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ATIVIDADE “IN VITRO” DE TRÊS AGENTES QUÍMICOS FRENTE A DIFERENTES ESPÉCIES DE ASPERGILLUS* * Parte integrante da dissertação de mestrado do primeiro autor.

IN-VITRO ACTIVITY OF THREE CHEMICAL AGENTS AGAINST DIFFERENT SPECIES OF ASPERGILLUS

RESUMO

A aspergilose é causada por fungos ubíquos e oportunistas do gênero Aspergillus, que liberam milhares de conídios no ar, contaminando o ambiente, sendo de extrema importância a utilização de filtros de ar e programas corretos de anti-sepsia e desinfecção para prevenção da enfermidade. Este estudo avaliou a eficácia “in vitro” dos agentes químicos, iodóforo, amônia quaternária e clorexidina, frente a isolados de Aspergillus fumigatus (8), Aspergillus niger (8), Aspergillus flavus (6) e Aspergillus terreus (1). Para o teste foram preparadas diluições sucessivas dos desinfetantes/antisépticos (log2) em caldo RPMI, e os inóculos foram ajustados até uma concentração final de 5 x 104 UFC/mL. Foi realizada a técnica de microdiluição em caldo de acordo com NCCLS M-38, adaptada para agentes químicos, com incubação das microplacas a 35° C em agitação constante. A leitura visual dos resultados foi realizada após 96 horas, e os isolados de Aspergillus spp. utilizados foram resistentes ao iodóforo nas concentrações testadas. A amônia quaternária e a clorexidina mostraram-se eficazes contra os isolados de Aspergillus spp., com exceção de um A. fumigatus e um A. terreus. Com estes resultados indica-se a utilização da amônia quaternária e da clorexidina na prevenção da aspergilose, questionando-se o uso de iodóforos para este fim.

PALAVRAS-CHAVE
Aspergilose; Aspergillus spp.; desinfetantes; anti-sépticos

ABSTRACT

Aspergillosis is caused by ubiquitous and opportunist moulds of the genus Aspergillus, which contaminate the atmosphere by liberating thousands of conidia in the air, making it extremely important to use air filters and to implement proper programs of antisepsis and disinfection for the prevention of this disease. This study evaluated the in-vitro effectiveness of the chemical agents iodophor, quaternary ammonia and chlorexidine against A. fumigatus (8), A. niger (8), A. flavus (6) and A. terreus (1). Successive dilutions of disinfectants/antiseptics (log2) were prepared in RPMI for the test, and the suspension was adjusted until a final concentration of 5 x 104 UFC/mL. The microdilution test was done in agreement with NCCLS M-38 adapted for chemical agents, with microplates incubation at 35° C in constant agitation. The visual results were evaluated after 96 hours, and all Aspergillus spp. isolates used were resistant to iodophor at all concentrations tested. Quaternary ammonia and chlorexidine showed effectiveness against Aspergillus spp. isolates, except for one A. fumigatus and one A. terreus. According to these results the use of quaternary ammonia and chlorexidine is indicated for the prevention of aspergillosis, while the use of iodophor is questionable.

KEY WORDS
Aspergillosis; Aspergillus spp.; disinfectants and antiseptics

As micoses oportunistas, como a aspergilose, adquiriram uma grande importância em saúde pública nas últimas décadas, devido à incidência da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), o desenvolvimento de novas terapias para pacientes oncológicos, e os avanços nas técnicas cirúrgicas de transplantes de órgãos, que culminaram com o aumento do número de pacientes imunocomprometidos (BRETAGNE et al., 1997BRETAGNE S.; BART-DELABESSE, E.; WECHSLER, J.; KUENTZ, M. DHÉDIN N.; CORDONNIER C. Fatal primary coetaneous aspergillus’s in a boné marrow transplant recipient: nosocomial acquisition in a laminar-air flow room. Journal of Hospital Infection, v.36, n.3, p.235-239, 1997.; LATGÉ, 1999LATGÉ, J.P. Aspergillus fumigatus and Aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews, v.12, n.2, p.310-350, 1999.; STEVENS et al., 1999STEVENS, D.A.; KAN, V.L.; JUDSON, M.A.; MORRISON, V.A.; DUMMER, S.; DENNING, D.W.; BENNETT, J.E.; WALSH, T.J.; PATTERSON, T.F.; PANKEY, G.A. Practice Guidelines for Diseases Caused by Aspergillus. Clinical Infectious Diseases, v.30, p.696-709, 2000.; MARTINS-DINIZ et al., 2005MARTINS-DINIZ, J.N.; SILVA, R.A.M.; MIRANDA, E.T.; MENDESGIANNINI, M.J.S. Monitoramento de fungos anemófilos e de leveduras em unidade hospitalar. Revista de Saúde Pública, v.39, n.3, p.398-405, 2005.). Em medicina veterinária, esta micose se destaca por causar sérios prejuízos à produção avícola, acometendo principalmente aves jovens e ovos embrionados, e por determinar altas taxas de mortalidade em pingüins e outras aves silvestres mantidas em cativeiro, em zoológicos e/ ou centros de reabilitação (FLACH et al., 1990FLACH, E.J.; STEVENSON, M.F.; H NDERSON, G.M. Aspergillosis in gentoo penguins (Pygoscelis papua) at Edinburgh Zoo, 1964-1988. Veterinary Record, v.126, n.4, p.81-85, 1990.; ANDREATTI, 2000ANDREATTI FILHO, R.L. Enfermidades Micóticas, In: BERCHIERI JÚNIOR, A.; MACARI, M. (Eds.). Doenças das aves. Campinas: FACTA, 2000. p.369-375.; ABUNDIS-SANTAMARIA, 2003ABUNDIS-SANTAMARIA, E. Aspergillosis in birds of prey. 2003. Disponível em: <http//www.aspergillus.man.ac.uk>. Acesso em: 23 mar. 2005.
http//www.aspergillus.man.ac.uk...
; LAIR-FULLERINGER, 2003LAIR-FULLERINGER, S.; GUILLO, T,J.; DESTERKE, C.; SEGUIN, D.; WARIN, S.; BEZILLE, A.; CHERMETTE, R.; BRETAGNE, S. Differentiation between Isolates of Aspergillus fumigatus fromBreeding Turkeys and Their Environment by Genotyping with Microsatellite Markers. Journal of Clinical Microbiology, v.41, n.4, p.1798-1800, 2003.).

As espécies comumente envolvidas com quadros clínicos tanto em humanos quanto em animais são principalmente o Aspergillus fumigatus, seguido do Aspergillus flavus, Aspergillus niger e Aspergillus terreus (LATGÉ, 1999LATGÉ, J.P. Aspergillus fumigatus and Aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews, v.12, n.2, p.310-350, 1999.; ABUNDIS-SANTAMARIA , 2003). Como o Aspergillus spp. é um fungo ubíquo, milhares de conídios são desprendidos das fiálides diariamente e dispersos no ar, contaminando o ambiente (LATGÉ, 1999LATGÉ, J.P. Aspergillus fumigatus and Aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews, v.12, n.2, p.310-350, 1999.). Neste contexto, é de extrema importância, além da utilização de filtros de ar, o emprego correto de programas de anti-sepsia e desinfecção, à medida que auxilia na prevenção da enfermidade através da redução do nível de contaminação por microrganismos fúngicos em tecidos vivos, superfícies e objetos inanimados (LATGÉ, 1999LATGÉ, J.P. Aspergillus fumigatus and Aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews, v.12, n.2, p.310-350, 1999.; M CDONNEL;RUSSEL, 1999MCDONNELL, G.; R USSEL, A.D. Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action, and Resistance. Clinical Microbiology Review, v.12, n.1, p.147-179, 1999.; ABUNDIS-SANTAMARIA, 2003ABUNDIS-SANTAMARIA, E. Aspergillosis in birds of prey. 2003. Disponível em: <http//www.aspergillus.man.ac.uk>. Acesso em: 23 mar. 2005.
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; TESSARI et al., 2004TESSARI, E.N.C.; CARDOSO, A.L.S.P.; CASTRO, A.G.M.; KANASHIRO, A.M.I.; ZANATTA, G.F. Prevalência de Aspergilose Pulmonar em pintos de um dia de idade. Arquivos do Instituto de Biologia, São Paulo, v.71, n.1, p.75-77, 2004. Disponível em: <http://www.biologico.sp.gov.br/ARQUIVOS/V71_1/tessari.pdf>. Acesso em 23 mar. 2005.
http://www.biologico.sp.gov.br/ARQUIVOS/...
).

A escolha de um agente químico desinfetante não é uma tarefa fácil frente a grande variedade de produtos existentes no mercado, devendo ser levado em consideração fatores como espectro de atividade desejada, toxicidade, poder residual, custo, estabilidade, e natureza do material a ser tratado. Os principais desinfetantes utilizados são álcoois, formaldeído, glutaraldeído, compostos liberadores de cloro ativo (como hipoclorito de sódio), compostos quaternário de amônio (como cloreto de benzalcônio), iodóforos e biguaninas (como clorexidina). Dentre esta gama de opções, não existe um produto que apresente todas as características desejadas, cada um possui vantagens e desvantagens que devem ser avaliadas no momento da seleção para o uso (BRASIL , 1994BRASIL. Ministério da Saúde, Coordenação de Controle de Infecção Hospitalar. Processamento de Artigos e Superfícies em Estabelecimentos de Saúde. 2.ed, Brasília, 1994, 50p.; MCDONNEL; RUSSEL, 1999MCDONNELL, G.; R USSEL, A.D. Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action, and Resistance. Clinical Microbiology Review, v.12, n.1, p.147-179, 1999.).

A ação de desinfetantes e anti-sépticos tem sido testada contra bactérias e leveduras, no entanto poucos estudos foram encontrados na literatura consultada (PubMed; Portal CAPES) confrontando estes agentes com fungos filamentosos. Visto que os fungos filamentosos em geral são mais resistentes que leveduras e bactérias não esporuladas, testes realizados com estes microrganismos unicelulares não servem de parâmetro ou indício para sua utilização contra fungos chamados “bolores” de importância médica e veterinária, como Aspergillus spp. (TERLECKYJ; AXLE R, 1987TERLECKYJ B.; AXLER, D.A. Quantitative Neutralization Assay of Fungicidal Activity of Disinfectants. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.31, n.5, p.794-798, 1987.; BRASIL, 1994BRASIL. Ministério da Saúde, Coordenação de Controle de Infecção Hospitalar. Processamento de Artigos e Superfícies em Estabelecimentos de Saúde. 2.ed, Brasília, 1994, 50p.; MCDONNEL; RUSSEL, 1999MCDONNELL, G.; R USSEL, A.D. Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action, and Resistance. Clinical Microbiology Review, v.12, n.1, p.147-179, 1999.). Assim, este estudo objetivou testar a eficácia “in vitro” de três agentes químicos de baixa toxicidade contra diferentes espécies de fungos do gênero Aspergillus.

A atividade dos desinfetantes e anti-sépticos, iodóforo, cloreto de benzalcônio (amônia quaternária) e digluconato de clorexidina, foi testada frente a 23 amostras de Aspergillus spp. isoladas do ambiente e de casos clínicos, sendo 8 A. fumigatus, 8 A. niger, 6 A. flavus, e 1 A. terreus.

A técnica de microdiluição em caldo utilizada para testes “in vitro” de antifúngicos foi realizada de acordo com NCCLS M-38NCCLS-M38A. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi. Approved Standard. NCCLS document M38-A. 2002. Wayne, PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2002., porém com adaptação para agentes químicos. Foram utilizadas 12 placas de microdiluição (96 orifícios) estéreis, as quais foram preenchidas com o inóculo fúngico e com os desinfetantes/anti-sépticos previamente diluídos e ajustados em meio RPMI líquido. Todas as amostras de Aspergillus spp. foram testadas em duplicata frente aos três desinfetantes/anti-sépticos.

Para preparação dos inóculos fúngicos as amostras foram previamente semeadas em placa de Petri contendo ágar batata dextrose (Potato Dextrose Agar – PDA) e incubadas a 35º C por 7 dias, obtendo-se culturas jovens e puras. Após o crescimento fúngico foi adicionado às culturas, 1 mL de salina estéril com 1% de Tween 20, e em seguida os conídios e hifas foram coletados da superfície da colônia com auxílio de pipeta estéril e transferidos para um tubo de ensaio estéril. Decorrido o tempo de sedimentação de 5min, o sobrenadante foi transferido para outro tubo de ensaio estéril, e então homogeneizado em agitador de tubos vortex por 15 segundos, e sua concentração final foi ajustada a 5 x 104 UFC/mL. Esta suspensão foi diluída a 1:50 em caldo RPMI, alcançando duas vezes a concentração necessária, para ser adicionada a cada orifício da microplaca em volume igual ao do agente químico, conforme o protocolo padrão. Para confirmação da concentração do inóculo foi realizada a técnica de Pour-plate em ágar Sabouraud dextrose, e contagem das Unidades Formadoras de Colônia (UFC).

Foram preparadas seis diluições sucessivas dos 3 agentes químicos em log2, utilizando-se caldo RPMI como diluente, os quais foram identificados como: IF (iodóforo), CB (cloreto de benzalcônio) e DC (digluconato de clorexidina). As concentrações finais dos desinfetantes IF e CB referiram-se a 8, 4, 2, 1, 0,5 e 0,25 vezes a concentração de uso recomendada pelo fabricante do produto, e do desinfetante DC variaram de 2 a 0,05 vezes a concentração de uso indicada.

A primeira coluna das microplacas (coluna A) foi utilizada como controle de crescimento sendo preenchida com 200 µL do inóculo, e a última coluna (coluna H) correspondeu ao controle de esterilidade onde os orifícios foram preenchidos com 200 µL da maior diluição do desinfetante. As demais colunas (colunas de B a G) foram preenchidas com 100 µL do inóculo e 100 µL da diluição do agente químico em seqüência, da maior para menor diluição do produto.

As microplacas foram incubadas em uma estufa “shaker” regulada a uma temperatura de 35º C e constante agitação (40 ciclos/min), e a leitura visual dos resultados foi realizada após 96h, sendo a Concentração Inibitória Mínima (CIM) determinada pela maior diluição do agente químico capaz de inibir o crescimento fúngico.

Das 23 amostras de Aspergillus spp., os 8 isolados de A. niger e os 6 de A. flavus foram sensíveis ao DC e CB, e resistentes ao IF. O A. terreus foi sensível ao CB e resistente ao IF e DC, e os 8 isolados de A. fumigatus foram sensíveis ao DC e resistentes ao IF, sendo que destes, 7 foram sensíveis ao CB. Os resultados estão descritos na Tabela 1.

Tabela 1
Resultados do teste de suscetibilidade “in vitro” de diferentes espécies de Aspergillus a três desinfetantes/ anti-sépticos comerciais.

Todos os isolados de Aspergillus spp. foram resistentes ao iodóforo nas diluições testadas (Fig. 1). O cloreto de benzalcônio mostrou atividade “in vitro” no controle das quatro espécies de Aspergillus, com exceção de uma amostra de A. fumigatus, que apresentou resistência a este agente químico mesmo em uma concentração duas vezes a recomendada. O digluconato de clorexidina apresentou eficácia frente a todos os isolados de A. fumigatus, A. niger e A. flavus, no entanto, a amostra de A. terreus foi considerada resistente a todas as diluições testadas.

Fig. 1
Resultado do teste de microdiluição em caldo demonstrando isolados de A. niger resistentes a todas as concentrações do iodóforo (linhas 3, 4, 9 e 10), e sensíveis a todas as concentrações de amônia quaternária (linhas 1, 2, 7 e 8) e digluconato de clorexidina (linhas 5, 6, 11 e 12).

Não foram detectadas diferenças na sensibilidade em relação à origem dos isolados, caso clínico ou ambiente, porém, o número de isolados de casos clínicos correspondeu a apenas 17% das amostras.

A toxicidade é um dos principais fatores a ser levado em consideração no momento da escolha de um agente químico para uso na presença de humanos e/ou animais. Isto se deve ao fato de que o processo de desinfecção pode acarretar desde irritação de mucosas e pele, até intoxicações, e com isso embora diminua a concentração de microrganismos, aumenta a predisposição do indivíduo à enfermidades (BRASIL, 1994BRASIL. Ministério da Saúde, Coordenação de Controle de Infecção Hospitalar. Processamento de Artigos e Superfícies em Estabelecimentos de Saúde. 2.ed, Brasília, 1994, 50p.; MCDONNEL; RUSSEL, 1999MCDONNELL, G.; R USSEL, A.D. Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action, and Resistance. Clinical Microbiology Review, v.12, n.1, p.147-179, 1999.). Contudo, foram selecionados para o teste “in vitro” digluconato de clorexidina, cloreto de benzalcônio e iodóforo, que apresentam baixa toxicidade.

NELLY; ORLOFF (2001)NELLY, A.N.; ORLOFF, M.M. Survival of Some Medically Important Fungi on Hospital Fabrics and Plastics. Journal of Clinical Microbiology, v.39, n.9, p.3360-3361, 2001. realizaram um estudo sobre a sobrevivência de microrganismos em materiais hospitalares e encontraram uma maior sobrevida de cepas de Aspergillus spp. isoladas de casos clínicos que isoladas de ambientes, o que não foi observado neste trabalho em relação à resistência dos isolados aos diferentes agentes químicos.

A resistência de A. fumigatus e A. niger encontrada frente ao iodóforo já foi descrita previamente por TERLECKYJ; AXLER (1987)TERLECKYJ B.; AXLER, D.A. Quantitative Neutralization Assay of Fungicidal Activity of Disinfectants. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.31, n.5, p.794-798, 1987., no experimento sobre a atividade de diferentes agentes químicos contra diversos gêneros e espécies fúngicas. Os autores obtiveram resultados diferentes dos descritos neste trabalho, em relação à ação da amônia quaternária que se apresentou ineficaz na inibição do crescimento de ambas as espécies.

A atividade da amônia quaternária e do digluconato de clorexidina “in vitro” em diluições 4 vezes e 16 vezes maiores que a recomendada, respectivamente, sugere a ação efetiva destes produtos no ambiente, os quais devem ser utilizados em concentrações maiores que a CIM “in vitro” por sofrerem influência dos fatores externos, como temperatura, pH e presença de matéria orgânica (BRASIL, 1994BRASIL. Ministério da Saúde, Coordenação de Controle de Infecção Hospitalar. Processamento de Artigos e Superfícies em Estabelecimentos de Saúde. 2.ed, Brasília, 1994, 50p.; MCDONNEL; RUSSEL, 1999MCDONNELL, G.; R USSEL, A.D. Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action, and Resistance. Clinical Microbiology Review, v.12, n.1, p.147-179, 1999.).

Segundo MCDONNELL; RUSSELL (1999)MCDONNELL, G.; R USSEL, A.D. Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action, and Resistance. Clinical Microbiology Review, v.12, n.1, p.147-179, 1999., o A. niger é sensível à concentração de 200µg/ml de clorexidina e 100-200 µg/mL de cloreto de benzalcônio. Os resultados do presente estudo estão de acordo com os autores em relação à amônia quaternária, porém demonstram que 40 µg/mL de digluconato de clorexidina podem inibir o crescimento deste microrganismo.

A resistência do A. terreus à clorexidina, deve ser considerada com cautela, visto que somente foi utilizado um isolado desta espécie, podendo a resistência ser um fator intrínseco e individual do isolado testado (MCDONNEL; RUSSEL, 1999; NELLY; ORLOFF, 2001NELLY, A.N.; ORLOFF, M.M. Survival of Some Medically Important Fungi on Hospital Fabrics and Plastics. Journal of Clinical Microbiology, v.39, n.9, p.3360-3361, 2001.). No entanto, é sabido que a maioria dos isolados de A. terreus são resistentes à Anfotericina B (STEINBACH et al., 2004STEINBACH, W.J.; PERFECT, J.R.; SCHELL, W.A.; WALSH, T.J.; BENJAMIN JUNIOR, D.K. In Vitro analyses, animal models, and 60 clinical cases of invasive Aspergillus terreus infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.48, n.9, p.3217-3225, 2004.), o que geralmente não ocorre com as outras espécies de Aspergillus associadas a quadros clínicos. Este dado é importante à medida que a sensibilidade fúngica à Anfotericina B está relacionada com as glucanas da parede celular, as quais também desempenham um papel importante na suscetibilidade do microrganismo à clorexidina (MCDONNEL; RUSSEL, 1999MCDONNELL, G.; R USSEL, A.D. Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action, and Resistance. Clinical Microbiology Review, v.12, n.1, p.147-179, 1999.).

Não foram encontrados na literatura consultada estudos “in vitro” de agentes químicos desinfetantes e anti-sépticos frente a isolados de A. flavus, no entanto esta espécie não apresentou característica peculiar em relação às outras três espécies testadas em nosso estudo.

Como a atividade antimicrobiana dos desinfetantes depende de vários fatores, como temperatura, pH, diluição, presença de matéria-orgânica, entre outros, os testes “in vitro” não determinam necessariamente a real capacidade de desinfecção de um ambiente, porém resultados favoráveis e desfavoráveis nestes testes devem ser levados em consideração, sendo um indício da atividade destes produtos contra microrganismos específicos (TIMENETSKY, 1990TIMENETSKY, J. Avaliação microbiológica de desinfetantes químicos de uso doméstico. Revista de Saúde Pública, v.24, n.1, p.47-50, 1990.).

Os resultados obtidos após a condução deste experimento permitem concluir que a amônia quaternária e o digluconato de clorexidina foram eficazes contra as diferentes espécies de Aspergillus. Em contrapartida, a ineficácia “in vitro” do iodóforo neste estudo torna questionável seu uso em superfícies e tecidos vivos para controle de fungos do gênero Aspergillus.

  • *
    Parte integrante da dissertação de mestrado do primeiro autor.

REFERÊNCIAS

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    10 Jan 2022
  • Data do Fascículo
    Jan-Mar 2007

Histórico

  • Recebido
    18 Abr 2006
  • Aceito
    01 Fev 2007
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