Listeria spp. em carpaccio de carne bovina e perfil de resistência aos agentes antimicrobianos

Listeria ssp. in beef carpaccio and resistance profile to antimicrobial agents

Resumos

O presente estudo foi conduzido com o objetivo de veri-ficar a ocorrência de Listeria spp. em 50 amostras de carpaccio de carne bovina comercializados em bares e restaurantes do município de Niterói, Rio de Janeiro, e avaliar o perfil de resistência dos isola-dos aos agentes antimicrobianos utilizados no tratamento de infec-ções. Constataram-se que 20% das amostras obtidas de restaurantes e 35% de bares estavam contaminadas com Listeria spp. Dentre as espécies, L. welshimeri foi isolada com maior frequência (81,82%), seguida de L. grayi, (13,66%) e L. monocytogenes(4,55%), sendo o ágar Oxford o meio de plaqueamento mais eficiente para isolamento. Foi verificada a ocorrência de resistência dos isolados frente a todos os agentes antimicrobianos testados, exceto à tetraciclina, diante da qual 95,5% dos isolados apresentaram sensibilidade. A multirresistência foi verificada em 68,75% das estirpes analisadas. Desta forma, concluiu-se que o consumo de carpaccio de carne bovina representa risco potencial, constituindo um grave problema de saúde coletiva, especialmente devido à confrmação de estirpes patogênicas e resistentes aos principais agentes antimicrobianos utilizados no tratamento de listeriose.

antimicrobianos; bares; higiene; Listeria monocytogenes ; restaurantes; segurança alimentar

The present study was conducted to verify the occurrence of Listeria spp. in 50 samples of beef carpaccio sold in bars and restaurants; and to evaluate the resistance profile to antimicrobial agents used in the routine treatment of infections. It was found that 20% of samples from restaurants and 35% from bars were contaminated with Listeria spp. Among the species, L. welshimeri was most frequently isolated (81.82%), followed by L. grayi, (13.66%) and L. monocytogenes(4.55%). The Oxford agar plating medium was the most efficient. The resistant behavior occurred to all antimicrobial agents tested, except tetracycline, to which 95.5% of the strains were sensitive. Multidrug resistance was observed in 68.75% of the strains analyzed. Thus, it is concluded that the consumption of beef carpaccio represents a potential risk, and a serious public health problem, especially due to the confirmation of pathogenic strains that are resistant to major antimicrobial agents used in the treatment of listeriosis.

antibiotics; bars; hygiene; Listeria monocytogenes ; restaurants; food security

INTRODUÇÃO

A carne bovina é uma excelente fonte de proteínas de alto valor biológico, de vitaminas do complexo B e minerais essenciais, como ferro e zinco. O elevado valor nutritivo associado às características sensoriais excepcionais faz com que a carne seja considerada um dos alimentos mais valorizados pelo consumidor. Nos últimos anos, o carpaccio de carne bovina se tornou um produto muito popular, facilmente encontrado em bares e restaurantes, o qual consiste em finas fatias de carne crua, preparadas a partir do músculo semitendinoso dos bovinos, tradicionalmente ingerido cru, com azeite, queijo parmesão e especiarias diversas (Lucquin et al., 2012). Apesar do amplo consumo, os produtos cárneos, particularmente aqueles que passam por maior manipulação, constituem um excelente meio de cultura devido à elevada umidade, ao pH próximo da neutralidade e à composição rica em nutrientes, favorecendo a instalação, a sobrevivência e a multiplicação de microrganismos capazes de provocar doenças, como Listeria spp., que se desenvolvem na carne estocada sob temperatura de refrigeração (Ordóñez, 2005; Mantilla et al., 2007).

O gênero Listeria spp. é composto por bastonetes gram positivos, não produtores de esporos e anaeróbios facultati-vos, cuja transmissão pode ocorrer tanto por contato direto quanto indireto com fontes contaminadas, por via oral, ocular, cutânea, respiratória e urogenital (Holt et al., 1994). Entretanto, a transmissão por ingestão de alimentos contaminados parece ser a forma mais importante, visto que espécies de Listeria têm sido isoladas de diferentes produtos, tais como leite cru e pasteurizado, queijos, carne bovina, carne moída de diferentes animais, produtos cárneos crus e também de equipamentos e utensílios em plantas de pro-cessamento de carne bovina (Barros et al., 2004; Franco; Landgraf, 2007; Kovacevic et al., 2012; Mantilla et al., 2007; Soriano et al., 2001; Yücel et al., 2005). Essas bac-térias estão envolvidas em um grande número de surtos de origem alimentar por todo o mundo; e os alimentos mais incriminados são aqueles prontos para consumo, que são armazenados por longos períodos em refrigeração, principalmente os produtos cárneos (Ingham et al., 2004).

Dentre as espécies, Listeria monocytogenes é considerada a mais patogênica para os humanos e determina doença cujos sintomas incluem septicemia, meningite, encefalite e infec-ção cervical ou intrauterina em gestantes, que pode provocar abortamento. Outros danos podem ocorrer, como endocardite, abscessos, lesões cutâneas, além de sintomas gastrointestinais e outros semelhantes aos da gripe (Silva et al., 2010). Essa espécie é considerada um patógeno emergente capaz de ocasionar doenças por meio da ingestão de alimentos contaminados, principalmente aqueles que não foram submetidos a tratamento térmico antes do consumo, como o carpaccio. Esse alimento, além de possuir maior área de superfície e de ser altamente manipulado, possibilitando o crescimento bacteriano, permite o desenvolvimento de bactérias psicro-trófcas patogênicas como Listeria spp., pois permanecem estocados sob temperatura de refrigeração até o consumo (Mantilla et al., 2007).

A preocupação é ainda maior quando se trata de estirpes resistentes aos principais agentes antimicrobianos utilizados no tratamento da listeriose, confgurando um problema adicional que difculta o combate às infecções alimentares, gerando um risco considerável para saúde coletiva (Mantilla et al., 2008a).

Sendo assim, objetivou-se com o presente estudo pesquisar a ocorrência de estirpes de Listeria spp. em carpaccios de carne bovina comercializados em bares e restaurantes locais, comparar a efciência de isolamento em diferentes meios de cultivo e avaliar o perfl de resistência das estirpes isoladas aos agentes antimicrobianos utilizados na rotina do tratamento de infecções alimentares.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram coletadas aleatoriamente 50 amostras de carpaccio de carne bovina, em 20 bares e 30 restaurantes do municí-pio de Niterói, no estado do Rio de Janeiro, nas condições oferecidas ao pronto consumo, no período de 2011 a março de 2012. O estudo observacional foi delineado de modo transversal onde cada amostra correspondeu a um estabelecimento. Para o cálculo amostral foi utilizado o método de amostragem descrito por Di Giacomo; Koepsell (1986) e Manrtin et al. (1987), baseando-se na prevalência previamente estimada de 15% com probabilidade de erro de 10%, encontrada em trabalhos semelhantes anteriormente revisados.

Para a colheita foram utilizados utensílios sanitizados com álcool a 70% e as amostras de carpaccio, sem molhos e temperos, foram acondicionadas em embalagens plásticas estéreis (Bag Light® 001574) devidamente fechadas e identificadas. As embalagens contendo as amostras foram acondicionadas em recipiente isotérmico contendo sachês de gelo em gel reutilizáveis, e encaminhadas ao Laboratório de Controle Microbiológico da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal Fluminense, onde permaneceram estocadas a 4° até a realização das análises bacteriológicas em no máximo 24 horas após a colheita, respeitando os limites propostos pelo Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Midura; Bryant, 2001).

Preparo e diluição das amostras

No interior da 3câmara asséptica, as amostras foram abertas com assepsia na zona de segurança da chama do bico de Bunsen. Com auxílio de instrumentos fambados ao rubro e esfriados, foram retirados e pesados em balança (Martec® LC1) 25 gramas da amostra e adicionados em 225 mL de caldo Universidade de Vermont modifcado (UVM) (Difco® 222330), em emba-lagem estéril para homogeneização em stomacher (Seward®80) em velocidade de 265 rpm (±5%), durante 2 minutos.

Identifcação e isolamento de Listeria spp.

O método analítico utilizado é descrito pela Instrução Normativa n° 62 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (Brasil, 2003), sendo que foram empregados dois meios alternativos para plaqueamento seletivo de Listeria spp.

A amostra previamente preparada, adicionada do caldo UVM e cominuída, foi incubada em estufa a 30° por 24 horas, para posteriormente ser transferido 0,1 mL da cultura para tubos contendo 10 mL de caldo Fraser (Acumedia® 7502A) adicionado de 0,1 mL do suplemento SR156 (Oxoid® X4196B) e incubado a 30° por 48 horas. Após período de incubação foi verificada a ocorrência do escurecimento do meio, sendo que nos casos positivos os tubos inoculados seguiram para o plaqueamento diferencial.

O inóculo de 10 mL proveniente de cada tubo de caldo Fraser positivo foi estriado em placas contendo 3 diferentes meios, o ágar Triptose (Himedia® M177) suplementado com ácido nalidíxico (ATN), o ágar Oxford (Himedia® M1145) adicionado do suplemento SR140E (Oxoid®X3813B) e o ágar Mc Bride Listeria (MMA) (Bacto® 0922176) suplementado com cicloheximida seguindo-se de incubação a 30° por 48 horas. A confrmação bioquímica foi realizada por meio da verifcação da produção de catalase, observação das características morfotintoriais, verifcação do crescimento típico em meio semissólido, verifcação da incapacidade de redução de nitrato e verifcação da positividade nas reações de vermelho de metila e Voges Proskauer (VM-VP), conforme preconizado em legislação (Brasil, 2003).

Diferenciação entre espécies

As culturas que tinham confirmado as características do gênero Listeria foram submetidas a testes para identifcação das espécies por meio das seguintes provas bioquímicas: produção de alfa-hemólise, CAMP teste e fermentação dos carboidratos manitol, ramnose e xilose (Brasil, 2003).

Teste de resistência aos antimicrobianos

Após identifcação, as culturas foram testadas quanto à sua resistência aos agentes antimicrobianos, conforme descrito por Bauer et al. (1966), com utilização de discos comer-ciais (Polisensidisc® 4x6 DME) impregnados com os compostos clindamicina (2 μg), eritromicina (15 μg), oxacilina (1 μg), penicilina G (10 μg), teicoplamina (30 μg), vancomicina (30 μg), aztreonam (30 μg), cefoxitina (30 μg), ceftriaxona (30 μg), gentamicina (10 μg), cloranfenicol (30 μg) e tetraciclina (30 μg). A leitura dos resultados foi realizada medindo o tamanho das zonas de inibição de crescimento bacteriano com um halômetro, sendo a estirpe bacteriana classifcada como resistente, intermediária e sensível, de acordo com o diâmetro da zona padrão estabelecida na tabela fornecida pelo laboratório fabricante dos antimicrobianos.

Avaliação estatística

Os dados e resultados foram avaliados por meio do programa SPSS Statistics 17 (Windows & Mac), utilizando o teste exato de Fisher para avaliação das análises de propor-ção de amostras contaminadas, nos grupos bar e restaurante. Para a comparação da efciência dos meios utilizados na determinação da positividade para Listeria spp. utilizou-se o teste de McNemar. Em todas as análises foi adotado um nível de signifcância de 5%.

RESULTADOS

De acordo com os resultados das análises, 20 e 35% das amostras obtidas, respectivamente, em restaurantes e bares, estavam contaminadas com Listeria spp. Não houve diferença estatís-tica significativa (p=1,000) quanto à proporção de amostras contaminadas entre bares e restaurantes.

Com relação à incidência de espécies de Listeria, foram isoladas 22 estirpes, sendo: L. welshimeri isolada com maior frequência, representada por 81,82% (18/22 estirpes), seguida por L. grayi, com 13,66% (3/22 estirpes) e L. monocytogenes com 4,55% (1/22). Não foram encontradas as espécies L. ivanovii, L. innoccua e L. seeligeri.

É necessário ressaltar que das 22 estirpes identifcadas, 19 foram isoladas por plaqueamento em meio seletivo Oxford, representando 86,4%, sendo esse o meio mais eficiente para o isolamento de Listeria spp. em carpaccio de carne, neste estudo. O ágar MMA apresentou uma frequência de isolamento reduzida, apenas 3 estirpes, correspondendo a 13,6%. O ágar ATN, apesar de ser o meio recomendado pelo método oficial para realização da análise de L. monocytogenes em produtos cárneos (Brasil, 2003), não se mostrou eficiente neste trabalho. Estatisticamente, houve diferença significativa entre os isolamentos realizados com o ágar Oxford e o ágar MMA (p=0,039), sendo o ágar Oxford considerado o mais efciente.

As estirpes isoladas e identificadas foram submetidas ao teste de sensibilidade aos agentes antimicrobianos, cujos resultados constam na Tabela 1.

Tabela 1
Comportamento das espécies de Listeria isoladas de carpaccio, frente aos agentes antimicrobianos.

Antimicrobiano	Comportamento
	Resistente n (%)	Intermediário n (%)	Sensível n (%)
Clindamicina	5 (22,7)	10 (45,5)	7 (31,8)
Eritromicina	4 (18,2)	2 (9,1)	16 (72,7)
Oxaciclina	4 (18,2)	1 (4,5)	17 (77,3)
Penicilina G	4 (18,2)	–	18 (81,8)
Teicopamina	2 (9,1)	–	20 (90,9)
Vancomicina	2 (9,1)	–	20 (90,9)
Aztreonam	14 (63,6)	3 (13,6)	5 (22,7)
Cefoxitina	2 (9,1)	1 (4,5)	19 (86,4)
Gentamicina	1 (4,5)	–	21 (95,5)
Tetraciclina	–	1 (4,5)	21 (95,5)
Cloranfenicol	3 (13,6)	–	19 (86,4)
Cefriaxona	12 (54,5)	2 (9,1)	8 (36,4)

As estirpes de Listeria spp. foram resistentes, com variações de percentuais, a todos os agentes antimicrobianos testados, exceto à tetraciclina, sendo que na presença desse composto os isolados apresentaram sensibilidade em graus variados. Nota-se que a maior resistência ocorreu frente aos antimicrobianos aztreonam e ceftriaxona, e que 68,75% das estirpes apresentaram comportamento multirresistente, ou seja, apresentaram resistência a dois ou mais agentes antimicrobianos.

DISCUSSÃO

Tendo em vista que, no Brasil, não há padrão estabelecido em legislação para Listeria spp. em produtos de origem animal, a simples presença do micro-organismo no alimento pode ser considerada de alto risco aos consumidores. Corroborando os resultados encontrados, muitos autores comprovam a presença frequente de Listeria spp. em produtos de origem animal, como Soriano et al. (2001), que avaliaram alimentos crus e prontos para o consumo provenientes de restaurantes e verifcaram a presença de Listeria spp. em 30% das amostras. Mantilla et al. (2007), analisando amostras de carne bovina moída resfriada, obtiveram uma frequência de 50% das amostras contaminadas com Listeria spp. De forma semelhante, Kovacevic et al. (2012)encontraram 20% das amostras de alimentos prontos para consumo contaminados com esse micro-organismo.

Em plantas de processamento de carne bovina, a conta-minação por Listeria spp. e a presença de L. monocytogenesem equipamentos e/ou utensílios também podem representar alto risco pela possibilidade de incorporação do pató-geno ao produto final. Tal fato pode servir como subsídio para órgãos oficiais de saúde na adoção de medidas necessá-rias para eliminação ou redução de riscos associados a esse patógeno, além de conscientização do pessoal envolvido no processamento da carne, incentivando as boas práticas na manipulação (Barros et al.,2004).

Assim como verificado no presente estudo, Kovacevic et al. (2012) também comprovaram que a L. welshimeri foi a espécie isolada com maior frequência, com 50% do total de listerias. Em contra partida, Soriano et al. (2001) encontraram apenas 1,9% de L. welshimeri, tendo como a espécie mais frequente a L. grayi, com 13,6% em alimen-tos crus e prontos para o consumo. A baixa ocorrência de L. monocytogenes também foi reportada no trabalho de Yücel et al. (2005), que relataram uma frequência reduzida dessa espécie em carnes bovinas, moídas e inteiras, e carne de frango, sendo que somente 6,16% das amostras estavam contaminadas. Samadpour et al. (2006) e Mantilla et al. (2007) também observaram uma quantidade pequena de carnes moídas contaminadas com L. monocytogenes, 3,5 e 6,7% respectivamente. Apesar das baixas ocorrências, verifca-se que esses alimentos ainda representam risco para saúde dos consumidores.

Com relação aos ágares de isolamento para Listeria spp., Mantilla et al. (2008b)compararam três meios de plaqueamento: o ágar lithium chloride phenylethanol moxalactam (LPM), o ágar MMA e o ágar Oxford. E, de acordo com os resultados apresentados, o ágar Oxford, assim como neste trabalho, foi caracterizado como mais eficiente para o isolamento de L. innocua e L. monocytogenes, sendo que no ágar LPM não ocorreu o isolamento de nenhuma colônia de L. innocua e no ágar MMA nenhuma de L. monocytogenes.

Considerando o perfil de resistência antimicrobiana, Yücel et al. (2005) também isolaram espécies de Listeria, oriundas de carne bovina e produtos cárneos, evidenciando a multirresistência a mais de um agente antimicrobiano, principalmente frente à ampicilina, cefalotina e ácido nali-díxico. Mantilla et al. (2008a) estudaram a resistência de Listeria spp. isoladas de carne moída e verificaram que todas as estirpes de L. monocytogenes apresentaram resistência aos antimicrobianos clindamicina, oxaciclina, gentamicina, sulfa-zotrim, cefoxitina e ampicilina. Também foram encontradas estirpes dessa mesma espécie resistentes a outros antimicrobianos indicados no tratamento da listeriose humana como, por exemplo, a tetraciclina e a eritromicina. Dos isolados testados, 100% foram resistentes a dois ou mais antimicro-bianos. Ruiz-Bolivar et al. (2011), analisando alimentos provenientes de diferentes cidades da Colômbia, verifcaram alta resistência das estirpes de Listeria frente à clindamicina, rifampicina, ciprofoxacino e a antimicrobianos de primeira escolha contra listeriose.

A existência de estirpes de Listeria spp. resistentes aos antimicrobianos utilizados rotineiramente no tratamento da listeriose humana representa um sério problema para a saúde coletiva, principalmente para os indivíduos que fazem parte do grupo de risco da listeriose, que incluem os idosos, crianças, mulheres grávidas e imunodeprimidos (Mantilla et al., 2008a).

CONCLUSÕES

Os resultados aqui apresentados contribuem como dados sobre a exposição e a incidência de Listeria spp. em carpaccios de carne bovina comercializados em bares e restaurantes. Tendo em vista as avaliações de riscos recentes de L. monocytogenes em alimentos, pode-se inferir que há um risco considerável para os consumidores desse produto em adquirir a listeriose. O consumo de carpaccios, que não são produtos submetidos a tratamento térmico, pode representar um risco particular se não forem manipulados corretamente e armazenados adequadamente sobre refrigeração.

A espécie isolada com maior frequência foi L. welshimeri, seguida da L. grayi e L. monocytogenes, sendo o ágar Oxford o meio de plaqueamento mais efciente para isolamento de Listeria spp. Pelo exposto, sugere-se a inclusão do ágar Oxford como meio indicado para o isolamento de Listeria spp. de produtos cárneos, como o carpaccio.

A confirmação de estirpes resistentes aos principais agentes antimicrobianos utilizados no tratamento de listeriose e a alta taxa de multirresistência constituem um grave problema de saúde coletiva, especialmente para indivíduos que fazem parte do grupo de risco. A possibilidade do aparecimento de bactérias com potencial patogênico, selecionadas quanto ao caráter de resistência aos antimicrobianos, reforça a importância das pesquisas envolvendo micro-organismos emergentes associados a perfis de resistência.

AGRADECIMENTOS

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo apoio fnanceiro.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Dez 2014

Histórico

• Recebido
  07 Jan 2013
• Aceito
  24 Set 2014