Quitosana fúngica sobre larvas de nematoides gastrintestinais de caprinos

Fungal chitosan on gastrointestinal nematodes larvae of goats

RESUMO:

A caprinocultura é representada por um efetivo bastante considerável no Nordeste brasileiro, porém, infecções causadas por nematoides e o sério problema da resistência parasitária se tornaram barreiras para a criação desses animais. Como alternativa, o controle com bioprodutos entra como uma solução sustentável e viável para auxiliar na criação da região. Nesse contexto, o presente trabalho avaliou a atuação da quitosana fúngica sobre o desenvolvimento larval de nematoides gastrintestinais em amostras de caprinos naturalmente infectados. Para tanto, foi realizada a seleção de 5 propriedades e confirmada a positividade do rebanho, além de coproculturas com solução de quitosana a 0,5; 1,0 e 1,5%, com cada tratamento realizado em 5 repetições. As larvas de terceiro estágio (L3) foram recuperadas e cem larvas por tratamento foram contabilizadas e identificadas. Os gêneros identificados foram Haemonchus, Strongyloides, Oesophagostomum e Trichostrongylus. Na análise da inibição do desenvolvimento larval, a concentração de 1,0% impediu o desenvolvimento larval do Haemonchus em 35%, porém, os resultados não tiveram diferença estatística significante. Assim, sugere-se buscar novas concentrações de quitosana fúngica como anti-helmíntico, visto que se apresenta como uma alternativa promissora no controle sustentável desses endoparasitos.

PALAVRAS-CHAVE:
atividade larvicida; anti-helmínticos naturais; infecção parasitária

ABSTRACT:

The goat is represented by a very considerable effective in the Northeastern Brazil, but infections caused by nematodes and the serious problem of parasitic resistance have become barriers to breed these animals. Alternatively, the control with bioproducts comes as a sustainable and viable solution to help breeding in this region. In this context, the present study evaluated the performance of fungal chitosan on the larval development of gastrointestinal nematodes in naturally infected goat samples. Therefore, the selection was performed at five properties. The positive herd was confirmed, and coprocultures were performed with chitosan solution 0.5, 1.0 and 1.5%, with each treatment performed in 5 replicates. The third-stage larvae (L3) were recovered and one hundred larvae/treatment were counted and identified. The identified genera were Haemonchus, Strongyloides, Oesophagostomum and Trichostrongylus. In the analysis of inhibition of larval development, the concentration of 1.0% prevented the development of larval Haemonchus by 35%, but the results were not statistically significant. Thus, it is suggested to seek new concentrations of fungal chitosan as anthelmintic, since it appears as a promising alternative to sustainable control of these endoparasites.

KEYWORDS:
larvicidal activity; natural anthelmintics; parasitic infection

O agronegócio brasileiro vem ganhando ênfase no setor econômico do país por conta da obtenção de resultados comercialmente satisfatórios com destaque para a caprinocultura, ramo comercial em que a região nordeste concentra o maior rebanho, representando 90% do total nacional (PPM-IBGE, 2011). No entanto, a contaminação dos pequenos ruminantes por nematoides gastrintestinais interfere diretamente na sanidade do rebanho, ocasionando prejuízos para os produtores (PINHEIRO et al., 2000). Tal fato é agravado pelo uso intensivo de antiparasitários químicos, auxiliando no surgimento da resistência parasitária (MELO et al., 2003).

Nesse contexto, novas alternativas para o controle de nematoides estão sendo estudadas com resultados satisfatórios na obtenção de percentuais de redução efetivos nos casos de inibição in vitro da eclosão dos ovos (FARIAS et al., 2010; MACEDO et al., 2011; FUJIMOTO et al., 2012). Entre essas alternativas, a utilização de fungos se tornou promissora, em razão de sua capacidade de capturar, fixar e penetrar os nematoides, destruindo seus órgãos internos (ALVES et al., 2003; ARAÚJO et al., 2004; ARAÚJO et al., 2006; ARAÚJO et al., 2007). Provavelmente, essa atividade antiparasitária está relacionada à presença do copolímero quitina na parede celular dos fungos e leveduras (BATISTA et al., 2011).

Como exemplo da aplicação de fungos como agentes antiparasitários, a utilização da espécie Monacrosporium ­thaumasium em doses semanais de 2,0 a 2,5 g foi eficiente no controle de nematoides gastrintestinais de caprinos em regiões semiáridas, tornando o tratamento com anti-helmínticos desnecessário (ARAÚJO et al., 2007).

Com a quitina, por meio da desacetilação com álcalis ou enzimas, é obtido outro copolímero, a quitosana, um copolímero que, assim como a quitina, apresenta em suas unidades resíduos de N-acetil-2-amino-2-desoxi-D-glucose (glucosamina) e resíduos de amino-2-desoxi-D-glicose (N-acetil-glucosamina) (ARANAZ et al., 2010). A quitosana também pode estar naturalmente na parede celular de alguns fungos, especialmente aqueles pertencentes à classe dos Zygomycetes (KAFETZOULOS et al., 1993).

Dessa forma, com a manipulação e possíveis utilidades em crescimento ascendente desse polímero no campo do conhecimento da agricultura (BERGER et al., 2011) e pecuária, o presente trabalho avaliou o efeito da aplicação da quitosana fúngica sobre larvas de nematoides gastrintestinais de caprinos naturalmente infectados, a fim de prospectar bioprodutos alternativos relacionados ao controle das endoparasitoses em pequenos ruminantes.

O fungo extraído do solo Cunninghamella elegans foi inoculado em meio ágar extrato de levedura, peptona e dextrose (YPD) (10 g de extrato de levedura, 20 g de peptona bacteriológica, 20 g de glicose e 1.000 mL de água destilada) a 28ºC por 7 dias.

Após o cultivo fúngico, foi iniciado o processo de extração de quitosana. Os esporos foram coletados e armazenados em 15 mL de água destilada esterilizada (solução espórica), e 10⁵ esporos/mL da solução espórica foram adicionados em meio líquido YPD para crescimento da biomassa fúngica a 28ºC por 96 horas. Ao término dos 4 dias de agitação, a biomassa foi filtrada, seca em estufa a 60ºC, macerada em cadinho visando ao aumento da superfície de contato, característica necessária nas próximas etapas, e pesada em balança analítica. Em seguida, a biomassa foi tratada na proporção de 1:40 (m/v) de hidróxido de sódio (NaOH) a 1M, e foi colocada em autoclave a 121ºC por 15 minutos. Após essa fase, foram realizados ciclos de centrifugações de 15 minutos a 4.000 rpm, até atingir pH 7,0, sendo descartado o sobrenadante a cada ciclo.

Na última etapa da extração da quitosana, foi feita a precipitação em ácido acético 1%, na proporção de 1:100 (m/v). Essa solução foi colocada em autoclave no modo vapor fluente a 100ºC por 15 minutos, seguido por uma única centrifugação a 4.000 rpm por 15 minutos. Ao final da centrifugação, pôde-se perceber a separação da quitina (precipitado) e da quitosana (sobrenadante). O sobrenadante foi ajustado para pH 10 e deixado overnight a aproximadamente 4ºC em geladeira, levando a uma formação da nuvem de quitosana. Por fim, centrifugado a 4.000 rpm, sendo o precipitado coletado, liofilizado e guardado em ambiente com umidade regulada (HU et al., 1999).

Foram selecionadas aleatoriamente cinco propriedades rurais para coleta das amostras fecais. Para seleção dos animais, os critérios adotados foram: o diagnóstico positivo para parasitas gastrintestinais pela contagem do número de ovos por grama de fezes e ausência de tratamento anti-helmíntico por um período mínimo e antecedente de 3 meses (90 dias).

Após confirmação da positividade pelo teste do número de ovos por grama de fezes (GORDON; WHITLOCH, 1939; CHAGAS et al., 2011), as amostras fecais foram acondicionadas em pool, trituradas e homogeneizadas para retirada de 2 g de fezes e acréscimo de 2 mL da quitosana diluída, sendo a metodologia modificada daquela descrita por BATATINHA et al. (2011) com o acréscimo da quitosana.

As coproculturas por tratamento foram realizadas em cinco repetições e associadas a três controles, tendo como positivo o tiabendazol e negativo a água destilada e o ácido acético. As coproculturas foram feitas de acordo com a técnica proposta por UENO; GONÇALVES (1995). Após sete dias, as larvas de terceiro estágio foram extraídas e cem larvas contabilizadas e identificadas de acordo com identificação de UENO; GONÇALVES (1995).

A normalidade dos dados foi analisada aplicando-se o teste de normalidade Shapiro-Wilk, e as diferenças entre os grupos foram verificadas utilizando-se ANOVA com teste t de Tukey, considerando o nível de significância igual a 0,05. Averiguaram-se todos os dados com o auxílio do programa PAST (HAMMER; HARPER, 2012).

Os gêneros identificados foram: Haemonchus, Strongyloides, Oesophagostomum e Trichostrongylus, considerados os principais gêneros de parasitas gastrintestinais que infectam criações caprinas na região. A presença constante desses gêneros perdurando durante o ano agravam as doenças gastrintestinais (COSTA et al., 2011). Apesar da disponibilidade comercial de uma variedade de medicamentos anti-helmínticos, os nematoides continuam a ser um dos maiores fatores limitantes para a produção (PERRY; RANDOLPH, 1999), por conta principalmente do agravamento da resistência anti-helmíntica relatada em vários países do mundo (PRICHARD et al., 1980; PRICHARD, 1990; COLES, 2005).

Analisando os gráficos gerados com base nos resultados estatísticos, estes sem diferença significativa, podemos perceber uma pequena eficácia na inibição do gênero Haemonchus. Ação similar foi observada em nematoides de solo; a eficácia da quitosana contra larvas foi comprovada na redução do nematoide das galhas Meloidogyne incognita na fase L2 em 69,87%, quando comparada ao controle positivo, que reduziu em 86,84% (RADWAN et al., 2012).

Analisando biologicamente as concentrações por gênero, Haemonchus apresentou menor desenvolvimento na concentração de 1,0%, na qual foi vista porcentagem de inibição de 35%, enquanto a 0,5% e 1,5% os valores ficaram entre 16% e 31%, respectivamente (Fig. 1). Visto que o gênero Haemonchus é tido como o maior patógeno do abomaso dos pequenos ruminantes (O’CONNOR et al., 2006), a descoberta de que fungos podem inibir o seu desenvolvimento pode ser visualizada como alternativa biológica ao controle natural desse gênero.

Figura 1:
Teste de inibição do desenvolvimento larval in vitro em amostras de caprinos naturalmente infectados utilizando quitosana fúngica em Haemonchus, principal gênero infectante gastrintestinal de caprinos.

No gênero Trichostrongylus foram observadas porcentagens inibitórias de 11, 9 e 8% para concentrações de quitosana a 0,5, 1,0 e 1,5%, respectivamente. Esses valores sinalizam indícios insatisfatórios para a quitosana testada nessas concentrações, pois a porcentagem de inibição ficou em torno de 10%, concentração indicada para controle negativo em testes com bioprodutos (CHAGAS et al., 2011). Trichostrongylus é um gênero que vem ganhando importância, em razão da sua resistência parasitária, principalmente a benzamidazois, lactonas macrocíclicas e imidazois (LE JAMBRE et al., 2005). Os sintomas causados pela sua ação são bastante severos ao animal, tornando sua inibição um importante objetivo a ser alcançado (AL-ROFFAI et al., 2012; MORENO-GONZALO et al., 2013).

Os dados do gênero Oesophagostomum demonstraram valor inibitório para as concentrações 0,5; 1,0 e 1,5% de quitosana com inibição de 10, 8 e 10%, respectivamente, considerado insatisfatório. Mesmo sendo um gênero com baixa incidência, Oesophagostomum apresenta resistência a drogas químicas. Assim, a importância da busca de alternativas viáveis para a inibição desses gêneros é imprescindível para a diminuição das perdas de rebanhos de caprinos (LIMA et al., 2010).

No caso do gênero Strongyloides, a porcentagem de inibição para as concentrações da solução de quitosana foi de 0%, 2% e 1% nas concentrações de 0,5%, 1,0% e 1,5%, nessa ordem. A espécie Strongyloides papillosus é de grande preocupação pelo fato de uma de suas vias de transmissão ser a transmamária (SOULSBY, 1971; ANDRADE et al., 2013). Os resultados de ANDRADE et al. (2013) comprovaram a importância desse parasita como um agente preocupante de surtos epidemiológicos, destacando a relevância de novos estudos com dosagens apropriadas à inibição no desenvolvimento dessas larvas.

Com esses resultados, podemos salientar a importância de mais estudos com fungos e seus bioprodutos sobre nematoides gastrintestinais de caprinos, principalmente o gênero Haemonchus. Além disso, a ação da quitosana fúngica com esse gênero demonstrou, mesmo sem diferença estatística significativa, eficácia visível. Dessa forma, ratifica-se a importância do surgimento de novos estudos para auxiliar no controle sanitário desses rebanhos, buscando sempre a substituição de fármacos sintéticos e residuais por produtos biológicos e biodegradáveis.

REFERÊNCIAS

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  2017

Histórico

• Recebido
  19 Jun 2015
• Aceito
  06 Out 2016