COMPORTAMENTO E ASPECTOS CITOLÓGICOS DE BEAUVERIA BASSSIANA APÓS PASSAGEM EM OVO, LARVA E ADULTO DE CHRYSOMYA ALBICEPS

BEHAVIOR AND CYTOLOGICAL ASPECTS OF BEAUVERIA BASSIANA AFTER PASSAGE IN THE EGG, LARVAE AND ADULT PHASE OF CHRYSOMYA ALBICEPS

RESUMO

O objetivo desta pesquisa foi avaliar o comportamento do fungo Beauveria bassiana Balsamo Vuillemin reisolado de diferentes fases de desenvolvimento de Chrysomya albiceps. O fungo B. bassiana foi originalmente isolado de Castnia licus Drury (Lepidoptera: Castniidae), e está depositado na Coleção de Cultura (Micoteca-URM) do Departamento de Micologia da Universidade Federal de Pernambuco, sob o número de acesso 3.447. O experimento foi realizado em condições artificiais sob umidade e temperatura 60 ± 10% e 27 ± 1^o C, respectivamente. O percentual de germinação foi elevado, com o maior índice observado no reisolado de larva; o crescimento radial no intervalo de tempo estipulado foi satisfatório, o número de conídios no 12^o dia do reisolado de adulto foi maior do que o reisolado de ovo. O número de colônias de todos os reisolados foi superior ao controle. Não foram observadas diferenças nos aspectos citológicos do ciclo de vida de B. bassiana pós-passagem em ovos, larvas e adultos.

PALAVRAS-CHAVE
Beauveria bassiana ; Chrysomya albiceps ; citologia; germinação

ABSTRACT

The objective this research was to evaluate the behavior of Beuveria bassiana Balsamo Vuillemin fungus reisolated from different phases of development of Chrysomya albiceps. The fungus B. bassiana was isolated originally from Castnia licus Drury (Lepidoptera: Castniidae), and kept at the Culture Collection (Micoteca-URM) of the Department of Mycology of the Universidade Federal de Pernambuco, under the access number 3,447. The experiment was carried out under artificial conditions at 60 ± 10% relative humidity and 27 ± 1^o C. The percentile of germination was elevated, with the largest index observed in the reisolate from the larval phase; the radial growth in the interval of stipulated time was satisfactory, the conidia number on the 12th day for the reisolate from the adult phase was larger than that for the reisolate from the egg phase. The number of colonies of all the reisolates was higher than that of the control. Differences were not observed in the cytological aspects of the life cycle of B. bassiana after passage in eggs, larvae and adults.

KEY WORDS
Beauveria bassiana ; Chrysomya albiceps ; cytology; germination

INTRODUÇÃO

Chrysomya albiceps Wiedemann (Diptera: Calliphoridae) é muito importante do ponto de vista sócio-econômico, nos países tropicais, por causarem miíases. Já foi relatada em ovinos, caprinos (ZUMPT, 1965; GAGNÉ, 1981; ERZINÇLIOGLU; WHITCOMBE, 1983), caninos (RICHARD; GERRISH, 1983), bovinos (LEITE et al., 1983) e humanos (ABED-BENAMARA et al. 1996). O homem, na tentativa de controlar os insetos, como a mosca, tem usado inseticida, principalmente contra os adultos (LIU; YUE, 2000), entretanto, há sérios problemas de intoxicação nas pessoas que aplicam esses produtos, desequilíbrios biológicos e emergência de resistência às pragas-alvo. O controle biológico surgiu como uma alternativa e, neste particular, os fungos se destacam como os principais agentes no controle de insetos, inclusive de moscas (Musca domestica Linnaeus, Anastrepha ludens Loew, Haematobia irritans Linnaeus, C. albiceps Wiedemann) (BARSON et al., 1994; LECUONA, 1999; LEZAMA-GUTTIERREZet al., 2000; SERAFINI et al., 2001; FEIJÓ et al., 2002; LECUONA et al., 2005).

Beauveria bassiana Balsamo Vuillemin, um dos principais fungos entomopatogênicos, foi isolado pela primeira vez de Bombyx mori Linnaeus (bicho-daseda), causando a doença muscardine branca. B. bassiana é de ocorrência cosmopolita, coletada freqüentemente de insetos e amostras de solo, onde pode subsistir por longo tempo. Em condições de laboratório pode colonizar a maioria dos insetos, sendo que no campo ocorre de forma enzoótica e epizoótica em Coleoptera, Lepidoptera, Hemiptera e de forma enzóotica sobre Diptera, Hymenoptera e Orthoptera (ALVES, 1998; MELO, 2002).

Estudos do comportamento, tais como germinação, esporulação, número de colônias e crescimento radial (KUMAR et al., 1999; FERREIRA, 2000; GUIMARÃES, 2002; SANTOS, 2002; ALMEIDA et al., 2005) são realizados para auxiliar na caracterização de fungos entomopatogênicos, pois, segundo LIU et al. (2003), esses parâmetros são importantes para definir a virulência de um isolado fúngico. Além disso, estudos citológicos com B. bassiana também são realizados, envolvendo a variação na forma, dimensão e número de núcleos (SOUSA, 2002) como forma de caracterização de isolados fúngicos e diferença entre linhagens haplóides e diplóides (LUNA-ALVES LIMA, 1985).

A germinação é um fator importante, pois uma taxa elevada de conídios germinados é diretamente proporcional à virulência do isolado, mas pode ser influenciada pela forma de armazenamento, presença de nutrientes e modo de exposição do fungo ao hospedeiro (ALVES et al., 1995; ALVES, 1998; FERNANDEZ et al., 2001).

A rápida esporulação pode ser um importante critério para seleção de isolados fúngicos, pois auxilia na propagação de epizootias, além de ser uma vantagem em relação às defesas humorais de insetos (MITCHELL, 2003). Contudo, os fatores abióticos (como a temperatura e a umidade) podem alterar a esporulação (LUZ et al., 1998; ALVES, 1998; MAGALHÃES, 2000). O crescimento radial também é empregado para avaliar linhagens quanto à virulência, pois, de acordo com HAEJEK; ST LEGER (1994),,,,, a taxa de crescimento radial está diretamente associada à velocidade de infecção no hospedeiro. Mas também difere entre isolados de uma mesma espécie (FARGUES et al., 1997) e nem sempre a virulência pode estar associada diretamente à fisiologia (MACIEL et al., 2005).

A citologia de fungos é necessária para se conhecer e compreender os fenômenos de variabialidade genética, contudo, o aprimoramento de técnicas de coloração no nível óptico como também eletrônico renovaram conceitos, dando maior significado ao estudo e conhecimento celular de estruturas vegetativas e reprodutivas. LUNA-ALVES LIMA (1989) observou em B. brongniartii Saccardo a presença de células coniodiogênicas uni e binucleadas e conídios elipsóides, diferindo dos conídios de B. bassiana que se apresentam globosos. Já células leveduriformes multinucleadas de B. bassiana foram observadas na hemolinfa de Spodoptera frugiperda J. E. Smith (LUNA-ALVES LIMA; TIGANO, 1989) e os segmentos hifais apresentaram-se uninucleados e raramente binucleados, quando (LUNA-ALVES LIMA, 1989) em B. bassiana. PAIVA et al. (1996), em estudos de microscopia de luz e eletrônica, cofirmaram em B. bassiana a condição uninucleada dos conídios, hifas e células conidiogênicas de terminação simpodial.

O estudo dos parâmetros fisiológicos de linhagens, como taxa de germinação, crescimento radial, número de colônias, esporulação, torna-se necessário para se caracterizar e selecionar linhagens que apresentem vantagens como alta produção massal de micélio e estabilidade de inóculo, pois assim a infecção no hospedeiro ocorre de forma mais rápida, justificando a eficácia no campo, potencializando a ação do controle biológico de insetos-praga. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi analisar o comportamento de B. bassiana, no que se refere à germinação, esporulação, número de colônias, diâmetro de colônias e o aspecto citológico pós-passagem em C. albiceps.

MATERIAL E MÉTODOS

Crescimento radial: um disco de 5 mm de diâmetro da colônia de B. bassiana foi colocado no centro de uma placa de Petri com BDA (Batata-Dextrose-Ágar) (Oxoid). O crescimento foi observado no período: 0-3, 3-6, 6-9, 9-12 e 12-15 dias. A mensuração foi feita em centímetro, com o auxílio de uma régua milimetrada, e em seguida foi calculada a média aritmética para cada dia avaliado.

Determinação do número de colônias e percentual de germinação: a partir de cultura de 12 dias de crescimento em BDA, foi retirado um disco de 5 mm de diâmetro e transferido para tubos de ensaio contendo 10mL de “Tween” 80 (0,05% v/v). A suspensão foi agitada para desagregação dos conídios. O número de conídios foi determinado em câmara de Neübauer. A suspensão foi diluída, de maneira a atingir 100 conídios.mL^-1. Desta suspensão, foi espalhado 0,1 mL com o auxílio da alça de “Drigalsky”, por toda superfície das placas de Petri. O experimento foi realizado em triplicata para cada dia de observação. O número de colônias foi determinado nos dias pré-estabelecidos: 3, 6, 9, 12 e 15 dias, após a inoculação.

O percentual de germinação foi estabelecido após 16 horas pós-inoculação. Foram contados 500 conídios por placa após a semeadura, considerando-se, como conídio germinado aquele cujo tubo germinativo se apresentou maior que um terço do tamanho do conídio observado (LUNA-ALVES LIMA, 1985).

Determinação do percentual de esporulação: da cultura fúngica crescida em BDA, foram retirados discos de 5mm de diâmetro e inoculados no centro da placa. Aos 12 dias foram adicionadas às placas 5mL de solução de etanol a 75%, para inativar e secar os conídios. Posteriormente, as placas foram lavadas em “Tween” 80 (0,05% v/v). O lavado foi coletado em frasco “Erlenmeyer” e agitado para promover a desagregação dos conídios. Em seguida, o número de conídios foi determinado em câmara de Neübauer.

Análise microscópica das estruturas fúngicas: uma alíquota da cultura fúngica foi colocada assepticamente em quatro pontos eqüidistantes da placa de Petri (LUNA-ALVES LIMA, 1985). Em seguida, foram cobertas com lamínula, previamente flamblada. As placas foram deixadas à temperatura ambiente e as culturas em lamínula foram analisadas após 24, 48, 72, 96, 120h. As estruturas fúngicas crescidas sob a lamínula eram coradas pelo Lactofenol de Amann com azul de algodão e observadas ao microscópio óptico com aumento de 4, 10, 40 e 100, 640 e 1000x.

Condição nuclear de Beauveria bassiana antes e após passagem em ovo, larva e adulto de Chrysomya albiceps: a condição nuclear de B bassiana foi verificada com o emprego da técnica de coloração Giemsa-HCl (LUNA-ALVES LIMA; AZEVEDO, 1983).

Análise estatística: Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias foram comparadas através do teste Tukey, em nível de 5% de significância.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Beauveria bassiana reisolada de ovos, larvas e adultos de Chrysomya albiceps pós-infecção experimental

A média do percentual de germinação do fungo foi menor no reisolado de adulto (79,53%) e maior no reisolado de larva (88,45%), sem diferença estatística entre os fungos reisolados de ovo, larva e adulto em relação ao controle (Tabela 1). Os resultados foram superiores aos de FERNANDEZ et al. (2001) quando estudaram a germinação de conídios em larvas de Leptinorsa decemlineata Say após 24 horas e inferiores aos resultados de MILNER et al. (1997), quando estudaram a taxa de germinação de B. bassiana com 100% de umidade relativa. Segundo SOSA-GOMÉZ; ALVES (2000), a germinação é estimulada em umidade acima de 80%, embora MARCANDIER; KHATCHATORIANS (1987) tenham afirmado que o percentual de germinação não é tão importante, pois os isolados com germinação abaixo de 50% não perdem a virulência, em virtude das toxinas elaboradas antes da morte dos conídios.

Tabela 1
Percentual médio de germinação de Beauveria bassiana após reisolamento de ovo, larva e adulto de Chrysomya albiceps após 12 dias de inoculação.

Fase	% Germinação
CV (%)	4,92
Controle	79,13a
Ovo	81,91a
Larva	88,45a
Adulto	79,53a

• Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey em nível de 5% de probabilidade.

A Figura 1 mostra o número médio de colônias dos fungos reisolados de ovos, larvas e adultos, com diferença estatística dos reisolados de ovos e adultos, no 9^o e 15^o dia; e do reisolado de larva no 6^o dia, em relação ao controle. Esses resultados foram semelhantes aos de MACIEL (2002) quando avaliou o comportamento de B. bassiana reisolada de larvas da mosca Cochliomyia macellaria Fabricius e diferentes dos dados obtidos por INGLIS et al. (1999) quando observaram o comportamento de B. bassiana. Todavia, a variação do número de colônias recuperadas é comum, pelas diferenças encontradas entre linhagens (FARGUES et al. 1997).

Fig. 1
Número médio de colônia de Beauveria bassiana após reisolamento de ovo, larva e adulto de Chrysomya albiceps pós-infecção experimental.

Conforme consta na Figura 2, o diâmetro médio da colônia de B. bassiana reisolada de ovo, larva e adulto variou no tempo estabelecido e, com base na análise estatística, houve diferença em relação ao controle. Esses dados confirmam a grande adaptabilidade de B. bassiana, visto que os resultados foram semelhantes aos de SOUSA (2002) que estudou o comportamento deste fungo “in vitro” sem passagem em mosca. Também em estudo sobre o efeito de B. bassiana sobre a mosca Bemisia argentifolli Bellows & Perring, BROWNBRIGDE et al. (2001) verificaram que a virulência não foi afetada, quando estudaram o comportamento de B. bassiana após várias passagens nesse inseto.

Fig. 2
Diâmetro médio de colônia de Beauveria bassiana após reisolamento de ovo, larva e adulto de Chrysomya albiceps.

O experimento sobre a esporulação mostrou que o número médio de conídios do reisolado de larva e adultos foi diferente em relação ao controle (Tabela 2). Esses dados foram discordantes com os resultados de esporulação alcançados por PAIÃO et al. (2001) quando observaram os aspectos comportamentais de B. bassiana. Provavelmente, essas diferenças sejam explicadas pela umidade relativa utilizada, pois, segundo ALVES (1998), os fatores abióticos são relevantes durante o processo de infecção nos insetos.

Tabela 2
Esporulação média de Beauveria bassiana após reisolamento de ovo, larva e adulto de Chrysomya albiceps no 12^o dia pós inoculação

Fase	Esporulação no 12o dia
CV (%)	4,92
Controle	3.29 x 107 b
Ovo	3.3 x 107 b
Larva	3.95 x 107 a
Adulto	3.97 x 107 a

• Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey em nível de 5% de probabilidade.

Análise das microestruturas de Beauveriabassiana antes e após o reisolamento de ovo, larva e adulto de Chrysomya albiceps pós-infecção experimental

Fig. 3
Beauveria bassiana. a) Anastomose reisolada de ovo de Chrysomya albiceps, 72h, 640x; b) Primórdio de conidióforo reisolado de larva de Chrysomya albiceps, 96h, 640x; c) Conidióforos e conídios ao longo do eixo hifal, mostrando célula coniogênica de terminação em zigue-zague (seta) reisolada de larva, 96h, 640x; d) Conidióforos maduros e conídios reisolados de adulto de Chrysomya albiceps, 120h, 640x.

Foi observada a formação de micélio nas primeiras 48 horas no reisolado de ovo, larva e adulto de C. albiceps e do controle. Às 72 horas foram observadas várias anastomoses (Fig. 3a), importantes para realização do ciclo parassexual (PACCOLA-MEIRELLES; AZEVEDO, 1991) no qual se processa através da plasmogamia, estabelecimento do heterocário e formação de diplóides e recombinantes mitóticos (AZEVEDO, 2001). Às 96 horas, foi constatada a presença de primórdios de conidióforos e conidióforos jovens no reisolado de ovo, larva e adulto. Estas observações foram confirmadas também no controle (Fig. 3b). Às 120 horas foram observados conidióforos ao longo do eixo hifal (Fig. 3c) e abundantes conidióforos maduros formando densos cachos de conídios globosos isolados, característicos da espécie (DE HOOG, 1972) (Fig. 3d). Não foram encontradas diferenças morfológicas entre os reisolados de ovo, larva, adulto e do controle, embora estas características tenham sido mais abundantes e intensas no reisolado oriundo de larva. As características observadas em relação ao tempo concordam com os resultados relatados por SOUSA (2002) quando estudaram o comportamento de B. bassiana “in vitro”.

Foi observado 100% de conídios uninucleados, de formato globoso, antes e pós-passagem em ovo, larva e adultos de C. albiceps, pós-infecção experimental, não sendo observado variação na condição nuclear entre o controle e os reisolados das diferentes fases pós-embrionárias de C. albiceps. Estes resultados são semelhantes aos de PACCOLA-MEIRELLES; AZEVEDO (1991) e FERREIRA (2000) quando trabalharam com linhagens selvagens de B. bassiana em cultura, “in vitro”.

CONCLUSÕES

Quanto ao comportamento de Beauveria bassiana após reisolamento, foi observada que a germinação dos conídios oriundos do fungo pós-passagem em ovo, larva e adulto não varia quando comparada com o controle; o número de conídios recuperados póspassagem de adulto e larva é maior que o controle. O diâmetro das colônias do fungo pós-passagem em ovo, larva e adulto varia de acordo com o período avaliado.

Quanto à citologia, as estruturas vegetativas e reprodutivas pós-passagem em larva apresentaram-se de forma mais intensa e abundante do que em ovo e em adulto. A condição uninucleada dos conídios e hifas permaneceu para o fungo pós-passagem em ovo, larva e adulto. Esses resultados mostram o alto grau de adaptação desse fungo, o que confirma a sua preferência no controle de inseto-praga que poderá ser extrapolado para C. albiceps, como uma alternativa de controle a ser investigada.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  12 Jan 2022
• Data do Fascículo
  Oct-Dec 2007

Histórico

• Recebido
  28 Set 2006
• Aceito
  08 Dez 2007