Avaliação in vitro da adsorção de aflatoxina B₁ por produtos comerciais utilizados na alimentação animal

In vitro evaluation of aflatoxin B₁ adsorption by commercial products used in animal feed

RESUMO:

Objetivou-se avaliar a capacidade de adsorção in vitro de aflatoxina B₁ (AFB₁) por produtos comerciais utilizados na alimentação animal. Muitas pesquisas estão sendo realizadas para a descontaminação de AFB₁ em alimentos. Os produtos comerciais utilizados frequentemente na alimentação de peixes, disponíveis na forma de probióticos, são formados por cepas de bactérias e leveduras utilizadas na maioria dos ensaios de adsorção de micotoxinas. Foram utilizados três produtos comerciais: A, composto por Bacillus subtilis, Bifidobacterium bifidum, Enterococcus faecium e Lactobacillus acidophilus; B, por leveduras secas de Saccharomyces cerevisiae provenientes de cervejaria; e C, por Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis e Bacillus pumilus. Cinco suspensões da dose máxima recomendada pelo fabricante de cada produto (0; 25; 50; 75 e 100%) foram testadas contra AFB₁ (1000 ng.mL^-1) em microtubos para determinação da capacidade de adsorção. Para simular o pH do estômago e do intestino de tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus) foram formuladas soluções tampão fosfato salino (PBS), com pH 1,5 e 7,5; respectivamente. Os microtubos foram introduzidos em uma centrífuga com agitação mecânica, a 37ºC por 1 h e depois centrifugados por 10 min a 14.000 rpm; os sobrenadantes foram quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência. Os produtos comerciais, nas concentrações máximas, foram capazes de adsorver AFB₁ em quantidades de 45,01 a 129,59; 123,90 a 215,59 e 209,98 a 370,73 ng.mL^-1, respectivamente. Concluiu-se que todos os produtos comerciais analisados adsorvem AFB₁ em condições simuladas de pH gastrointestinal e são candidatos potenciais para adsorção de AFB₁ para futuros ensaios in vivo.

PALAVRAS-CHAVE:
Bacillus sp.; bactérias ácido-láticas; detoxificação; Saccharomyces cerevisiae; tilápia do Nilo

ABSTRACT:

The aim of this study was to evaluate the aflatoxin B₁ (AFB₁) adsorption capacity, in vitro, by commercial products used in animal feed. Many studies are being conducted for the decontamination of aflatoxins in feed. The commercial products destined to fish feed that are available as probiotics and are formed by strains of bacteria and yeasts used in most mycotoxins adsorption assays. Three commercial products were studied: A, consisting of Bacillus subtilis, Bifidobacterium bifidum, Enterococcus faecium and Lactobacillus acidophilus; B, consisting of dry yeast of Saccharomyces cerevisiae from brewery; and C, consisting of Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis and Bacillus pumilus. Five suspensions of the maximum dose recommended by the manufacturer of each product (0; 25; 50; 75 and 100%) were tested against AFB₁ (1000 ng.mL^-1) in microtubes to determine the adsorption capacity. To simulate the pH of the stomach and intestine of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus), phosphate buffered saline solutions (PBS) at pH 1.5 and 7.5, respectively, were formulated. Microtubes were introduced into a centrifuge with mechanical agitation at 37ºC for 1 h and then centrifuged for 10 min at 14.000 rpm; the supernatants were quantified by high-performance liquid chromatography. The commercial products in the maximum concentration were capable of adsorbing AFB₁ in amounts from 45.01 to 129.59; from 123.90 to 215.59; and from 209.98 to 370.73 (ng.mL^-1), respectively. It was concluded that all commercial products, which are added to animal feed, adsorbed AFB₁ under simulated gastrointestinal pH conditions and are potential candidates for AFB₁ adsorption for future in vivo studies.

KEYWORDS:
Bacillus sp.; lactic acid bacteria; detoxification; Saccharomyces cerevisiae; Nile tilapia

INTRODUÇÃO

Micotoxinas são metabólitos secundários produzidos por algumas espécies de fungos filamentosos e sua ingestão pode ocasionar danos ao desempenho e à saúde dos animais. As aflatoxinas (AFs) são as micotoxinas mais predominantes nos ingredientes usados nas rações para animais no Brasil e no mundo (KUBITZA, 2010). Os principais fungos produtores de AFs fazem parte do gênero Aspergillus, principalmente as espécies A. flavus, A. parasiticus e A. nominus. A aflatoxina B₁ (AFB₁) destaca-se por ser tóxica para os animais, com potencial carcinogênico, mutagênico, teratogênico, hepatotóxico e imunossupressor (KLICH, 2007). Alimentos para animais aquáticos contaminados com AFs podem causar anormalidades que resultam na queda da produtividade do cultivo (GOPINATH et al., 2012). A tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), principal espécie de peixe cultivada no Brasil (BRASIL, 2010), é sensível à contaminação por AFs, caracterizada pela ocorrência de quadros de caquexia, despigmentação das escamas, icterícia e lesões hepáticas, responsáveis por gerar prejuízos econômicos em seu cultivo (KUBITZA, 2010).

Os aditivos antimicotoxinas (AAM) incluem os produtos que, quando adicionados a alimentos para animais, sejam capazes de adsorver, inativar, neutralizar ou biotransformar micotoxinas. O controle biológico tem proporcionado resultados promissores para a descontaminação de AFs sem alterar as características do alimento (BARBOSA et al., 2005). Dentre as categorias de produtos à base de micro-organismos, existem os probióticos e os suplementos dietéticos. De acordo com FULLER (1989), os probióticos são suplementos alimentares de micro-organismos vivos que produzem efeitos benéficos no hospedeiro, favorecendo o equilíbrio de sua microbiota intestinal, além de auxiliar na diminuição das concentrações de substâncias tóxicas em ambientes de cultivo. Segundo SHETTY; JESPERSEN (2006), ingredientes básicos e suplementos dietéticos, tais como a levedura Saccharomyces cerevisiae, podem ter propriedades funcionais na dieta e apresentarem resultados satisfatórios quando adicionados à ração como células ativas ou como componentes de parede celular.

No Brasil, foi estabelecido um protocolo para reavaliação do uso de adsorventes de micotoxinas como aditivo autorizado para a alimentação animal. A proposta propõe a realização de testes in vitro simulando as condições do trato gastrointestinal de animais, utilizando pH 3,0 e 6,0 (BRASIL, 2006). No entanto, os níveis de pH de espécies aquáticas, especificamente de tilápias do Nilo, diferem dos estabelecidos no protocolo. Desse modo, é importante avaliar a eficiência da adsorção de micotoxinas em faixas de pH específicas para cada espécie.

Com base nos dados expostos, objetivou-se avaliar a capacidade antimicotoxina de produtos comerciais compostos à base de leveduras secas de cervejaria e de probióticos utilizados na alimentação animal para adsorção in vitro de AFB_1.

MATERIAL E MÉTODOS

O ensaio foi realizado no Laboratório de Nutrição Animal, do Departamento de Zootecnia, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Piauí. Para avaliação in vitro de produtos comerciais para adsorção de AFB₁ foram utilizados três produtos com formulação diferenciada (Tabela 1).

Tabela 1:
Composição e concentração testada de produtos comerciais para ensaio de adsorção in vitro de aflatoxina B₁.

• UFC: unidades formadoras de colônias.

Para simular o pH do estômago e intestino de tilápias do Nilo, foram formuladas soluções em tampão fosfato salino (PBS: NaCl 80 g, KCl 2 g, Na₂HPO₄ 14,4 g, KH₂PO₄ 2,4 g, água destilada em quantidade suficiente para 1.000 mL), sendo posteriormente ajustadas com adição de ácido clorídrico (HCl 0,1 N) para pH 1,5 e com hidróxido de sódio (NaOH 0,1 N) para pH 7,5, (ROTTA, 2003), respectivamente, sendo ambos ajustados por pHmetro digital (Labmeter Modelo pHS-3B). A AFB₁ (Sigma Aldrich^® Co., St. Louis, MO USA, pureza > 99%) utilizada foi diluída em acetonitrila para obtenção da concentração final de 1,0 µg.mL^-1 (1.000 ng.mL^-1). Para a obtenção da solução de trabalho (1.000 ng.mL^-1), a acetonitrila foi evaporada com nitrogênio gasoso e, em seguida, adicionaram-se soluções em PBS para cada pH.

O teste foi realizado com concentração única de AFB₁ (1.000 ng.mL^-1). As concentrações dos produtos utilizados corresponderam a 0; 25; 50; 75 e 100% da dose máxima recomendada por cada fabricante (Tabela 1). Também foram preparadas amostras em triplicata de controle positivo (AFB₁ em PBS com pH 1,5 e 7,5) e controle negativo (somente PBS) para realização dos cálculos de adsorção.

Foram transferidas para microtubos, alíquotas de 500 µL das soluções de PBS contendo as diferentes concentrações de cada produto comercial e acrescentaram-se 500 µL de AFB_1, obtendo-se um volume final de 1.000 µL, com concentração final de 1.000 ng.mL^-1 de AFB₁. As soluções nos microtubos foram homogeneizadas em agitador tipo Vortex e introduzidas em uma centrífuga com agitação mecânica a 200 rpm, a 37ºC por 1 h, para promover o contato entre a toxina e o produto comercial utilizado. A seguir, as amostras foram centrifugadas por 10 min a 14.000 rpm para ocorrer a separação da toxina livre da toxina unida ao produto comercial utilizado. Logo, recuperou-se a toxina livre presente no sobrenadante e realizou-se a detecção e quantificação de AFB₁.

Para a detecção e quantificação de AFB₁, utilizou-se um cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE) Shimadzu^®, modelo Prominence com detector de fluorescência modelo RF-10AXL Super, loop de 20 µL, com excitação e emissão de 360 e 460 nm, respectivamente (TRUCKSESS et al., 1994), equipado com coluna de fase reversa de sílica gel C18 (150 x 4,6 mm, 5,0 µm de tamanho de partícula, Phenomenex, Luna) conectada a uma pré-coluna Supelguard LC-ABZ (20 x 4,6 mm, 5,0 µm de tamanho de partícula, Supelco). Para análise, utilizou-se uma alíquota de 100 µL do extrato da amostra, que foi acrescida de 350 µL de solução derivatizante, composta por ácido trifluoroacético:ácido acético glacial:água (20:10:70 v/v). Como fase móvel, utilizou-se um sistema isocrático acetonitrila:metanol:água (17:17:66 v/v) a uma vazão de 1,5 mL.min^-1.

A curva de quantificação da toxina foi elaborada através da correlação das alturas dos picos do extrato da amostra com o da curva padrão (y=0,0003x-0,0077; R²=0,99). O limite de detecção do método analítico utilizado foi de 0,4 ng.g^-1, enquanto o de quantificação resultou em 1,2 ng.g^-1. As quantificações de AFB₁ adsorvidas foram realizadas pela equação a seguir, onde: A=[(B-C)xD]/E, sendo A=quantidade (ng.mL^-1) de toxina adsorvida pelo produto comercial; B=altura do pico cromatográfico da amostra; C=altura do pico cromatográfico do controle negativo; D=concentração (ng.mL^-1) do controle positivo; E=altura do pico cromatográfico do controle positivo.

Os tratamentos foram distribuídos em delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 2x3x5, sendo: 2 valores de pH (1,5 e 7,5); 3 produtos comerciais (A, B e C) e 5 concentrações (0; 25; 50; 75 e 100%), com 3 repetições por tratamento, totalizando 90 amostras. Os dados obtidos foram analisados segundo os procedimentos do software SAS 9.0 (SAS, 2009) e submetidos à análise de variância e comparação de médias pelo SNK, baseado no Lsmeans a 5% de probabilidade.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O ensaio in vitro de adsorção de AFB₁ foi realizado com base nas recomendações da proposta para registro de AAM do Grupo de Trabalho sobre Micotoxinas (BRASIL, 2006). A proposta do Grupo de Trabalho recomenda a utilização de valores de pH 3,0 e 6,0 para avaliação de AAM, porém, para adequar à fisiologia do estômago e intestino das tilápias do Nilo, foram realizadas adaptações de pH para 1,5 e 7,5; respectivamente. Além disso, foi utilizada solução de PBS como solução de reação do ensaio, de acordo com BOVO et al. (2011) e PEREYRA et al. (2012).

Nesta pesquisa, realizada para avaliar a capacidade de produtos comerciais adsorverem 1.000 ng.mL^-1 de AFB₁, observou-se um percentual de adsorção variável. Os produtos comerciais A, B e C; quando testados em pH 1,5 e 7,5; apresentaram percentuais de adsorção de AFB₁ que variaram de 0,5 a 37,1% (Tabela 2). A média dos valores do controle positivo (somente toxina AFB₁) em PBS com pH 1,5 foi de 998,54 ng.mL^-1;e em pH 7,5 se obteve o valor médio de 964,12 ng.mL^-1. No probiótico A, composto majoritariamente por bactérias ácido-láticas (BAL) (0,5 a 13,0%), e no B, formado por leveduras mortas secas da espécie S. cerevisiae (8,8 a 21,6%), os valores de adsorção foram menores, quando comparados aos resultados de PIZZOLITTO et al. (2011), que utilizaram concentração de 500 ng.mL^-1 e obtiveram valores de 11,8 a 67,6% para cepas de BAL e 18,4 a 65,7% para cepas de S. cerevisiae. Essa variação de resultados pode ter ocorrido pelo fato dos autores citados terem utilizado uma concentração menor de toxina e testado apenas cepas puras de bactérias e de leveduras, em contraste com este experimento, que foi realizado com produtos comerciais formulados para alimentação animal que continham várias cepas bacterianas e leveduras mortas secas da espécie S. cerevisiae.

Tabela 2:
Valores e percentuais de adsorção de 1.000 ng.mL^-1 de aflatoxina B₁ em dois valores de pH e diferentes concentrações de produtos comerciais utilizados na alimentação animal.

• ^a,b,c,d,eMédias na mesma coluna, para o mesmo produto e mesmo pH, seguidas da mesma letra minúscula diferem significativamente entre si pelo teste Student-Newman-Keuls (SNK) (p<0,05); ^A,Bmédias na mesma linha, para o mesmo produto e mesma concentração, seguidas da mesma letra maiúscula diferem entre si pelo teste SNK (p<0,05).

BOLOGNANI et al. (1997) relataram que cepas de S. cerevisiae na concentração mínima de 2 a 5x10⁹ unidades formadoras de colônia por mililitro (UFC.mL^-1) adsorveram de 13 a 50% de AFB₁. MALLMANN et al. (2006) obtiveram percentuais de adsorção de 90% em suco gástrico e intestinal, ao estudarem diversos compostos em avaliações in vitro. É possível que fatores como concentração dos micro-organismos utilizados, pH, concentração dos produtos e tempo de contato (EL-NEZAMI; AHOKAS, 1998; PIZZOLITTO et al., 2011) possam ter influência nos resultados de adsorção. Embora a quantidade média de cepas utilizadas nas formulações comerciais seja compatível com resultados satisfatórios obtidos por outros pesquisadores (EL-NEZAMI; AHOKAS, 1998; HASKARD et al., 2001), a atividade antimicotoxina dos produtos comerciais testados foi próxima à encontrada pelos autores citados.

Pode-se verificar que a melhor adsorção de AFB₁ ocorreu quando os produtos comerciais foram utilizados na concentração 100% (Tabela 2). Houve diferença significativa (p<0,05) entre a capacidade antimicotoxina dos produtos nas concentrações utilizadas, ocorrendo um aumento proporcional de adsorção quando eram adicionadas maiores concentrações desses produtos. Essa tendência não se aplicou ao probiótico C, que apresentou resultados semelhantes em concentrações 50 e 75%; e no produto B em pH 1,5, cujo percentual melhor foi em concentração 75%. Ensaios de adsorção frequentemente utilizam uma única concentração de AFB₁ (HASKARD et al., 2001), entretanto, a eficiência dos micro-organismos altera-se quando as concentrações de AFB₁ são modificadas (BUENO et al., 2007; PIZZOLITTO et al., 2011), tendo em vista que ocorrem oscilações naturais nos níveis de AFB₁ nos alimentos. Desse modo, além de avaliar diferentes concentrações de micotoxinas nos testes de adsorção, deve-se também analisar se diferentes concentrações de micro-organismos e de produtos comerciais interferem na atividade antimicotoxina. Os componentes das paredes microbianas possuem número limitado de polos de ligação para AFB₁ (PIZZOLITTO et al., 2011), e podem não apresentar disponibilidade para tal ligação devido a uma saturação dos polos (TAPIA-SALAZAR et al., 2010). Desse modo, a associação de diferentes tipos de micro-organismos utilizados na formulação de produtos comerciais permitiria uma maior disponibilidade desses polos de ligação.

De um modo geral, o pH 7,5 favoreceu a adsorção dos produtos comerciais em condições experimentais, com exceção do produto B, que apresentou adsorção semelhante na concentração 25% quando submetido ao pH 1,5 e pH 7,5 (Tabela 2). Entretanto, as bactérias que foram utilizadas na formulação dos probióticos testados estavam viáveis e poderiam crescer em ampla variação de pH (4,8 a 9,6), devido ao tempo de contato em temperatura favorável ao qual foram submetidas na fase inicial do experimento. Constatou-se que a eficiência da capacidade antimicotoxina dos produtos comerciais testados foi variável, sendo o probiótico C, composto por três cepas de Bacillus sp. (12,10 a 37,10%) mais eficiente do que o A, formado por BAL associada a B. subtilis (5,15 a 13,00%) e do que o B, composto por leveduras secas de cervejaria da espécie S. cerevisiae (8,80 a 21,60%). Esse fato pode ser comprovado pelas propriedades benéficas atribuídas à união das três espécies de Bacillus e pela maior concentração bacteriana presente (1,0x10¹⁰ UFC.g^-1). PIZZOLITTO et al. (2011) observaram que o aumento da concentração de bactérias ou leveduras, na presença de uma concentração fixa de AFB₁, promoveu um aumento na ligação desses compostos, mas ainda insuficiente para ligar todas as toxinas presentes.

Resultados eficientes de adsorção de AFB₁ foram encontrados por HAI (2006), em que cepas de B. subtilis foram eficazes como inibidores na produção e adsorção de AFB₁. Estudos com a utilização de espécies de Bacillus em alimentos mostram que esses possuem grande habilidade de adesão à parede intestinal, aumento de respostas imunológicas, enzimas hidrolíticas que degradam a parede celular de fungos patogênicos e são considerados importantes no controle biológico. BARBOSA et al. (2005) e GAO et al. (2011) obtiveram remoção de 81,5% de AFB₁ na concentração de 500 ng.mL^-1, para cepas isoladas de Bacillus e ainda demonstraram que essas possuem alta resistência ao simularem condições semelhantes do conteúdo estomacal e intestinal de animais, assim como também contra patógenos desse ambiente, entretanto, a adsorção de AFB₁ não foi avaliada em diferentes pH, nem o sinergismo entre as cepas.

O Brasil, por meio do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), estabelece o limite de 50 µg.kg^-1 de aflatoxinas para alimentos de consumo animal, matérias primas e rações (BRASIL, 1988). Sendo assim, os três produtos comerciais podem agir efetivamente na adsorção de AFB₁, já que os valores de incidência natural deveriam ser menores do que 50 µg.kg^-1 e adsorveram quantidades maiores do que as regulamentadas. Pesquisas realizadas em rações comerciais para pisciculturas relataram níveis de aflatoxinas que variaram de não detectáveis a 15,60 µg.kg^-1 (HASHIMOTO et al., 2003); desse modo, os produtos comerciais analisados poderiam ser úteis no processo de adsorção da toxina desses alimentos destinados à alimentação de peixes.

CONCLUSÕES

Produtos comerciais à base de leveduras secas de cervejaria e de probióticos formados por bactérias possuem capacidade de adsorção in vitro de AFB₁. Probióticos, à base de Bacillus sp., são mais eficientes do que os compostos principalmente por BAL e leveduras secas de cervejaria.

AGRADECIMENTOS

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão de bolsa de estudos para a realização deste trabalho e à Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro e Universidad Nacional de Rio Cuarto, Córdoba, Argentina, pela parceria científica.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  2017

Histórico

• Recebido
  27 Jan 2015
• Aceito
  04 Out 2016