Obtenção dos insetos

Os insetos foram coletados mediante o uso de armadilhas de papelão corrugado, envoltas em tubo plástico de acordo com a metodologia descrita por ^{COSTA-LEONARDO(2002)}. As armadilhas foram colocadas diretamente no solo, próximas a um tronco de abacateiro (Persea americana Mill) infestado de C. gestroi, localizado no bairro de Iputinga, Recife (PE). Posteriormente, as iscas com os cupins foram acondicionadas em laboratório, com temperatura aproximada de 26 ± 2°C, umidade acima de 60% e escotofase constante.

Obtenção, multiplicação e viabilidade dos isolados

Os isolados investigados de Isaria obtidos de diferentes hospedeiros e localidades (Tabela 1) foram mantidos na micoteca do Laboratório de Patologia de Insetos da UFRPE, após revigoramento em operários de C. gestroi.

Inicialmente, os isolados foram repicados para placas de Petri, contendo meio batata-dextrose-ágar mais antibiótico (BDA+A). Após sete dias foram feitas placas cheias contendo meio completo (MC), constituído de extrato de levedura, glucose, sais minerais, ágar e água destilada, sendo os isolados uniformemente espalhados por toda a extensão da placa, com o auxílio da alça de Drigalsky. As placas permaneceram em estufa incubadora B.O.D. a 26 ± 1°C, com fotofase de 12 horas para germinação e crescimento dos isolados.

Posteriormente, foram preparadas suspensões fúngicas, adicionando-se 10 mL de água destilada esterilizada mais espalhante adesivo Tween 80 (0,01%), sendo os conídios removidos com a ajuda de uma espátula de borracha. As suspensões resultantes, depois de filtradas em gaze esterilizada, foram aferidas e ajustadas para concentração de 10⁷ conídios mL^-1 _, mediante quantificação em câmara de Neubauer, utilizando-se microscópio óptico.

A viabilidade dos isolados foi avaliada segundo a metodologia descrita por ^{ALVES; MORAES(1998)}.

Verificação da patogenicidade e virulência dos isolados

Na avaliação da patogenicidade, para cada isolado, 70 operários de C. gestroi agrupados em uma placa de Petri (15 x 2,0 cm) foram pulverizados de maneira uniforme e simultânea, com 1 mL de suspensão a 10⁷ conídios mL^-1, utilizando-se microatomizador "Paasche Airbrush" elétrico, modelo "VL", acoplado a um compressor regulado para 5 libras de pressão. Na testemunha, os insetos foram pulverizados com água destilada e espalhante adesivo a 0,01%. Após a aplicação, com o auxílio de um pincel umedecido, os cupins foram transferidos em grupos de 10 para placas de Petri (9,0 cm) forradas com papel de filtro umedecido, contendo pedaços de papelão corrugado (2,0 x 2,0 cm), o qual servia como abrigo e fonte de alimento. Para a manutenção da umidade, as placas com os cupins eram fechadas com filme plástico. Os cupins tratados foram mantidos em temperatura ambiente 26 ± 2ºC e escotofase constante. O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado, com sete tratamentos e sete repetições, sendo cada parcela constituída por 10 operários.

A mortalidade foi avaliada diariamente, e os cupins mortos foram transferidos para câmara úmida, mantidos em B.O.D. a 26 ± 1°C e 12 horas de fotofase para confirmação do agente causal. Os dados de mortalidade média foram transformados em arco-seno √ (x + 0,5) e submetidos à análise de variância (ANOVA), utilizando o Proc ANOVA do SAS (^{SAS INSTITUTE, 1999-2001}); as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

Mediante os dados de mortalidade confirmada, determinou-se a porcentagem de sobrevivência média. Os dados foram submetidos ao teste Long-Rank, através do método Kaplan-Meyer por pares de isolados, usando o Proc Lifetest do SAS (^{SAS INSTITUTE, 1999-2001}).

Estimativa da CL₅₀

A partir dos resultados obtidos no teste de patogenicidade, um isolado de cada espécie foi selecionado para investigação da concentração letal. Suspensões dos isolados ESALQ-1205 de Isaria farinosa (=Paecilomyces farinosus) (Holmsk.) Fr., ESALQ-1296 de I. fumosorosea e URM-4995 de I. javanica foram ajustadas a 10⁵, 5x10⁵, 10⁶, 5x10⁶, 10⁷, 5x10⁷, 10⁸ conídios mL^-1e usadas para pulverizar os cupins, compondo os tratamentos. No grupo controle foi aplicada água destilada esterilizada e Tween (80) a 0,01%. Para cada tratamento foram utilizadas seis repetições com 12 operários pulverizados, com 1 mL de cada suspensão. Na preparação e aplicação das suspensões, determinação da viabilidade de conídios, acomodação dos cupins e avaliações, foi utilizada a mesma metodologia empregada no experimento de patogenicidade. A mortalidade foi avaliada por um período de quatro dias, e os insetos mortos foram transferidos para a câmara úmida, sendo mantidos em B.O.D. a 26 ± 1°C e 12 horas de fotofase para confirmação do agente causal. A partir dos dados de mortalidade confirmada estimou-se a CL₅₀, empregando-se o Proc Probit do programa estatístico SAS (^{SAS INSTITUTE, 1999-2001}).

Patogenicidade e virulência dos isolados

Os isolados de Isaria spp. testados apresentaram viabilidade superior a 95%, o que demonstra a alta capacidade germinativa dos mesmos. As mortalidades obtidas através dos isolados de I. farinosa, I. javanica e I. fumosorosea foram superiores a 70%, enquanto na testemunha esta porcentagem foi inferior a 10%, não sendo necessário corrigir a mortalidade, demonstrando que todos os isolados são patogênicos ao cupim C. gestroi, capazes de desencadear doença e levar à morte. Contudo, os valores de mortalidade confirmada diferiram significativamente entre o isolado ESALQ-1297 de I. fumosorosea, que ocasionou 70,24% de mortalidade, e os isolados ESALQ-1205 de I. farinosa e URM-4995 de I. javanica, que causaram mortalidades de 97,14 e 100%, respectivamente (Tabela 2).

A sobrevivência, ou seja, o tempo de vida dos cupins após receberem o tratamento com as suspensões fúngicas, nas condições de laboratório previamente relatadas, foi demonstrada em média (Tabela 2) e em sobrevivência diária (Fig. 1). Ambas indicam a intensidade ou o grau com que o patógeno causa a enfermidade. Com o tratamento fúngico, os cupins apresentaram uma sobrevivência média de 2,0 a 3,9 dias, diferindo significativamente entre os isolados, e destes com o grupo controle, que apresentou valor médio de sobrevivência de 13,7 dias (Tabela 2). Os isolados se comportaram como um patógeno rápido sobre o hospedeiro, e, portanto também são adequados como inseticidas microbianos em introdução inundativa (^{ALVES; LEUCONA, 1998}).

Figura 1 Sobrevivência diária (%) do cupim Coptotermes gestroi tratado com isolados de Isaria spp. avaliada até a morte do ultimo indivíduo. 

Diferenças na sobrevivência diária entre o grupo controle e os tratamentos reforçam o efeito patogênico dos isolados sobre o cupim C. gestroi. Observou-se tempo de vida de até 35 dias para os cupins pertencentes ao grupo controle, e de no máximo 7 dias nos tratamentos (Fig. 1). Já a variação na sobrevivência entre os isolados indica diferentes níveis da doença ocasionada por eles, sendo que os isolados ESALQ-1297 de I. fumosorosea e ESALQ-1355 de I. farinosa sobrepõem-se e são responsáveis por maior tempo de vida em relação aos demais isolados, demonstrando menor agilidade no processo de infecção (Fig. 1).

Assim, de acordo com os dados de mortalidade e sobrevivência apresentados, pode-se afirmar que os isolados ESALQ-1205 de I. farinosa, ESALQ-1296 de I. fumosorosea e os isolados URM-4995 e URM-4993 de I. javanica mostraram-se mais virulentos sobre o cupim C. gestroi, ocasionando percentuais elevados de mortalidade em menor período de tempo.

Embora os isolados de I. javanica tenham se destacado entre os mais virulentos, o estudo de aspectos morfológicos desses dois isolados, também sobre C. gestroi, constatou maior crescimento da colônia de URM-4995 (^{LOPES et al., 2011}), confirmando a sua indicação, visto que tal característica favorece a disseminação entre os cupins.

Quanto ao I. fumesorosea, este tem demonstrado ser eficiente sobre outras espécies de Coptotermes, chegando a ocasionar 100% de mortalidade sobre Coptotermes formosanus (Shiraki) (^{YANAGAWAet al., 2008}; ^{MEIKLE et al., 2005}). Testes avaliando a sobrevivência de C. formosanus pulverizados com I. fumesorosea comprovaram que este é até mais virulento do que o produto comercial à base do fungo M. anisopliae (^{MEIKLEet al., 2005}), e ocasiona maior mortalidade aos térmitas do que este patógeno (^{WRIGHT; CORNELIUS, 2012}). Uma formulação à base de blastosporos de I. fumesorosea, com uso de queratina hidrolisada como surfactante, também já foi testada, patenteada e recomendada para o controle de C. formosanus (^{DUNLAPet al., 2007}, ²⁰¹²). Estudos de comportamento realizados recentemente mostraram ainda que este fungo não é repelente a operários desses térmitas, o que os tornam altamente suscetíveis à infecção (^{HUSSAINet al., 2010}; ^{WRIGHT; CORNELIUS, 2012}), sugerindo possibilidade de utilização na forma de isca.

Embora existam diversos estudos a respeito do potencial no controle de térmitas com I. fumesorosea e poucos estudos com I. javanica, micoinseticidas à base de linhagens dessas duas espécies já foram patenteadas nos Estados Unidos, para o controle de cupins subterrâneos (^{WRIGHTet al., 2003}, ²⁰⁰⁸). Contudo, estudos a respeito de I. farinosa para o controle de térmitas são raros, ou mesmo inexistentes. Desta forma, acredita-se que este trabalho seja o primeiro, ou um dos poucos, a registrar o potencial desta espécie de Isaria no controle desses insetos.

Durante as avaliações diárias foi possível observar, em todos os tratamentos e na testemunha, um comportamento de ataque, caracterizado pela presença de operários de C. gestroi com a cabeça separada do corpo, ou somente a cabeça. Esse ataque faz parte de um conjunto de comportamentos de defesa contra esse tipo de patógeno, também registrado nesse mesmo gênero de cupim, tratado com Isaria (^{YANAGAWAet al., 2011}). Demonstra a tentativa de remover o material recém-aplicado, já que os ataques se concentraram basicamente nas primeiras 24 horas.

Estimativa da CL₅₀

Como os isolados das três espécies estudadas se destacaram na avaliação da virulência, um isolado de cada espécie foi selecionado para investigação da concentração letal. Estimou-se, portanto, a CL₅₀para os isolados ESALQ-1205 de I. farinosa, URM-4995 de I. javanica e ESALQ-1296 de I. fumosorosea, resultando em valores de 3,7 x 10⁵, 1,4 x 10⁶ e 2,7 x 10⁶conídios mL^-1, respectivamente. Estes diferem entre si pelo intervalo de confiança, contudo, nas curvas de concentração de mortalidade não foi observada diferença em relação à inclinação das retas (Tabela 3). Tais resultados corroboram os dados de mortalidade já apresentados, indicando não haver diferença na mortalidade ocasionada pelos isolados. Assim, confirma a eficiência sobre os operários de C. gestroi e demonstra que pode ser usado em uma dosagem menor, tornando-se mais econômico no caso de uma possível aplicação em campo.