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Arquivos do Instituto Biológico

versão On-line ISSN 1808-1657

Arq. Inst. Biol. vol.80 no.2 São Paulo abr./jun. 2013

http://dx.doi.org/10.1590/S1808-16572013000200002 

ARTIGO CIENTÍFICO SCIENTIFIC ARTICLE

 

PCR na detecção de gene Fel A de Escherichia Coli em frangos de corte condenados por aerossaculite pela Inspeção Sanitária Federal

 

PCR for the detection of the gene Fel A of Escherichia Coli in broiler condemned for airsacculitis by the Brazilian Federal Sanitary Inspection

 

 

L.S. Machado; E.R. Nascimento; V.L.A. Pereira; D.O. Almeida; D.L.C. Abreu; R. Gouvêa

Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Veterinária, Departamento de Saúde Coletiva Veterinária e Saúde Pública, Rua Dr. Vital Brazil Filho, 64, CEP 24230-340, Niterói, RJ, Brasil. E-mail: leandromachadovet@yahoo.com.br

 

 


RESUMO

A colibacilose é considerada uma das principais doenças da indústria avícola moderna, devido aos grandes prejuízos econômicos causados. A Escherichia coli contribui não só para a doença em si, levando à perda de peso das aves, bem como para o aumento da taxa condenação de carcaças durante o abate e processamento. A detecção de fatores de virulência de cepas de E. coli do patotipo APEC colabora para a caracterização de sua patogenicidade e as técnicas de PCR têm sido muito úteis na pesquisa de genes que os codificam. Este estudo objetivou diagnosticar E. coli pela detecção o gene Fel A por PCR e relacionar a positividade para este agente com o baixo peso em frangos de corte provenientes de lotes condenados por aerossaculite. Foram estudados 40 lotes de frangos de corte abatidos em um matadouro avícola sob Inspeção Sanitária Federal, localizado no Estado do Rio Grande do Sul. Foram colhidos aleatoriamente 3 frangos e obtidos "pools" de três traqueias em cada um deles para PCR. O DNA foi extraído pelo método de fenol-clorofórmio e amplificado com pares de "primers" específicos para gene Fel A de E. coli. Dos 40 lotes analisados pela PCR, 35% (14/40) foram positivos para o gene Fel A. A PCR foi eficaz para a detecção do gene Fel A em lotes de frangos de corte e houve relação entre a presença do gene Fel A, a queda de peso e aumento na taxa de aerossaculite.

Palavras-Chave: Aves, colibacilose, fatores de virulência, fímbria F11, doença crônica respiratória.


ABSTRACT

Collibacillosis is considered one of the major diseases of the modern poultry industry, due to the significant losses it causes. Escherichia coli contributes not only to the disease itself, by causing weight loss of the birds, but also to the increase in carcasses condemnation during slaughter and processing. Detection of virulence factors in E. coli strains of the APEC pathotype contributes to the characterization and pathogenicity of this agent. PCR techniques have been very helpful in the search for genes that encode those virulence factors. This study aimed to detect the gene Fel A of E. coli by PCR and relate its positivity to low weight in broiler flocks with airsacculitis as diagnosed by the health inspection service. The study involved 40 flocks of broilers slaughtered in a single poultry slaughterhouse, under Federal Sanitary Inspection, located in the state of Rio Grande do Sul, Brazil. Three broilers were randomly selected to obtain one "pool" of three tracheas for each PCR. DNA was extracted using phenol-chloroform and amplified using a pair of primers specific to gene Fel A of E. coli. Of the 40 flocks analyzed by PCR, 35% (14/40) were positive for the gene Fel A. PCR was an effective technique for the detection of gene Fel A in broiler flocks. There was a relationship between the presence of the gene Fel A, weight loss, and increase of the airsacculitis rate.

Key Words: Avian, collibacillosis, virulence factors, fimbriae F11, chronic respiratory disease.


 

 

INTRODUÇÃO

A Escherichia coli é um componente normal da microbiota do trato intestinal dos animais e do homem, existindo de forma comensal ou patogênica. A adaptação ao hospedeiro e a patogenicidade de alguns patotipos de E. coli é atribuída à aquisição horizontal de genes de virulência específicos por cepas não patogênicas (Dozois et al., 2003).

A E. coli patogênica para aves (Avian Pathogenic E. coli – APEC) é responsável pela colibacilose e pertence ao grupo das E. coli patogênicas extraintestinais, estando associada a quadros de: colisepticemia, peritonite, pneumonia, pleuropneumonia, aerossaculite, pericardite, celulite, coligranuloma, DCR complicada, onfalite, salpingite, síndrome da cabeça inchada, panoftalmia, osteomielite, ooforite e sinovite (Ferreira; Knobl, 2009). Nas aves, a colibacilose inicia-se no epitélio traqueal, em contraste com a maioria das doenças causadas pela E. coli em humanos e outros mamíferos, afetados inicialmente no epitélio intestinal e urinário (Vidotto et al., 1997) e é responsável por condenações parciais ou totais das carcaças devido a vários processos inflamatórios, entre eles a aerossaculite (Brasil, 1998).

Além do aumento das condenações, aves com aerossaculite podem apresentar-se com menor peso em relação a aves sem aerossaculite. A desuniformidade dos lotes na linha de abate aumenta o risco de condenação de cortes e carcaças durante a evisceração e, consequentemente, o risco de contaminação das carcaças com patógenos do trato intestinal torna-se maior (Russel, 2003).

As cepas de APEC possuem fatores de virulência específicos e são capazes de causar a colibacilose aviária (Cardoso et al., 2002; Delicato et al., 2003). Destacam-se como fatores essenciais para a patogenicidade das estirpes de E. coli a ação das adesinas, a produção de metabólitos bacterianos, fatores de resistência sérica, a ação de hemolisinas e aerobactina e a produção de citotoxinas (Brito et al., 2003). Segundo Gibbs et al. (2003) e Rocha et al. (2008), a patogenicidade das estirpes está relacionada com o impacto cumulativo de vários fatores de virulência. Skyberg et al. (2003), em um estudo complementar sobre a letalidade embrionária de cepas de E. coli, demonstraram que apenas as cepas que apresentaram mais de dois fatores de virulência causavam a mortalidade em um número maior de embriões, mesmo que isolados de aves sadias.

Um dos genes de virulência de maior relevância da E. coli desempenha o papel de adesão representados pelas fímbrias, responsáveis pela aderência da bactéria à mucosa em diferentes estágios da doença (Kuhnert et al., 2000). Segundo Gyimah; Panigrahy (1988) e Eisenstein (1987), os fatores de aderência permitem a interação entre as bactérias e as células do hospedeiro. Sua especificidade para receptores das células do hospedeiro capacita as bactérias à superação dos mecanismos fisiológicos de defesa, permitindo a colonização e multiplicação com ou sem invasão sistêmica subsequente. Os genes de adesão comumente identificados em estirpes de E. coli isoladas de aves são a fímbria P (pap C) e fímbria F11 (Fel A) (La Ragione; Woodward, 2002; Rocha et al., 2008). Pourbakhsh et al. (1997) destacaram que a fimbria P pode estar envolvida na colonização de órgãos, com subsequente septicemia, entretanto, de acordo com Dozois et al. (1995), as traqueias de aves não apresentam receptores para a fimbria P. Em outro estudo do mesmo autor, 12 em 13 cepas de E. coli aviárias isoladas de aves com colisepticemia exibiram a sequência gênica relacionada com gene Fel A codificada na fímbria F11 (Dozois et al., 1996).

Este estudo objetivou detectar o gene Fel A pela PCR e relacionar a positividade para este gene com o baixo peso em frangos de corte provenientes de lotes com condenação por aerossaculite na Inspeção Sanitária Federal.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Foram colhidas aleatoriamente, na área de evisceração, fragmentos de traqueias de 3 aves de cada um dos 40 lotes com diagnóstico de aerossaculite. Os lotes variaram de 5.728 a 14.535 correspondendo a um total de 429.886 de frangos de corte do mesmo estabelecimento e abatidos num matadouro avícola sob Inspeção Sanitária Federal localizada no Estado do Rio Grande do Sul. O peso médio dos lotes de frangos e o percentual de condenação por aerossaculite foram obtidos junto à Inspeção Sanitária.

 Os "pools" de traqueias de cada lote foram acondicionados em placas de Petri esterilizadas. As traqueias foram abertas com uma tesoura de ponta reta e em seguida seu conteúdo foi colhido com o auxílio de um suabe. Depois foi feita a escarificação usando-se lâminas de bisturi. Os "pools" de suabe e de escarificado foram acondicionados separadamente em tubos de rosca contendo 2,0 mL de "Phosphated Buffered Saline" (PBS) pH 7,4. De cada tubo foi retirado uma alíquota de 1,0 mL e colocado em tubo graduado de 1,5 mL para extração do DNA.

O método de extração por fenol/clorofórmio, adaptado de Sambrook; Russell (2001a), foi realizado diretamente dos "pools" das amostras, sem a realização de pré-enriquecimento. Foi utilizado o par de "primers" específico para o gene Fel A de E. coli que produzem "amplicons" de 270 pares de base (pb), conforme Rocha et al. (2008). Como controle positivo utilizou-se amostra de E. coli fornecida pelo Dr Sílvio Luís da Silveira Rocha, do Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Patologia Aviária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. A reação de PCR foi realizada nas seguintes condições: 12,75 µL de água ultrapura (Milli-Q), 2,5 µL de Tampão PCR 10X, 1,25 µL de MgCl2 (25 mM), 1,25 µL de dNTP mix (0,25 mM de cada), 1 µL (100 pmol) de cada "primer", 0,25 µL (2,5 U/mL) de Taq Polimerase e 5 µL do DNA extraído, obtendo-se um volume final de 100 µL.

Após a reação de amplificação, homogeneizaram- se 10 µL de cada amostra com 2 µL de tampão de arrasto, aplicou-se em gel de agarose a 1,5%, submerso em Tampão Tris-Borato-EDTA (TBE) 0,5X e por fim submeteu-se à eletroforese em condições baseadas em Sambrook; Russell (2001b). Após a corrida eletroforética, corou-se o gel em brometo de etídio e procedeu-se à visualização dos "amplicons" sob luz ultravioleta em transiluminador.

Para verificar se a presença de aerossaculite e o baixo peso dos lotes de frango ao abate eram preditivos para o gene Fel A pela PCR foram feitas Análises de Regressão Logística Simples. Para a relação de aerossaculite com o baixo peso dos lotes foi feita Regressão Linear Simples. A relação entre baixo peso dos lotes e a presença do gene Fel A também foi analisada pelo teste t-Student. A influência do tipo de processamento do espécime clínico (suabe, escarificado ou suabe + escarificado) sobre o resultado da PCR foi analisada pelo teste de Qui-quadrado (Thrusfield, 2003).

 

RESULTADOS

Em todos os lotes estudados observou-se uma taxa de condenação por aerossaculite, variando de 0, 0176 a 0, 9435%. Houve diferença significativa entre os lotes positivos e negativos para o gene Fel A pela análise de t-Student em relação ao baixo peso dos lotes de frangos (p < 0,05) (Tabela 1).

 

 

Dos 40 lotes de frangos de corte analisados pela PCR, 35% (14/40) foram positivos para o gene Fel A, pelo aparecimento de "amplicons" de 270 pares de base (pb) (Figs. 1 e 2).

Pela análise do teste de Qui-Quadrado, comparando-se a detecção do gene Fel A em material colhido por suabe e escarificado de traqueia, obteve-se um p>0,05, não havendo, portanto, diferença significativa entre os resultados para suabe, escarificado e suabe + escarificado (Tabela 2).

 

 

Da relação entre positividade na PCR para o gene Fel A de E. coli com aerossaculite obteve-se pela Regressão Logística Simples a equação Logit Pi = - 0,1 - (2,458 x aerossaculite) com odds ratio não significativo (p > 0,05), significando que a ausência do gene Fel A está relacionada com a queda na taxa de aerossaculite. Porém, pelo teste t-Student, a relação de aerossaculite com baixo peso dos frangos foi significativa (p < 0,05) (Tabela 1).  Por outro lado, a presença do gene Fel A esteve relacionada com a queda de peso dos frangos, obtendo-se a equação Logit Pi = 17,5747 - (6,34 x peso) com odds ratio igual a 0,0018, mas significativo (p < 0,05). Pela Regressão Linear Simples a equação Y = 1,3571 – 0,3899 X evidenciou que aerossaculite está relacionada com a queda de peso (p < 0,05) e, pelo coeficiente de determinação (R²) da equação, pode-se concluir que 9% dos problemas de peso são justificados pela presença dessa lesão.

Comparando-se a detecção do gene Fel A de E. coli em relação ao processamento por suabe ou escarificação da traqueia, não houve diferença significativa (p > 0,05) pelo teste de Qui-quadrado (Tabela 2).

 

DISCUSSÃO

A detecção do gene Fel A de E. coli, nas amostras provenientes de traqueia de frangos de corte no presente estudo, justifica-se, pois ele é um gene de adesão que permite a interação deste agente de forma específica às células do epitélio traqueal (Dozois et al., 1995; Dozois et al., 1996). Em estudo feito por Rocha et al. (2008), aves com sintomatologia respiratória e lesões compatíveis com colibacilose apresentaram um maior percentual do gene de adesão Fel A (24/61) em relação ao gene Pap C (15/61), este último envolvido na colonização de órgãos sistêmicos (Pourbakhsh et al., 1997). A ausência do gene Fel A de E. coli esteve associada ao decréscimo de aerossaculite, porém, com probabilidade pequena e não significativa, o que pode ser explicado pela falta de ação concomitante dos outros fatores de virulência de E. coli, de vez que a ação da referida bactéria depende do impacto cumulativo de vários fatores de virulência (Gibbs et al., 2003; Rocha et al., 2008; Skyberg et al., 2003).

A presença de aerossaculite, per si, é fato que merece ser considerado de grande importância, pois, além das perdas determinadas pela condenação de carcaças, em concordância com os resultados deste estudo, pode comprometer a saúde das aves e do consumidor de produtos avícolas (Brasil, 1998).  Além do aumento das condenações, aves com aerossaculite podem apresentar-se com menor peso em relação a aves sem aerossaculite conforme obtido neste estudo. A desuniformidade na linha de abate aumenta o risco de condenação das carcaças devido à contaminação por patógenos do trato intestinal (Russel, 2003).

Como não houve significância da influência do tipo de processamento de espécime clínico para o diagnóstico de gene Fel A de E. coli por PCR, pode-se optar pelo método mais simples, ou seja, a utilização de suabe.

 

CONCLUSÃO

A detecção do gene Fel A de E. coli em amostras de traqueia de frangos teve relação com o aumento da taxa de condenação por aerossaculite e com o baixo peso dos lotes de frangos ao abate. Houve relação do aumento da taxa de aerossaculite com o baixo peso. A PCR foi capaz de detectar o gene Fel A de E. coli em lotes de frangos de corte, não sendo o resultado influenciado pelo processamento por suabe, escarificado ou ambos.

 

AGRADECIMENTOS

Ao Programa de Pós-Graduação de Higiene Veterinária e Produtos de Origem Animal da Universidade Federal Fluminense. Aos colegas do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Pública, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal Fluminense, pela valiosa ajuda deste trabalho. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

 

REFERÊNCIAS

BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abaste-cimento. Portaria n°210, de 10 de nov. de 1998. Regulamento Técnico da Inspeção Tecnológica e Higiênico-sanitária de carne de aves do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). Diário Oficial República Federativa do Brasil, Brasília/DF, 11 de novembro. 1998. Seção 1.         [ Links ]

BRITO, B.G.; TAGLIARI, K.C.; BERBEL, M.M.; FREIRE, R.L. Produção de enterotoxina termoestável, hemolisinas, colicinas e fatores de colonização em amostras de Escherichia coli isoladas de leitões com diarréia no sudoeste do Paraná. Scientia Agrária, v.4, n.1, p.15-20, 2003.         [ Links ]

CARDOSO, A.L.S.P.; TESSARI, E.N.C.; CASTRO, A.G.M.; PULICI, S.C.P.; ZANATTA, G.F.. Prevalência de resistência em amostras de Escherichia coli de origem aviária. In: CONFERÊNCIA APINCO 2002 DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA AVÍCOLAS, 2002, Campinas,SP. Resumos. Campinas: FACTA, 2002. p.129.         [ Links ]

DELICATO, E.R.; BRITO, B.G.; GAZIRI, L.C.J.; VIDOTTO, M.C. Virulence associated genes in Escherichia coli isolates from poultry with colibacillosis. Veterinary Microbiology, v.94, p.97-103, 2003.         [ Links ]

DOZOIS, C.M., POURBAKHSH, S.A.; FAIRBROTHER, J.M. Expression of P and type 1 (Fl) fimbriae in pathogenic Escherichia coli from poultry. Veterinary Microbiology, v.145, p.297-309, 1995.         [ Links ]

DOZOIS, C.M.; HAREL, J.; FAIRBROTHER, J.M. P-fimbriae-producing septicaemic Escherichia coli from poultry possess febrelated gene clusters whereas pap hybridizing P-firnbriae negative strains have partial or divergent P fimbrial gene clusters. Microbiology, v.142, p.2759-2766, 1996.         [ Links ]

DOZOIS, C.M.; DAIGLE, F.; CURTISS III, R. Identification of pathogen-specific and conserved genes expressed in vivo by an avian pathogenic Escherichia coli strain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.100, n.1, p.247-252, 2003.         [ Links ]

EISENSTEIN, B.I. Fimbriae. In: NEIDHARDT, F.C. (Ed.). Escherichia coli and Salmonella Typhimurium: celular and molecular biology. Washington: American Society for Microbiology, 1987. v.1, p.84-90.         [ Links ]

FERREIRA, A.J.P.; KNOBL, T. Colibacilose. In: BERCHIERI JUNIOR, A.; SILVA, E.N.; DI FÁBIO, J.; SESTI, L.; ZUANAZE, M.A.F. (Ed.). Doenças das aves. 2.ed. Campinas. Fundação APINCO de Ciência e tecnologia Avícolas, 2009. cap. 4.2, p.457-471.         [ Links ]

GIBBS, P.S.; MAURER, J.J.; NOLAN, L.K.; WOOLEY, E. Prediction of chicken embryo lethal.ity with the avian Escherichia coli traits complement resistance, colicin V production, and presence of increased serum survival. gene cluster (iss). Avian Diseases, v.47, n.2, p.370-379, 2003.         [ Links ]

GYIMAH, J.E.; PANIGRAHY, B. Adhesin-receptor Interactions Mediating the Attachment of Pathogenic Escherichia coli to Chicken Tracheal Epithelium. Avian Diseases, v.32, n.1, p.74-78, 1988.         [ Links ]

KUHNERT, P.; BOERLIN, P.; FREY, J. Target genes for virulence assessment of Escherichia coli isolates from water, food and the environment. FEMS Microbiology Reviews, v.24, n.1, p.107-117, 2000.         [ Links ]

LA RAGIONE, R.M.; WOODWARD, M.J. Virulence factors of Escherichia coli serotypes associated with avian colisepticaemia. Research in Veterinary Science, v.73, n.1, p.27-35, 2002.         [ Links ]

POURBAKHSH, S.A.; DHO-MOULIN, M.; BREE, A.; DESAUTELS, C.; MARTINEAU-DOIZE, B.; FAIRBROTHER, J.M. Localization of the in vivo expression of P and F1 fimbriae in chickens experimentally inoculated with pathogenic E. coli. Microbial Pathogenesis, v.22, p.331-341, 1997.         [ Links ]

ROCHA, A.C.G.P.; ROCHA, S.L.S.; LIMA-ROSA, C.A.V.; SOUZA, G.F.; MORAES, H.L.S.; SALLE, F.O.; MORAES, L.B.; SALLE, C.T.P. Genes associated with pathogenicity of avian Escherichia coli (APEC) isolated from respiratory cases of poultry. Pesquisa Veterinária Brasileira, v.28, n.3, p.183-186, 2008.         [ Links ]

RUSSEL, S.M. The effect of airsacculitis on bird weights, uniformity, fecal contamination, processing errors, and populations of Campylobacter spp. and Escherichia coli. Poultry Science, v.82, n.8, p.1326-1331, 2003.         [ Links ]

SAMBROOK, J.; RUSSELL, D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. In: _______. Preparation and analysis of eukaryotic genomic DNA. 3.ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001a. v.1, Cap.6, p. 6.4-6.11.         [ Links ]

SAMBROOK, J.; RUSSELL, D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. In: _______. Gel electrophoresis of DNA and Pulsed-fiels Agarose Gel Eletrophoresis. 3.ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001b. v.1, Cap.5, p. 5.1-5.17.         [ Links ]

SKYBERG, J.A.; HORNE, S.M.; GIDDINGS, C.W.; WOOLEY, R.E.; GIBBS, P.S.; NOLAN, L. Characterizing avian Escherichia coli isolates with multiplex polymerase chain reaction.  Avian Diseases, v.47, n.4, p.1441-1447, 2003.         [ Links ]

THRUSFIELD, M. Epidemiologia veterinária. 2.ed. São Paulo: Roca, 2003. 556p.         [ Links ]

VIDOTTO, M.C.; NAVARRO, H.R.; GAZIRI, L.C.J. Adherence pili of pathogenic strains of avian Escherichia coli. Veterinary Microbiology, v.59, n.1, p.79-87, 1997.         [ Links ]

 

 

Recebido em 12/12/11
Aceito em 16/4/13

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