Obtenção dos óleos essenciais

O óleo essencial de I. verum foi obtido a partir de 100 g de frutos secos adquiridos no comércio local de Lavras (MG), e aqueles de A. conyzoides, P. hispidinervum e O. odorífera, a partir de 300 g de folhas frescas coletadas no horto de plantas medicinais da Universidade Federal de Lavras (UFLA) (21^o 14' S; 45^o 00' W, altitude de 919 m e temperatura média anual de 26°C) durante o período da manhã e entre os meses de abril e maio de 2007. Cada espécime foi identificado e catalogado no herbário ESAL do Departamento de Biologia da UFLA (A. conyzoides reg. 12.726; P. hispidinervum reg. 23.013; O. odorífera reg. 22.215).

O processo de obtenção dos óleos essenciais foi o de hidrodestilação por meio de um aparelho de Clevenger modificado, com duração de 2,5 horas, pelo qual o hidrolato obtido foi centrifugado a 965 g a 25^oC, durante 5 minutos, para promover a separação entre as fases aquosa e oleosa, sendo esta última coletada e armazenada em frasco de vidro âmbar a 4^oC até a realização das análises posteriores (^{LIMA et al., 2009}).

Análise qualitativa dos óleos essenciais

A identificação dos componentes foi realizada por meio de cromatografia gasosa utilizando um equipamento Shimadzu (GC-17A) acoplado a um espectrômetro de massas com detector seletivo (QP 5000). Foi empregada uma coluna do tipo capilar de sílica fundida e fase ligada (DB5, 30 m x 0,25 mm), sendo a fase móvel o gás hélio (1 mL/min.), com temperaturas de 220°C no injetor e 240°C no detector. A temperatura do forno foi de 40 a 240°C, com acréscimo de 3°C/min; a pressão inicial na coluna foi de 100,2 KPa; taxa de split 1:10 e volume injetado de 1 µL (soluções a 1% (v/v) em diclorometano). Nas mesmas condições da amostra, foi injetada uma série de padrões de hidrocarbonetos (C₉H₂₀ à C₂₆H₅₄), gerando a regressão f(x) = 25.294TR + 610.630, na qual TR é o tempo de retenção de cada composto. Dessa maneira, foram comparados os espectros de massa de cada composto com o banco de dados da biblioteca Wiley 229, como também pelo índice Kovat's tabelado (^{ADAMS, 2007}).

Análise quantitativa dos óleos essenciais

A quantificação das substâncias foi realizada a partir da área dos picos obtidos nos cromatogramas, expressa em percentagem da área total, sendo realizada em triplicata, obtendo-se assim a média e o desvio padrão. Para isso, utilizou-se um cromatógrafo Shimadzu (GC-17A) equipado com detector de ionização de chama de hidrogênio e coluna capilar de sílica fundida e fase ligada (DB5, 30 m x 0,25 mm). O gás de arraste foi o nitrogênio (2,2 mL/min.); taxa split de 1:10 e volume de amostra injetado de 1 µL (soluções a 1% (v/v) em diclorometano). A temperatura inicial da coluna foi de 40°C com acréscimo de 3°C/min., até 240°C. As temperaturas do injetor e do detector foram fixadas em 220°C e 240°C, respectivamente, com a pressão da coluna de 115 KPa.

Avaliação toxicológica dos óleos essenciais sobre o pulgão-verde

Pulgões adultos ápteros com idade média de 2 a 3 dias foram obtidos em uma criação de manutenção do Departamento de Entomologia da UFLA, usando folhas de Sorghum bicolor (L.) Moench (Poacea) cultivar BR-85, temperatura de 26 ± 2^oC, umidade relativa de 70 ± 10% e fotofase de 14 horas.

Para a determinação dos valores de concentração letal (CL₁₀; CL₅₀ e CL₉₀), diversas concentrações dos óleos essenciais foram preparadas diluindo-as em acetona, obtendo gamas de concentração (v/v) 0,025 a 3,0% para A. conyzoides; 0,3 a 2,0%, para I. verum; 1,0 a 2,5%, para P. hispidinervum; e 0,2 a 2,6%, para O. odorífera. No caso dos tratamentos controle, foi utilizado somente o solvente acetona. Os ensaios de toxicidade aguda foram realizados em delineamento inteiramente casualizado e esquema fatorial (4 óleos x 2 substratos x 9 concentrações), sendo que cada parcela amostral foi composta por uma placa de Petri com dez pulgões adultos ápteros e repetidos seis vezes, totalizando 60 indivíduos por concentração.

Em um primeiro experimento, discos foliares de sorgo foram utilizados como substrato para a contaminação com os óleos essenciais, bem como para a alimentação dos pulgões. Seções circulares de 19,6 cm² foram higienizadas com hipoclorito de sódio a 1%, enxaguadas com água destilada, acondicionadas e fixadas em placa de Petri (5 cm de diâmetro) por uma solução de água:ágar a 2% e fechadas por filme de PVC. No segundo experimento, devido ao interesse em verificar somente o efeito tóxico dos óleos essenciais, sem a alimentação dos pulgões, contaminaram-se seções circulares de 19,6 cm² de papel-filtro, acondicionando-as no fundo das placas de Petri, e fechando-as com filme de PVC. Em ambos os experimentos, utilizando folha de sorgo ou papel-filtro, as superfícies foram contaminadas uniformemente pela distribuição de 4 mL de uma das soluções de acetona:óleo essencial, a qual foi realizada com auxílio de uma micropipeta automática (^{GUTIÉRREZ et al., 1997}). Devido à impossibilidade de manutenção dos pulgões durante um período de 48 horas sem alimentação, o ensaio de contaminação em papel-filtro teve duração máxima de 24 horas. No ensaio em que as folhas de sorgo foram contaminadas com os óleos essenciais, as avaliações ocorreram 24 e 48 horas após a liberação dos pulgões. Durante as avaliações, foram também considerados como pulgões mortos aqueles que não respondiam a estímulos.

Os dados de mortalidade foram submetidos à análise estatística do tipo dose-resposta, empregando-se modelos logísticos do pacote DRC (Analysis of Dose-Response Curves), compilado pelo software R^(r) (2010). Com a escolha dos melhores modelos, foram então estimados os valores das concentrações letais (CL₁₀; CL₅₀ e CL₉₀) com os respectivos intervalos de confiança (95%).

Identificação e quantificação dos constituintes dos óleos essenciais

Pelo processo de hidrodestilação empregado, obteve-se um rendimento (p/p) de óleo essencial na ordem de 3,81% para I. verum; 2,85% para P. hispidinervum; 0,68% para O. odorífera; e 0,46% para A. conyzoides. De maneira geral, observa-se que os rendimentos obtidos estão de acordo com aqueles apresentados por ^{RODRIGUES et al. (2003)} para I. verum (3,31% p/p); por ^{CASTRO et al. (2004)}, para o óleo essencial de A. conyzoides, os quais observaram uma variação de 0,49 a 0,70% (p/p); e por ^{FAZOLIN et al.(2007)}, que verificaram um rendimento de 3 a 3,5% (p/p) para o óleo de P. hispidinervum. Somente para O. odorífera, o rendimento encontrado neste estudo foi inferior ao relatado por ^{CASTELLANI et al.(2006)}, já que, segundo esses autores, a variação está ligada em função da coleta durante o período de outono.

O óleo essencial de A. conyzoides apresentou o precoceno (87,00%) como seu composto majoritário, seguido do (E)-cariofileno (7,10%), e, em menores concentrações, os sesquiterpenos β-cubebeno, α-humuleno, germancreno-D e γ-cadineno (Tabela 1), resultados que são concordantes com os obtidos por ^{KONG et al. (1999)}. Segundo ^{CASTROet al. (2004)}, existe uma grande variação na composição dos óleos essenciais de A. conyzoides em função do local de coleta das amostras. Contudo, os resultados aqui obtidos corroboram aqueles apresentados por esses autores. No que se refere ao óleo essencial da espécie I. verum, encontrou-se na maioria das vezes o composto (E)-anetol (90,40%), em menores quantidades, o limoneno (2,60%) e metil-chavicol (1,30%), além de pequenas concentrações do α-pineno, linalol e 4-terpineol. Esses dados estão de acordo com aqueles apresentados por ^{RODRIGUES et al. (2003)}, que encontraram maioria de (E)-anetol (90,00%), além de outros compostos, como o seu isômero, (Z)-anetol, e os fenilpropanoides metil-chavicol e anisaldeído. Esses autores destacam que pequenas diferenças podem ocorrer entre alguns compostos, provavelmente relacionadas aos processos de extração, quantificação/identificação, além de alterações ligadas à origem do material vegetal, local de coleta, clima e fertilidade do solo.

No caso do óleo de P. hispidinervum, verificou-se em sua constituição o safrol (82,50%) e o α-terpinoleno (13,40%), em maiores proporções, e em menores concentrações os monoterpenos α-pineno e δ-3-careno (Tabela 1). Esses resultados divergem dos encontrados por ^{FAZOLIN et al. (2007)} que, usando plantas originadas do estado do Acre, verificaram que a porcentagem de safrol contida em plantas de P. hispedinervum era superior a 90,00%. Novamente, esta diferença pode estar associada a diversos fatores bióticos e abióticos aos quais determinada planta pode estar exposta, tais como insolação, tipo de solo, umidade relativa, presença de pragas e doenças. Esses fatores podem induzir diferentes mecanismos bioquímicos envolvidos na síntese do metabolismo secundário e, consequentemente, nas composições dos óleos essenciais (^{SIMÕES; SPTIZER, 2004}). Para O. odorifera foi encontrado um alto teor dos fenilpropanoides, como o metil-eugenol (81,20%), seguido do safrol (10,60%), e, em pequenas proporções, 1,8-cineol e cânfora. Algumas pesquisas observaram que os teores de safrol e de metil-eugenol são variáveis, novamente dependendo da região de ocorrência dessa espécie vegetal (^{RIZZINI; MORS, 1995}). Ressalta-se que a variação no rendimento do óleo essencial de O. odorífera está diretamente ligada ao período de coleta e à fonte vegetal usada (folha, galhos, cascas), conforme descrito por ^{CASTELLANI et al. (2006)}.

Efeitos toxicológicos dos óleos essenciais

Entre os quatro óleos essenciais avaliados, verificou-se que aquele originado de A. conyzoides foi o mais tóxico, apresentando valores de CL₅₀ no ensaio com folha de sorgo contaminada de 7,13 e 2,50 µL óleo/cm², após 24 e 48 horas, respectivamente; e no de papel-filtro, 7,08 µL óleo/cm², após 24 horas. Os valores de CL₁₀ e CL₉₀ foram de 0,91 e 54,80 µL óleo/cm² (24 horas) e 0,26 e 26,80 µL óleo/cm² (48 horas) no ensaio com folha de sorgo e de 0,97 e 52,70 óleo/cm² (24 horas), quando usando papel-filtro com superfície contaminada (Tabela 2). Verificaram-se que os valores das concentrações letais no período de 24 horas nos ensaios com folhas de sorgo e papel-filtro contaminados foram similares, evidenciando a alta toxicidade desse óleo para S. graminum.

A alta toxicidade do óleo essencial de A. conyzoides verificada neste estudo está de acordo com ^{REGNAULT-ROGER (1997)} e ^{OKUNADE (2002)}, que afirmaram que este óleo essencial pode se tornar uma excelente alternativa para o uso no controle integrado de pragas. Como observado aqui, ^{BOUDA et al. (2001)} também concluíram que o óleo essencial de A. conyzoides é tóxico para Sitophilus zeamais (Mots.), principalmente pela presença dos precocenos I e II, apresentando CL₅₀ de 0,09 % (p/p). Segundo ^{MENDONÇA et al. (2005)}, A. aegypti foi altamente suscetível ao óleo essencial de A. conyzoides, com 100% de mortalidade das larvas após 48 horas e CL₅₀ de 148 µg óleo/L água. ^{SAXENA et al. (1992)} e ^{OKUNADE (2002)} atribuíram a toxicidade desse óleo essencial à presença de precocenos, os quais podem ter ação sobre o hormônio juvenil, acelerando o processo de metamorfose e originando adultos com alterações morfológicas e fisiológicas. Recentemente, ^{SOARES et al. (2011)} verificaram que o óleo essencial de A. conyzoides aplicado em dosagens superiores a 0,5%, foi capaz de matar 100% dos pulgões M. euphorbiae em roseira, caracterizando o potencial inseticida deste composto e justificando sua utilização como uma alternativa no controle de insetos-praga.

O óleo essencial de I. verum demonstrou ser tóxico aos pulgões, porém, em concentrações mais elevadas, com CL₅₀ de 51,80 e 40,50 µL óleo/cm² (24 e 48 horas) quando foram utilizadas folhas de sorgo, e de 51,80 µg óleo/cm² (24 horas), com a utilização de discos de papel-filtro (Tabela 2). Os valores de CL₁₀ e CL₉₀ no ensaio com folha de sorgo foram, respectivamente, 24,60 e 110,00 µL óleo/cm² (24 horas) e 14,90 e 109,00 µL óleo/cm²(48 horas), e com papel-filtro, de 24,60 e 109,00 µL óleo/cm² (24 horas) (Tabela 2).

Observa-se que independentemente do tipo da superfície contaminada, elevadas taxas de mortalidade são encontradas quando os pulgões S. graminum entram em contato com o óleo essencial de I. verum, caracterizando-o como promissor para o controle desse pulgão. Similarmente, ^{SOARES et al.(2012)} também comprovaram que o óleo essencial de I. verum apresenta ação inseticida e foi capaz de controlar os pulgões M. euphorbiae em roseira. Esses resultados são concordantes com aqueles obtidos por ^{HO et al. (1997)}, os quais verificaram que ovos, larvas e adultos de Tribolium castaneum (Herbst) e S. zeamais, são suscetíveis quando estão em contato com superfícies tratadas com derivados de I. verum. ^{CHANG; AHN (2001)} concluíram que o fenilpropeno (E)-anetol, componente majoritário do óleo essencial de I. verum, é tóxico à Blattella germanica (L.) igualando-se a inseticidas sintéticos.

Semelhante ao óleo essencial de A. conyzoides (Tabela 2), verificou-se a toxicidade do óleo essencial de O. odorifera aos pulgões, com valores de CL₅₀ de 11,80 e 11,70 µL óleo/cm² (24 horas e 48 horas, respectivamente), no ensaio com folhas de sorgo, e de 103,00 µL óleo/cm² (24 horas) com o papel-filtro. Os valores de CL₁₀ foram de 3,26 e 3,16 µL óleo/cm² (24 e 48 horas em folha de sorgo) e 83,50 µL óleo/cm² (24 horas em papel-filtro), e os valores de CL₉₀ foram de 43,20 e 42,50 µL óleo/cm² (24 e 48 horas em folha de sorgo) e 127,00 µL óleo/cm² (24 horas em papel-filtro). Observa-se que no ensaio com papel-filtro as concentrações letais foram superiores, demonstrando serem menos tóxicas nessa forma de contaminação em relação à contaminação em folhas de sorgo. Provavelmente, a diferença encontrada entre os valores de CL nos dois substratos está relacionada à maior exposição durante o caminhamento e/ou pelo ato de introdução do aparelho bucal na folha para alimentação.

Embora não se tenha conhecimento sobre estudos toxicológicos utilizando pulgões, resultados semelhantes aos da presente pesquisa foram obtidos por ^{Ngoh et al. (1998)} com os fenilpropanóides metil-eugenol e safrol, substâncias essas encontradas em abundância no óleo essencial de O. odorifera. Durante os ensaios de intoxicação por contato, esses autores concluíram que metil-eugenol e safrol apresentam efeito neurotóxico e provocam a morte de Periplaneta americana (L.). No caso específico de metil-eugenol, este composto apresentou efeito knockdown, de maneira semelhante aos inseticidas do grupo dos piretroides, sugerindo que o mesmo possa estar interagindo, direta ou indiretamente, com o processo de transmissão axônica. No caso do metil-eugenol, ^{HUANG et al. (2002)} também verificaram que esse composto possui ação tóxica sobre S. zeamais e T. castaneum.

Dentre todos, o óleo essencial de P. hispidinervum foi o menos tóxico aos pulgões, sendo a CL₅₀ no ensaio com folhas de sorgo contaminadas de 62,50 e 55,10 µL óleo/cm² (24 e 48 horas), e de 143,00 µL óleo/cm² em papel-filtro (24 horas). As demais concentrações letais foram: CL₁₀ de 41,40 e 29,20 µL óleo/cm² (24 e 48 horas; folha de sorgo) e 121,00 µL óleo/cm² (24 horas; papel-filtro). As CL₉₀ foram de 104,00 e 94,30 µL óleo/cm² (24 e 48 horas; folha de sorgo) e 170,00 µL óleo/cm² (24 horas; papel-filtro) (Tabela 2).

Comparando-se os valores de concentração letal do óleo de P. hispidinervum entre as duas superfícies contaminadas (24 horas), observou-se que no ensaio com folhas de sorgo os valores (CL₅₀) são substancialmente menores, em média 2,28 vezes em relação ao papel-filtro. Como observado com o óleo essencial de O. odorífera, sugere-se que a diferença entre os valores esteja relacionada à maior exposição dos pulgões ao óleo essencial durante o caminhamento e/ou alimentação, como também pelo modo de ação dos compostos. Considerando o aspecto comportamental e o desenvolvimento de A. gossypii, ^{ANDRADE et al. (2013)} verificaram que o óleo essencial de P. hispidinervum não afetou nem a repelência nem a quantidade de ninfas deste afídeo. Entretanto, conforme também observado em nosso estudo, ^{SOARES et al. (2012)} observaram que este óleo essencial foi tóxico para os pulgões M. euphorbiae, justificando que a ação inseticida está diretamente correlacionada com a presença do (E)-anetol. Toxicidade semelhante à observada neste trabalho foi obtida por ^{NGOH et al. (1998)}, após exporem P. americana ao contato com papel-filtro contaminado com safrol. Eles concluíram que esse composto majoritário do óleo essencial de P. hispidinervum é neurotóxico e induz ao knockdown. Em outro estudo, ^{HUANG et al. (1999)} concluíram que o safrol obtido em óleo essencial de P. hispidinervum possui potencial tóxico por contato e fumigação frente a S. zeamais e T. castaneum, além de apresentar efeito de deterrência para adultos de S. zeamais quando em concentrações superiores a 8,11 mg safrol/g de alimento.