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Arquivos do Instituto Biológico

versão On-line ISSN 1808-1657

Arq. Inst. Biol. vol.80 no.3 São Paulo jul./set. 2013

http://dx.doi.org/10.1590/S1808-16572013000300008 

TOXICOLOGY/SCIENTIFIC ARTICLE

 

Produção de aflatoxinas e ácido ciclopiazônico por cepas de Aspergillus flavus isoladas de amendoim

 

Production of aflatoxin and cyclopiazonic acid by Aspergillus flavus strains isolate from peanuts

 

 

Edlayne GonçalezI,*; Janaina Lara da SilvaI; Tatiana Alves dos ReisII; Viviane Kobushi NakaiII; Joana D'Arc FelicioI; Benedito CorrêaII

ICentro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Animal, Instituto Biológico de São Paulo - São Paulo (SP), Brasil
IIInstituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo (USP) - São Paulo (SP), Brasil

 

 


RESUMO

Aspergillus flavus é um fungo filamentoso que pode produzir aflatoxinas e ácido ciclopiazônico, sendo que a presença dessas micotoxinas em alimentos e rações pode levar a um efeito tóxico no homem e em animais. Cepas de A. flavus produtoras de aflatoxinas e ácido ciclopiazônico são frequentemente isoladas do amendoim, indicando a natural co-ocorrência dessas toxinas neste substrato. Neste estudo, foram isoladas 47 cepas de Aspergillus flavus em grãos e cascas de amendoim durante diferentes fases de maturação do fruto e também durante seu armazenamento. Das cepas isoladas, foram avaliados os potenciais para produção de aflatoxinas e ácido ciclopiazônico, em que 91,5% foram produtoras de aflatoxinas e 70% produziram ácido ciclopiazônico, sendo que 63,8% produziram ambas as toxinas e 2,1% não produziu nenhuma. A presença de cepas toxigênicas de A. flavus nas amostras de amendoim analisadas indica um risco potencial da contaminação deste produto, caso seja exposto a condições ambientais favoráveis ao crescimento do fungo e produção de micotoxinas.

Palavras-chave: micotoxinas; fungos toxigênico; produção de micotoxinas; ocorrência.


ABSTRACT

Aspergillus flavus is a filamentous fungus that can produce aflatoxins and cyclopiazonic acid, and the presence of these mycotoxins in food and feed can lead to a toxic effect on humans and animals. Strains of A. flavus producing aflatoxin and cyclopiazonic acid are often isolated from peanuts, indicating the the co-occcurrence of these toxins in the natural substrate. In this study, we isolated 47 strains of A. flavus on peanut kernels and hulls during different stages of fruit ripening and its storage. Of the isolated strains, we assessed the potential for aflatoxin and cyclopiazonic acid production, in which 91.5% could produce aflatoxins and 70% produced cyclopiazonic acid; 63.8% produced both toxins and 2.1% produced no toxin. The presence of toxigenic A. flavus strains in peanut samples indicate a potential risk of contamination of these products, if they are exposed to environmental conditions that are favorable to fungal growth and mycotoxin production.

Keywords: mycotoxins; toxigenic fungi; mycotoxin production; occcurrence.


 

 

INTRODUÇÃO

Os fungos podem causar uma série de danos aos grãos durante o plantio e a colheita, bem como durante o armazenamento (Sillker; Elliot, 1980), sendo que Aspergillus, Fusarium e Penicillium são os principais gêneros de fungos que produzem micotoxinas em alimentos (Siame et al., 1998). Micotoxinas são substâncias tóxicas produzidas pelo metabolismo secundário de várias espécies de fungos filamentosos, os quais contaminam alimentos no campo, no armazenamento ou após a manufatura (Moss, 1996). Os fungos toxigênicos são conhecidos por produzir uma ou mais micotoxinas (Hussein, 2001). Aspergillus flavus é um fungo filamentoso que pode produzir aflatoxinas e ácido ciclopiazônico, sendo que a coprodução dessas micotoxinas pode resultar em efeito tóxico aditivo ou sinérgico nos consumidores, aumentando o potencial toxigênico deste fungo (Gqaleni et al., 1997). Em geral, amendoim, milho e sementes de algodão estão entre os grãos com maior risco de contaminação (Ismail, 2000). No Brasil, a contaminação de amendoins por aflatoxinas é um grande problema devido a fatores ambientais que favorecem o crescimento de fungos e a produção da toxina (Calori-Domingues; Fonseca, 1995). O ácido ciclopiazônico ocorre naturalmente no milho e no amendoim juntamente com as aflatoxinas (Vaamonde et al., 2003).

Vários estudos foram conduzidos para identificar a microbiota fúngica e as micotoxinas no amendoim durante a estocagem e em condições de campo experimentais, sendo que os principais gêneros encontrados foram Aspergillus, Penicillium e Fusarium, e entre as micotoxinas, as aflatoxinas e o ácido ciclopiazônico (Lisker et al., 1993; Horn et al., 1994; 1995; 2000; Anderson et al., 1996; Siame et al., 1998; 2000; Ismail, 2000; Bhattacharya; Raha, 2002; Vaamonde et al., 2006; Mphane et al., 2004; Pildain et al., 2004; Gonçalez et al., 2008a, 2008b; Nakai et al., 2008; Zorzete et al., 2011, 2013; Atayde et al., 2012). Baquião et al. (2012) relataram alta frequência de A. flavus toxigênicos em solo no qual são coletadas castanhas do Brasil na Amazônia, assim como a presença destes nos frutos e casca.

A contaminação por aflatoxinas é o principal problema de segurança alimentar nas culturas de campo, particularmente de itens que são produzidos em climas tropicais e sutropicais em países nos quais a alta temperatura e a umidade promovem o crescimento e a proliferação de Aspergillus spp. (Rudrew et al., 2013).

Este trabalho teve como objetivo isolar cepas de Aspergillus flavus das cascas e grãos de amendoim durante as diferentes fases de maturação do fruto durante um ano de armazenamento, verificando o potencial toxigênico destas quanto à produção de aflatoxinas B1 e B2 e o ácido ciclopiazônico.

 

MATERIAL E MÉTODOS

local de coleta

O estudo foi realizado em Junqueirópolis, Estado de São Paulo, Brasil. A semente de amendoim utilizada no plantio foi da variedade Runner IAC 886, plantada no mês de dezembro de 2004. O amendoim foi colhido em março de 2005 e armazenado por um ano. Foram realizadas quatro coletas no campo de amendoim nas seguintes fases de maturação: fruto recém-formado, em início de granação, em granação, maduro e após a secagem. Os frutos foram armazenados por um ano, de junho de 2005 a junho de 2006. Foram realizadas coletas mensais em triplicata.

Isolamento e identificação dos fungos

De cada uma das 25 amostras de amendoim foram retiradas, aproximadamente, 30 g para desinfecção em solução de hipoclorito de sódio 2% por 3 minutos. Após a desinfecção, separou-se a casca dos grãos do amendoim, que foram lavados com água estéril. Foram utilizadas, para cada amostra em meio de cultura, 3 placas de Petri contendo 11 grãos cada e 3 placas contendo cascas semeadas diretamente em meio Ágar DRBC e AFPA (Pitt et al., 1979). Todas as placas foram incubadas a 25°C por cinco dias e os resultados foram expressos em porcentagem do total de grãos inoculados contaminados por fungos. Em seguida, colônias de diferentes tipos morfológicos foram isoladas em Ágar Sabouraud Dextrose e submetidas à identificação por meio da técnica de microcultivo (Riddell, 1950). Os fungos pertencentes ao gênero Aspergillus foram classificados por espécie de acordo com os seguintes compêndios: Arx (1974), Barnett; Hunter (1965), Barron (1972), Ellis (1993), Nelson et al. (1983), Raper; Fennel (1965).

Produção de Micotoxinas

Aflatoxinas

As cepas de Aspergillus spp. isoladas e identificadas como A. flavus (47) foram mantidas em tubos contendo o meio Ágar Batata Dextrose (BDA) para avaliação do potencial toxigênico, utilizando a metodologia descrita por Lin; Dianese (1976). As cepas foram mantidas em BDA por dez dias a 25°C e, em seguida, um fragmento de cada colônia foi inoculado em uma placa de Petri contendo o meio Ágar Coco, sendo incubada, novamente, por dez dias a 25°C. Após o crescimento, o conteúdo das placas foi triturado e pesado, e as aflatoxinas foram extraídas com 30 mL de clorofórmio para cada de 10 g do cultivo. Após 30 minutos de agitação, o solvente foi filtrado em papel de filtro contendo sulfato de sódio e terra de diatomácea. O filtrado foi evaporado até a secura e transferido para um volume conhecido e aplicado em placa de sílica gel G 60 (Merck), acompanhado de um padrão quantitativo de aflatoxinas B1, B2, G1 e G2. A placa foi eluída unidimensionalmente com a mistura de solventes clorofórmio:acetona (9:1 v/v) (Aoac, 1980). Após a secagem do solvente, realizou-se a leitura das amostras e do padrão em fotodensitômetro (CS 9000, Shimadzu). A quantificação foi feita por comparação das áreas das amostras com as áreas dos padrões de aflatoxinas.

Ácido ciclopiazônico

As cepas estudadas foram mantidas em tubos contendo Ágar batata dextrose a 25°C por sete dias. Foram inoculados 1,0 mL de suspensão de esporos, de cada cepa, em frascos contendo 25 mL de caldo de Czapeck-Dox (DIFCO) e incubados a 25°C por 12 dias. As culturas foram filtradas e os caldos foram extraídos duas vezes com 25 mL de clorofórmio (Sanchez et al., 2004). Os extratos foram filtrados, evaporados até a secura e rediluídos com 1,0 mL de metanol grau CLAE. O ácido ciclopiazônico foi quantificado por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), tendo como fase móvel acetonitrila:tampão acetato de amônio (0,05 M, pH 5) (8:2 v/v), fluxo de 0,6 mL.min-1, detector de UV em 284 nm (Losito et al., 2002), coluna ODS C8 4,6X250 mm de 5 micron (Shimadzu). O método de quantificação das amostras foi padrão externo, utilizando curva de calibração com 5 pontos (0,611; 1,223; 2,446; 4,892 e 9,798 mg.mL-1).

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Cepas de A. flavus produtoras de ACP e aflatoxinas são frequentemente isoladas de amendoim (Luk et al., 1977; Gallagher et al., 1978; Vaamonde et al., 2006), indicando a natural ocorrência simultânea dessas toxinas neste substrato. Tendo em vista os danos à saúde humana e animal causados pela ocorrência simultânea das aflatoxinas e do ACP, a produção dessas toxinas em produtos agrícolas deve ser controlada (Vaamonde et al., 2006).

Neste estudo foram isoladas 47 cepas de A. flavus, sendo 2 nas cascas dos frutos recém-formados; 3 nos grãos e 2 nas cascas no estágio de granação; 5 nos grãos e 1 nas cascas dos frutos maduros; 3 nos grãos e 1 nas cacas dos frutos após a secagem; 12 nas cascas e 18 nos grãos dos frutos armazenados. Das cepas isoladas no campo, 88,2% foram produtoras de aflatoxinas, 41,7% foram produtoras de ACP, 35,3% produziram ambas as toxinas, 52,9% produziram apenas aflatoxinas, 5,8% produziram apenas ACP e 5,8% não foram produtoras. Já durante o armazenamento, 93,3% foram produtoras de aflatoxinas, 86,6% foram produtoras de ACP, 80,0% produziram ambas as toxinas e 6,6% produziram apenas ACP. As concentrações de aflatoxina B1 e B2 variam de 18.560 a 30,0 mg.kg-1 e de 220 a 1,0 mg.kg-1, respectivamente, e as de ACP variam de 17,45 a 2,36 mg.mL-1, nos frutos colhidos durante a maturação (Tabela 1). Nas amostras coletadas durante o armazenamento, as concentrações de aflatoxinas B1, B2 e ACP variaram de 14.128 a 0,10 mg.kg-1, de 420 a 0,19 mg/kg e de 67,61 a 0,64 mg.mL-1, respectivamente (Tabela 2).

 

 

Em média, as cepas isoladas no campo produziram maior quantidade de aflatoxinas (AFB1 = 5.309,88 mg.kg-1 e AFB2 = 71,64 mg.kg-1) em relação às isoladas no armazenamento (AFB1 = 1.182,91 mg.kg-1 e AFB2 = 28,39 mg.kg-1), enquanto a produção de ACP foi maior pelas cepas isoladas no armazenamento (18,68 mg.mL-1) do que no campo (4,17 mg.mL-1), resultados significantes pelo teste ANOVA (p < 0,05). Quando aplicado o teste de Tukey-Kramer, somente considerou-se estatisticamente significante (p < 0,001) a diferença de concentrações entre a aflatoxina B1 do campo e do armazenamento. Outros estudos relataram a presença de A. flavus em grãos e cascas de amendoim das variedades Runner IAC 886 e Caiapó em diferentes estágios de maturação, e também durante o armazenamento, assim como a presença de aflatoxinas e ACP (Zorzete et al., 2012; 2013). A alta frequência de A. flavus e a presença de aflatoxinas foram verificadas em campos de amendoim de diferentes regiões do estado São Paulo (Atayde et al., 2012).

No Brasil, além de amendoim, há relatos de ACP em produtos derivados de tomates e em leite comercial, coletados no estado de São Paulo (Motta; Soares, 2000; 2001; Oliveira et al., 2006).

Os achados de ACP em amendoim e milho indicam que a extensão do potencial de exposição do homem e animais a esta toxina é maior do que se acreditava (Norred, 1987), sendo que o ACP pode ter contribuído com as aflatoxinas, para a "Tukey X Disease" (Vaamonde et al., 2003).

 

CONCLUSÃO

Cepas de Aspergillus flavus produtoras de aflatoxinas B1 e B2 e de ácido ciclopizônico foram isoladas em grãos de casca de amendoim antes, após e durante a colheita, assim como no armazenamento.

 

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Recebido em: 02/12/2011
Aceito em: 08/08/2013

 

 

*Autor correspondente: goncalez@biologico.sp.gov.br

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