DETECÇÃO DE GENES DE RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA EM CROMOSSOMOS E PLASMÍDEOS DE STAPHYLOCOCCUS SPP.

DETECTION OF ANTIMICROBIAL RESISTANCE GENES ON THE CHROMOSOME AND PLASMIDS FROM STAPHYLOCOCCUS SPP

RESUMO

Este trabalho teve por objetivo analisar o uso da prensa francesa para se adquirir material genético de estafilococos e detectar possíveis genes de resistência cromossomais e plasmidiais aos antimicrobianos oxacilina, gentamicina, canamicina e vancomicina. O método da difusão de discos em ágar foi realizado, inicialmente, para 50 linhagens de estafilococos e a susceptibilidade antimicrobiana foi confirmada por meio de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Os resultados obtidos pelo antibiograma constataram alta susceptibilidade para gentamicina e canamicina (4%) e oxacilina (8%). Todas as linhagens foram susceptíveis à vancomicina. O DNA bacteriano foi obtido por lise física a partir da prensa francesa. Os genes mecA e aph3’IIIa foram detectados no cromossomo dos estafilococos e o gene aac(6’) Ie + aph (2") foi observado tanto no cromossomo como no plasmidio destas bactérias. Pelos resultados pode-se concluir que a metodologia utilizada para a extração de DNA genômico, por meio da prensa francesa, foi barata e eficiente, pois possibilitou a detecção por PCR e a localização, por ultracentrifugação, de genes de resistência em estafilococos.

PALAVRAS-CHAVE
Rebanhos leiteiros; aminoglicosídeos; mecA; PCR; ultracentrifugação

ABSTRACT

The main of the present study was analyze the use of a french press device to obtain genetic material from staphylococci and to detect genes involved with chromosomal and plasmid resistance to the following antimicrobial drugs: oxacillin, gentamicin, kanamycin and vancomycin. The agar disc diffusion method was conducted initially for 50 strains and the bacterial susceptibility was confirmed by means of PCR reactions. The results from the antibiogram method revealed high sensibility to gentamicin and kanamycin (4%) and oxacillin (8%). All strains were susceptible to vancomycin. The DNA from the bacteria was obtained by means of physical lyses using a french press device. The genes mecA and aph’3 – IIIa were detected on the staphylococci chromosome and the gene aac(6’)Ie + aph(2’’) was observed either in the chromosome and in the plasmid content of the staphylococci analyzed. Based on the obtained results one can conclude that the methodology used to extract the genomic genetic material using the french press device was efficient and allowed a simple method to detect by PCR and to locate by ultracentrifugation, the staphylococci antibiotic resistance genes.

KEY WORDS
Dairy cattle; aminoglycosides; mecA; PCR; ultracentrifugation

INTRODUÇÃO

Os estafilococos são microrganismos encontrados na pele e nas mucosas dos seres humanos e de outros mamíferos. São bactérias patogênicas que podem causar infecções cutâneas, infecções oportunistas e até mesmo septicemias fatais (MURRAY et al., 1998). São considerados importantes causadores de mastite em rebanhos leiteiros visto que apresentam vários fatores de virulência que contribuem para sua persistência no tecido mamário (SANTOS et al., 2003). Nos últimos anos, algumas espécies coagulase negativas e, em especial os Staphylococcus aureus, têm merecido atenção especial devido à emergência de linhagens resistentes a múltiplos antibióticos (MANIATIS et al., 1997).

Os dois principais fatores envolvidos no desenvolvimento da resistência aos antibióticos em bactérias são a pressão seletiva e a presença de genes de resistência (WITTE, 2000). Os genes que codificam resistência aos antimicrobianos podem estar localizados no cromossomo ou nos plasmídios. O DNA cromossômico é relativamente mais estável, enquanto que o DNA plasmidial é facilmente transportado de uma linhagem para outra por conjugação bacteriana, permitindo uma transferência de genes em conjunto incluindo os de resistência a antimicrobianos (KONEMAN et al., 1997).

O principal mecanismo de resistência aos aminoglicosídeos em estafilococos é a inativação das drogas por enzimas celulares modificadoras dos aminoglicosídeos. Diversos loci distintos que codificam tais enzimas modificadoras foram caracterizados em estafilococos. Clinicamente, o mais importante destas regiões codifica atividades para as enzimas acetiltransferase (AAC), adenililtransferase (ANT) e fosfotransferase (APH). Os aminoglicosídeos,modificados em grupos aminos pela enzima AAC ou em grupos hidroxilas pela enzima ANT ou APH, perdem a habilidade de se ligar aos ribossomos e assim não inibem mais a síntese protéica das células bacterianas (PAULSEN et al., 1997).

A resistência para a gentamicina em estafilococos é mediada pela atividade de uma enzima bifuncional que tem atividade AAC (6’) e APH (2"). Os genes aac (6’)-Ie + aph (2") que codificam para esta enzima bifuncional são transportados no transposon Tn4001. Elementos semelhantes ao Tn4001 estão amplamente distribuídos entre S. aureus e estafilococos coagulase negativos (ECN). O Tn4001 foi encontrado na família de plasmídios pSK1, plasmídios conjugativos como o pSK23 e em outros locais do cromossomo (PAULSEN et al., 1997).

A resistência para a canamicina em estafilococos é detectada pela presença da enzima ANT (4’)-I codificada pelo gene ant (4’)-Ia. Este gene muitas vezes é carregado em plasmídios pequenos e outras vezes pode estar integrado a plasmídios conjugativos maiores como o pSK41 e, subseqüentemente, na região mec do cromossomo de alguns isolados de S. aureus (PAULSEN et al., 1997). A resistência à neomicina e canamicina conferidas pela enzima APH(3’)-IIIa também já foi descrita em estafilococos. O gene aph3’-IIIa responsável por este fenótipo é transportado pelo transposon Tn5405 o qual pode estar localizado tanto no cromossomo como em plasmídios (DERBISE et al., 1996).

A resistência à oxacilina é fenotipicamente associada com a presença de uma proteína fixadora de penicilina (PBP 2a), ausente nos estafilococos susceptíveis. Esta proteína tem baixa afinidade de ligação para antibióticosβ-lactâmicos. Trata-se de uma transpeptidase que pode assumir a síntese da parede celular bacteriana durante o tratamento com o antibiótico, quando normalmente PBPs são inativadas pela ligação com os anéis de compostos β-lactâmicos (BRAKSTAD; MAELAND, 1997). A PBP 2a é codificada pelo gene mecA que juntamente com dois genes regulatórios, o mecI e o mecRI, constituem o complexo cromossômico mec estafilocócico (SCCmec), imprescindível na determinação da resistência à meticilina nos S. aureus (BERGER-BÄCHI; ROHRER, 2002). Esta resistência aparece em mais de 90% dos isolados clínicos de S. aureus meticilina resistentes (MRSA) (HIRAMATSU, 1995).

A amplificação de DNA a partir de “primers” específicos é muito útil para se estabelecer o perfil de resistência das linhagens mediante o uso de diversos antimicrobianos. A detecção de genes de resistência em microrganismos isolados de amostras clínicas permite orientar a terapia e estabelece um prognóstico após sucessivas culturas positivas. Os testes genéticos podem ser usados como referência para avaliar novas técnicas que determinam a referida resistência (TENOVER et al., 1995).

Os estafilococos apresentam uma espessa parede celular composta principalmente por glicopeptídios, ácido teicoicos e proteína A (CARTER, 1989) que dificultam sua lise. Neste trabalho foi desenvolvida uma metodologia utilizando a “french pressure cell press” para a lise das paredes celulares de Staphylococcus spp. e posterior detecção por PCR de possíveis genes de resistência para oxacilina, gentamicina, canamicina e vancomicina, localizados em cromossomos e em plasmídios.

MATERIAL E MÉTODOS

Coleta das amostras. As amostras clínicas de Staphylococcus spp. foram obtidas da pele dos tetos de vacas mestiças lactantes aparentemente sadias, provenientes de algumas propriedades dos Municípios de Monte Alto, Jaboticabal e Sertãozinho, onde a ordenha realizada era manual. Foram coletadas e isoladas 50 amostras de estafilococos sendo seis delas de maior interesse neste estudo.

Identificação presuntiva do gênero estafilococos. Após a análise microscópica por coloração de Gram, foram realizadas provas bioquímicas como lecitinase (ITO et al., 1969), catalase (BIER, 1966), coagulase (SPERBER; TATINI, 1975), fermentação do manitol, oxidação e fermentação da glicose (OF), oxidação em açúcares (D-manose, D-glicose e D-trealose) e produção de acetoína a partir de glicose (MACFADDIN, 1976).

Realização de Antibiogramas. Os antibiogramas foram feitos para verificação da susceptibilidade aos antimicrobianos oxacilina, canamicina, gentamicina e vancomicina. Foi utilizada uma amostra de S.aureus da American Type Culture Collection (ATCC n. 29213) recomendada como controle de qualidade para testes de susceptibilidade. A metodologia foi feita de acordo com BAUER et al. (1966) e os procedimentos destinados à padronização da técnica foram baseados nas normas propostas pelo National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2003).

Extração do DNA genômico usando Prensa Francesa. O equipamento utilizado no desenvolvimento desta metodologia foi a “French Pressure Cell Press” (SLM AMINCO, SLM Instruments, Inc). Preparou-se um pré-cultivo bacteriano em 50 mL de meio BHI (Brain Heart Infusion Broth) com incubação a 37º C, por 12h. A seguir este foi adicionado a um volume de 1 L do mesmo meio de cultura para a realização do cultivo final, nas condições anteriores. Após centrifugação a 956 x g, o precipitado obtido foi lavado em 20 mL de uma solução tampão contendo Tris-HCl (50mM), EDTA (1mM) e sacarose a 25%. A prensa francesa permitiu a quebra física da parede bacteriana sob dupla exposição da amostra à pressão de 16.000 psi. Os procedimentos seguintes foram realizados de acordo com a metodologia de HOOKEY et al. (1999), ressaltando-se que todos os volumes dos reagentes foram vinte vezes maiores, considerando a quantidade da solução tampão Tris-HCl inicialmente utilizada. Para a visualização do DNA, foi preparado gel de agarose 0,8% em tampão TEB 1X (89 mM de Tris; 89 mM de ácido bórico e 2,5 mM de EDTA, pH 8.2), processado a 75 V, por 1h. O material genético foi visualizado por um fotodocumentador modelo GEL DOC 2000 (Bio-Rad).

Após o término da extração do DNA genômico, foi feita a separação do DNA plasmidial do DNA cromossômico, seguindo a metodologia proposta por SAMBROOK et al. (1989). Foi preparada uma solução de DNA na concentração de 1.600 ng/mL de tampão TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0), adicionada de 2 g de cloreto de césio. Os plasmídios foram obtidos por ultracentrifugação a 432.800 x g em uma ultracentrífuga Beckman modelo TL100 utilizando-se um rotor TL10 3.1, por um período de 20h a 20° C.

Síntese de oligonucleotídeos iniciadores. A amplificação dos fragmentos de DNA foi feita utilizando-se os seguintes pares de oligonucleotídeos sintéticos: “primer” mecA 1282 (5’AAAATCGATGGTAAAG GGTTGGC 3’) e “primer” mecA 1793 (5"AGTTCTGCA GTACCGGATTTGC 3’), podendo produzir um fragmento de 533 pb (MERLINO et al., 2002), “primer” aph(3’)-IIIa 329 (5’ CTGATCGAAAAATACCGCTGC 3’) e “primer” 597 (5’ TCATACTCTTCCGAGCAAAGG 3’), “primer”aac(6’)I e + aph(2") 2022 (5’ CCAAG AGCAATAAGGGCATACC) e “primer” 2369 (3’CACACTATCATAACCATCACCG), associados à produção de fragmentos de 268 pb e 247 pb, respectivamente (SHIMITZ et al., 1999).

Reação em Cadeia da Polimerase. As reações de PCR foram baseadas na metodologia de YOU et al. (2000). Para as reações de amplificação foram utilizados 30 ng de DNA; tampão de PCR 1x (KCl 50 mM, TRIS-HCl 200 mM, pH 8,4); 1,5 mM de MgCl₂; 0,2 mM de dNTP; 1µg de cada “primer”; 2,5 U de Taq DNA polimerase (GIBCO-BRL) e água Milli Q estéril para totalizar o volume da reação de 20 µL. A amplificação foi realizada por 2min a 94° C; 1min a 94° C; 2min a 52° C; 2min a 72° C; 39 ciclos a partir do passo 2; 5min a 72° C e manutenção das amostras sob refrigeração a 5° C. Todos os produtos amplificados foram analisados em gel de agarose 1,5%, corados com brometo de etídio e processados a 65 V, por 1h e 30min.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O desenvolvimento do antibiograma permitiu a detecção de uma alta susceptibilidade das cepas de estafilococos para os 4 antibióticos estudados. Foram feitos antibiogramas para as 50 linhagens de Staphylococcus spp. inicialmente analisadas e, deste total, 6 foram resistentes às drogas testadas. A resistência das bactérias aos aminoglicosídieos gentamicina e canamicina foi da ordem de 4% e, para a oxacilina, de 8%. Não foi observada resistência à vancomicina.

Tabela 1
Linhagens de estafilococos isoladas de bovinos e suas localidades.

No das linhagens	Espécie	Local de origem
1	S. chromogenes	Sertãozinho
2	S. aureus	Jaboticabal
3	S. aureus	Jaboticabal
4	S. aureus	Jaboticabal
5 (5C e 5P)*	S. chromogenes	Monte Alto
6 (6C e 6P)*	S. chromogenes	Monte Alto

• ^*
  Linhagens de estafilococos que apresentaram cromossomo e plasmídio. A letra C corresponde ao DNA cromossomal e a P, DNA plasmidial.

Fig. 1
Material genético obtido pela prensa francesa com posterior ultracentrifugação. MM: marcador de tamanho molecular 1kb Plus DNA Ladder; ATCC 29213; 1: Amostra de DNA cromossômico de S. chromogenes; 2: Amostra de DNA cromossômico de S.aureus;3: Amostrade DNAcromossômico de S. aureus; 4: Amostra de DNA cromossômico de S.aureus; 5C: Amostra de DNA cromossômico de S. chromogenes; 5P: Amostra de DNA plasmidial de S. chromogenes; 6C: Amostra de DNA cromossômico de S. chromogenes; 6P: Amostra de DNA plasmidial de S.chromogenes ; padrão cromossômico de E. coli.

RABELLO et al. (2005) estudaram isolados de S. aureus em vacas com mastite subclínica e encontraram alta susceptibilidade destas bactérias a diversos antibióticos testados, entre eles a oxacilina, canamicina, gentamicina e vancomicina. GÜLER et al. (2005) analisaram mais de duzentos isolados de S. aureus em vacas com mastite clínica e não detectaram nenhuma resistência para a oxacilina. PENGOV; CERU (2003) isolaram S. aureus de vacas com infecção intramamária e detectaram susceptibilidades de 100% à oxacilina e 93,5% à canamicina. GENTILINI et al. (2002) estudaram susceptibilidade à oxacilina em estafilococos coagulase negativos em isolados de vacas com mastite bovina encontrando baixa resistência a este antibiótico e total susceptibilidade à gentamicina. GUTA et al. (2002), analisando Staphylococcus spp. em rebanhos leiteiros, detectaram linhagens que apresentavam uma baixa resistência à gentamicina e 100% de susceptibilidade à vancomicina.

As seis linhagens presentes na Tabela 1 demonstraram resultados positivos para as provas da lecitinase e catalase. Já a prova de plasmacoagulase permitiu a identificação de três amostras coagulasepositivas (2, 3, 4) e outras três coagulase-negativas (1, 5, 6). Todas as amostras foram positivas para as provas de oxidação e fermentação da glicose e fermentação do manitol em anaerobiose. De acordo com SNEATH et al. (1986), as provas de coagulase, fermentação do manitol em anaerobiose e a prova da produção de acetoína a partir de glicose são definitivas para que as cepas sejam identificadas como S. aureus, já as provas da oxidação dos açúcares trealose, manose e maltose determinam linhagens de S. chromogenes.

Fig. 2
Produtos de amplificação do gene mecA, MM: marcador de tamanho molecular 1Kb Plus DNA Ladder. 6C: DNA cromossomal de S. chromogenes; 6P: DNA plasmidial de S. chromogenes; 4: DNA cromossomal de S. aureus; 3: DNA cromossomal de S. aureus; 1: DNA cromossomal de S. aureus; CN: controle negativo.

Fig. 3
Produtos de amplificação do gene aph (3’)-llla. MM: marcador de tamanho molecular 1Kb Plus DNA Ladder. 1: DNA cromossomal de S. chromogenes ; 2: DNA cromossomal de S. aureus; CN: controle negativo.

Fig. 4
Produtos de amplificação do geneaac(6’)-le+aph(2"), MM: marcador de tamanho molecular 1Kb Plus DNA Ladder. 6C: DNA cromossomal de S. chromogenes; 6P: DNA plasmidial de S. chromogenes; 5C: DNA cromossomal de S. chromogenes; 5P: DNA plasmidial de S. chromogenes; CN: controle negativo.

O fato dos estafilococos apresentarem uma espessa parede celular dificulta bastante sua lise. Embora existam kits de extração simples e rápidos como o InstaGene Matrix (Bio-Rad Laboratories) e metodologias que utilizam apenas a fervura em água (MEDICI, et al., 2003) para a lise celular, a quantidade de DNA obtida é pequena, limitando sua utilização. Outra alternativa para se extrair o material genético é a utilização da lisostafina, mas o alto custo desta enzima pode ser considerado limitante. Assim, a metodologia de extração de DNA, com o auxílio da prensa francesa, foi desenvolvida devido à necessidade de se conseguir uma alta concentração de DNA genômico necessária ao bandeamento do cromossomo e plasmídio, no processo da ultracentrifugação. A prensa francesa permitiu a obtenção de DNA plasmidial de boa qualidade e uma grande quantidade de DNA genômico apresentando alguma degradação, mas com condições suficientes para se detectar a presença de genes de resistência nas bactérias. A Figura 1 apresenta o material genético obtido pelo auxílio da prensa francesa com posterior ultracentrifugação e separação em DNA cromossômico (1, 2, 3, 4, 5) e plasmidial (5P e 6P). O uso da prensa francesa para a lise da parede celular dos estafilococos também foi utilizada por KIM et al. (1979), em estudo envolvendo fatores associados com a liberação de penicilinase em S. aureus, porém sendo utilizada a lisostafina.

O gene mecA foi detectado nos cromossomos das linhagens 1, 3, 4 e 6, provenientes dos Municípios de Sertãozinho, Jaboticabal e Monte Alto respectivamente (Tabela 1), como pode ser observado nos produtos de amplificação referentes à Figura 2. Este resultado era esperado visto que este gene é um dos constituintes do complexo cromossômico mec estafilocócico (SCCmec) (BERGER-BÄCHI; ROHRER, 2002). Alguns pesquisadores como LEE et al. (2004), ZADOKS et al. (2000) eKASZANYITZKY et al. (2004) relatam que Staphylococcus spp. meticilina resistentes isolados de vacas com mastite acarretam sérios problemas em medicina veterinária, sendo também, segundo LEE (2003), potencialmente problemático para humanos.

As linhagens 1 e 6 apresentaram dois genes de resistência simultaneamente. Os genes mecA e aph(3’) IIIa foram verificados nos cromossomos da linhagem 1 e a linhagem 6 apresentou os genes mecA e aac (6’) I e + aph (2"), presentes no cromossomo e plasmídio respectivamente. Os estafilococos que apresentam resistência ameticilina (oxacilina) são, freqüentemente, resistentes a alguns agentes antimicrobianos mais comuns como os aminoglicosídeos, macrolideos, cloranfenicol, tetraciclina e fluoroquinolonas (MANDELL et al., 1995), constituíndo cepas de maiores riscos para o homem e animais em casos de infecções estafilocócicas.

O gene aph(3’) IIIa foi detectado no cromossomo das linhagens 1 e 2 (Fig. 3), obtidas nas propriedades de Sertãozinho e Jaboticabal (Tabela 1). Um estudo de análise genética da susceptibilidade a diversos antimicrobianos, em linhagens de S. aureus isolados de um hospital em Lisboa, mostrou que os aminoglicosídeos gentamicina e canamicina apresentaram resistências cromossomais (CRISTINO; PEREIRA, 1989). Outro estudo efetuado com MRSA, isolados de um hospital no Kuwait também demonstraram resistência cromossômica para os referidos aminoglicosideos (UDO; JACOB, 2000).

A linhagem 6 apresentou amplificação correspondente ao gene aac (6’) Ie + aph (2") no cromossomo e no plasmídio, já a linhagem 5 amplificou a região correspondente ao referido gene somente no plasmídio, como pode ser observado na Figura 4. Estas linhagens foram obtidas do mesmo rebanho bovino, localizado no Município de Monte Alto (Tabela 1). SEKIGUCHI et al. (2003) trabalharam com isolados clínicos de S. aureus meticilina resistentes (MRSA) e demonstraram que a maioria deles tinha gene aac (6’) Ie + aph (2") tanto no plasmídio como no cromossomo destas bactérias e, além disso, alguns isolados apresentaram este gene apenas no plasmídio e outras somente no cromossomo bacteriano.

A detecção destes genes de resistência em propriedades leiteiras de Sertãozinho, Jaboticabal e Monte Alto constitui um fator relevante, pois, de acordo com WHITE; MCDERMOTT (2001), as bactérias que desenvolvem resistência aos antimicrobianos podem interferir nos tratamentos mais efetivos diminuindo o controle de diversas doenças infecciosas e prejudicando humanos e animais. Segundo MCDERMOTT et al. (2002), a emergência e disseminação da resistência aos antimicrobianos resultam da interação entre os microrganismos, antibióticos e o ambiente que os rodeiam. Além disso, a resistência aos antimicrobianos pode ser adquirida espontaneamente por mutações genéticas e transferidas por seleção vertical às células filhas. Mais comumente, a resistência é adquirida por transferência horizontal de elementos móveis do DNA de uma célula doadora para outras bactérias(SEFTON, 2002).

CONCLUSÃO

Os resultados obtidos com a“french pressure cell press” permitem concluir que a metodologia foi eficaz, pois proporcionou um material genômico íntegro e em condições de ser analisado geneticamente, principalmente quanto à localização dos genes considerados neste estudo. Além disso, a detecção por PCR de linhagens contendo genes de resistência à oxacilina, gentamicina e canamicina nos tetos das vacas pode propiciar o aparecimento de problemas sérios como a mastite nos rebanhos leiteiros podendo, também, promover a contaminação do leite, tornando este produto uma importante fonte de infecção ao homem.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  10 Jan 2022
• Data do Fascículo
  Jul-Sep 2007

Histórico

• Recebido
  24 Out 2006
• Aceito
  21 Ago 2007