixa sensibilidade encontrada no diagnóstico em sêmen pode ser justificada pela presença de inibidores presentes na reação. Por outro lado, o diagnóstico molecular em muco prepucial apresentou uma boa sensibilidade, porém, baixa especificidade. A PCR para M. bovigenitalium apresentou excelente nível de detecção em muco prepucial e em sêmen, justificando a necessidade do diagnóstico desta espécie em reprodutores, especialmente em amostras de sêmen, que deveriam estar livres de qualquer contaminação.

AGRADECIMENTOS

À FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) pelo financiamento de parte deste trabalho.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  10 Jan 2022
• Data do Fascículo
  Jan-Mar 2006

Histórico

• Recebido
  26 Set 2005
• Aceito
  06 Fev 2006