Polimorfismo do gene metilenotetra-hidrofolato redutase (MTHFR) e o risco de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço

Resumos

Methylenetetrahydrofolate reductase gene (MTHFR) C677T polymorphism may be a risk factor for head and neck squamous cell carcinoma due to changes in folate levels that can induce disorders in the methylation pathway, which results in carcinogenesis. AIM: To evaluate MTHFR C677T polymorphism in patients with head and neck squamous cell carcinoma and in individuals with no history of cancer, and to assess the association of this disease with clinical histopathological parameters. SERIES AND METHODS: A retrospective study that assessed gender, age, tobacco, alcohol consumption and clinical histopathological parameters in 200 patients (100 with disease and 100 with no history of cancer). PCR-RFLP molecular analysis was carried out and the chi-square test and multiple logistic regression were applied for the statistical analysis. RESULTS: There was no association between MTHFR C677T polymorphism and head and neck cancer (p = 0.50). Significant differences between the study and control groups were observed at age over 50 years, tobacco use, and male gender (p <0.001). There was no association of disease with clinical-histopathological parameters. CONCLUSION: No association between the MTHFR C677T polymorphism and head and neck squamous cell carcinoma was possible in this study.

genes; head and neck neoplasms; polymorphism

ORIGINAL ARTICLE

Polimorfismo do gene metilenotetra-hidrofolato redutase (MTHFR) e o risco de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço

Juliana Olsen Rodrigues^I; Ana Lívia Silva Galbiatti^II; Mariangela Torreglosa Ruiz^III; Luiz Sergio Raposo^IV; José Victor Maniglia^V; Érika Cristina Pavarino-Bertelli^VI; Eny Maria Goloni-Bertollo^VI

^IGraduanda em Medicina

^IIBióloga, Mestranda em Ciências da Saúde

^IIIDoutora em Ciências da Saúde

^IVMédico, Mestrando em Ciências da Saúde

^VLivre-Docente, Professor Adjunto

^VILivre-Docente em Genética Humana e Médica, Professora Adjunto

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

O polimorfismo C677T do gene metilenotetra-hidrofolato redutase (MTHFR) pode ser um fator de risco para o carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço devido a alterações nos níveis de folato que podem induzir alterações na metilação intracelular, promovendo a carcinogênese.

OBJETIVO: Avaliar o polimorfismo MTHFR C677T em pacientes com carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço e em indivíduos sem história de neoplasia e verificar a associação desta doença com as características clínico-patológicas.

CASUÍSTICA E MÉTODOS: Estudo retrospectivo no qual foram avaliados gênero, idade, tabagismo, etilismo e parâmetros clínico-histopatológicos em 200 indivíduos (100 com a doença e 100 sem história de neoplasia). A análise molecular foi realizada pela técnica de PCR- RFLP e os testes qui-quadrado de Pearson e Regressão Logística Múltipla foram utilizados para análise estatística.

RESULTADOS: Não houve associação entre o polimorfismo MTHFR C677T e a doença (p=0,50). Diferenças significantes entre o grupo de pacientes e o grupo controle foram observadas para idade superior a 50 anos, hábito tabagista e gênero masculino (p<0,001). Não houve associação da doença com os parâmetros clínico-histopatológicos.

CONCLUSÃO: Não foi possível estabelecer uma associação entre o polimorfismo MTHFR C677T e o carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço.

Palavras-chave: genes, neoplasias de cabeça e pescoço, polimorfismo genético.

INTRODUÇÃO

O carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço é um dos cinco tipos de cânceres mais comuns no mundo. Apresenta-se em sexto lugar em mortalidade por câncer e inclui cânceres de cavidade oral (40%), faringe (15%) e laringe (25%)¹.

Os pacientes com carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço geralmente são diagnosticados num estágio tardio da doença; aproximadamente 75% dos diagnósticos são realizados no estádio III ou IV. Essa situação torna-se pior em países em desenvolvimento, como Índia, Tailândia e Brasil³, países onde esse tipo de câncer é mais comum⁴.Os indivíduos com esta doença apresentam uma taxa de sobrevida que atinge em média cinco anos⁵. Além disso, a expectativa de vida em cinco anos é de aproximadamente 50%, quando há presença de metástases linfonodais^6,7. Apesar das novas técnicas cirúrgicas, radioterapia e uso concomitante da quimioterapia, não se observa aumento significativo da taxa de sobrevida nas últimas décadas^4,5,6,8.

Estudos epidemiológicos sugerem uma etiologia multifatorial para esse tipo de câncer e dentre os fatores que predispõem à doença estão tabagismo, etilismo, infecção oral pelo vírus papiloma humano (HPV) e fatores genéticos^1,4,7,9,10.

Polimorfismos genéticos que resultam nesta deficiência parecem contribuir para o desenvolvimento do carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço e outros tipos de câncer, devido à influência do folato no processo de metilação do DNA que é a transferência de grupos metil (CH3) para a posição 5' de resíduos de citosinas localizadas em dinucleotídeos citosina-guanina (CpG), por meio de reações catalisadas por proteínas denominadas DNA metiltransferases¹¹. Esta modificação epigenética do DNA possui vários papéis funcionais, incluindo controle da expressão gênica, estabilidade da estrutura da cromatina e manutenção da estabilidade genômica^11-22.

O polimorfismo C677T do gene Metilenotetra-hidrofolato redutase (MTHFR) parece estar relacionado à suscetibilidade ao câncer devido à diminuição da atividade da enzima MTHFR envolvida no metabolismo do folato, que pode ocasionar um descontrole da expressão gênica, instabilidade genômica e indução da carcinogênese ^23,24.

Devido à grande variedade étnica e geográfica na frequência da variante C677T do gene MTHFR, estudos têm avaliado o equilíbrio de Hardy-Weinberg deste gene em diferentes populações para verificar se as frequências alélicas permanecem inalteradas ao longo das gerações. A meta-análise de Jim et al. (2009)²⁵ que estudou cinco populações de etnia asiática e outras cinco de etnia europeia ou americana confirmou que a distribuição genotípica do grupo controle em dois estudos não estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Já o estudo de Suzuki et al. (2007)¹⁵, Solomon et al. (2008)²⁶ e Kruszyna et al. (2009)²⁷ em população oriental, polonesa e indiana, respectivamente, as frequências genotípicas apresentaram-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg.

Baseado nas presentes evidências, o objetivo deste trabalho foi identificar o polimorfismo MTHFR C677T em pacientes com carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço e em indivíduos sem história de neoplasia, avaliar a associação deste polimorfismo com características clínicas analisadas e investigar a associação dos dados demográficos (idade e gênero) e fatores de risco (tabagismo e etilismo) com a doença.

CASUÍSTICA E MÉTODOS

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética da instituição sob número 5566/2005.

Um total de 200 indivíduos foi incluído neste estudo, sendo 100 pacientes (84 homens e 16 mulheres, média de idade (DP) de 59,05 ± 10,4 anos) com diagnóstico histopatológico de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, procedentes de um hospital universitário do noroeste do estado de São Paulo e 100 indivíduos sem história de neoplasia (76 homens e 24 mulheres, média de idade (DP) de 43,61 ± 2,2 anos. Os indivíduos foram incluídos no estudo após a obtenção do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.

No grupo controle foram inclusos indivíduos provenientes do Hemocentro de São José de Rio Preto sem diagnóstico de câncer de acordo com o protocolo de doadores de sangue que avalia a ocorrência de 20 doenças (http://www.hemonline.com.br/portarias/rdc153/indexframe.htm). O critério de inclusão foi idade acima de 40 anos e o critério de exclusão foi história familial de câncer na família e presença de qualquer doença avaliada no protocolo de doação de sangue. O grupo caso foi composto de pacientes com diagnóstico de carcinoma de cabeça e pescoço feito a partir de espécimes patológicos ou após excisão total ou biópsia. Como critério de inclusão foram avaliados apenas os pacientes com tumores do tipo histológico espinocelular e foram excluídos do estudo pacientes previamente tratados.

As variáveis analisadas foram idade, gênero, exposição a fatores de risco (consumo de álcool e cigarro) e parâmetros clínicos relacionados ao tumor. Foram considerados tabagistas indivíduos que consumiram cerca de 100 cigarros durante toda vida e etilistas aqueles que bebem mais de quatro drinques por semana^28,29. Quanto aos parâmetros clínicos, foram analisados os sítios primários de ocorrência do tumor (subdivididos em cavidade oral, faringe e laringe) e os tumores foram classificados de acordo com os parâmetros da Union International Control Cancer (IUCC), 2002 e American Joint Committee for Cancer (AJCC), 2002, em três critérios: tamanho do tumor (T), presença de linfonodos regionais comprometidos (N). Todas as informações sobre os parâmetros clínico-patológicos foram obtidas através dos prontuários médicos

O DNA genômico extraído, segundo Miller et al. (1998),³⁰ com modificações foi amplificado pela técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction), segundo Yi et al. em 2002³¹. O produto da amplificação foi submetido à digestão com a enzima de restrição Hinf I, segundo as instruções do fabricante, para detecção do sítio polimórfico (MTHFR 677T).

O modelo de regressão logística múltipla foi utilizado para avaliar o efeito das variáveis e da distribuição genotípica entre os grupos. As variáveis incluídas no modelo foram: idade (referência: idade abaixo da mediana de ambos os grupos), gênero (referência: sexo feminino), hábito tabagista (referência: não fumantes); hábito etilista (referência: não etilistas).

As características clínico-patológicas também foram analisadas por regressão logística múltipla. A classificação T foi igual em tumores com pequena extensão (T1, T2) e com grande extensão (T3, T4). A classificação N foi dividida em comprometimento de linfonodos negativo (N0) e positivo (N1, N2, N3).

Os resultados foram apresentados em odds ratio (OR) e intervalo de confiança de 95% (IC - 95%). O nível de significância foi estabelecido em 5% (p=0,05). A análise estatística foi realizada por meio dos programas computacionais Bioestat e Instat.

RESULTADOS

A Tabela 1 mostra os dados sócio-demográficos dos 100 pacientes com carcinoma espinocelular da cabeça e pescoço e dos 100 indivíduos sem história de neoplasia. Diferenças significantes entre o grupo de pacientes e o grupo controle foram observadas para idade superior a 50 anos, hábito tabagista e gênero masculino (p < 0,001). Cento e sessenta dos participantes foram homens (80% - 84 pacientes e 76 controles) e 40 foram mulheres (20% - 16 pacientes e 24 controles). O grupo caso apresentou 88% dos indivíduos fumantes comparado com 43% do grupo controle. Quanto ao consumo de álcool, 77% dos pacientes e 49% dos indivíduos controles eram etilistas e não houve diferença significante entre os grupos (p=0,06).

O equilíbrio de Hardy-Weinberg mostrou que as distribuições genotípicas foram semelhantes às esperadas entre os pacientes (X² = 1,18; p = 0,23) e entre os indivíduos controles (X² = 0,23; p = 0,63). As frequências genotípicas CC, CT e CC do polimorfismo C677T foram 44%, 43% e 13% respectivamente, para os pacientes e 46%, 40% e 14% respectivamente, para os controles. Não houve diferença significante entre os grupos em relação à distribuição genotípica (p= 0,92).

As frequências alélicas para os pacientes com câncer de cabeça e pescoço foram respectivamente (C=0,65 e T=0,35) e para os indivíduos controles (C=0,66 e T=0,34) e também não se observou diferença estatisticamente significante entre os grupos (p=1,00).

Tabela 2

O teste de regressão logística múltipla foi realizado para avaliação do efeito das variáveis no desenvolvimento da doença (genótipos estudados, idade, gênero, tabagismo e etilismo) (Tabela 1). A idade superior a 50 anos (OR = 20,81; IC= 9,01 a 48,09; p < 0,0001) e tabagismo (OR= 5,03; IC =1,93 a 13,15; p < 0,001) foram fatores preditores da doença.

Quanto aos parâmetros clínicos, não foram observadas associações entre o polimorfismo e os sítios primários do tumor (cavidade oral, faringe e laringe), extensão tumoral e comprometimento de linfonodos. Um total de 34% dos pacientes apresentou como sítio primário a cavidade oral, 31% a laringe e 22% a laringe. O restante apresentou sitio primário desconhecido. Em relação ao TNM, as categorias T1 ou T2 estiveram presente em 59% dos pacientes, destes 34,6% com genótipo selvagem CC e 65,4% com pelo menos um alelo mutado (genótipos CT ou TT). O restante dos pacientes (41%) apresentou as categorias T3 ou T4, sendo 55% com genótipo selvagem CC e 45% com pelo menos um alelo mutado (genótipos CT ou TT). O envolvimento de linfonodo (N+) esteve presente em 26,6% dos pacientes (37,5% com genótipo CC e 62,5% com pelo menos um alelo mutado - genótipos CT ou TT).

DISCUSSÃO

O presente estudo demonstrou que o carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço é mais frequente em indivíduos tabagistas e idade acima de 50 anos. Resultados encontrados na literatura também mostram que o câncer é mais frequente a partir da 5ª década de vida e em indivíduos tabagistas^32-34.

Não foi observada relação entre etilismo e o carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, como no estudo de Boccia et al. (2009).³⁵ Estudos em animais indicam que o álcool não é genotóxico, mas pode agir como solvente para a penetração de carcinógenos. Possui como metabólito primário o acetaldeído, o qual é altamente reativo ligando-se a proteínas, aos constituintes celulares e ao DNA, formando adutos de DNA^36-38. O consumo excessivo de álcool também pode levar a deficiências nutricionais devido às falhas na absorção intestinal e pelas alterações em algumas vias metabólicas³⁹. Os resultados de um estudo multicêntrico sugerem que na ausência do hábito tabagista, a associação entre o consumo de álcool e o risco de carcinoma de cabeça e pescoço é insignificante e que aparentemente, somente em altas doses o álcool é carcinogênico⁴⁰.

Em nosso estudo, a casuística analisada também não mostrou associação do gênero com a doença, porém outros estudos confirmam essa associação e afirmam que nas ultimas décadas houve um aumento da incidência desta doença entre as mulheres, entretanto o gênero masculino ainda é o mais acometido por esse tipo de tumor^41,42.

O polimorfismo MTHFR C677T têm sido investigado como fator de risco para suscetibilidade ao câncer devido a sua influência nas reações de metilação celulares e síntese de DNA. Sabe-se que a hipometilação global do genoma ocorre com maior frequência em tumores quando comparados a células normais, e acredita-se que a expressão elevada de oncogenes seja resultado desta hipometilação. Por outro lado, a hipermetilação de ilhas CpG, localizadas em regiões promotoras de genes, é associada a alterações na expressão gênica, resultando no silenciamento de genes supressores de tumor⁴³.

As frequências genotípicas do presente estudo se encontram em equilíbrio Hardy-Weiberng (HWE). O genótipo polimórfico (MTHFR 677TT) esteve presente em 14% dos indivíduos controles e em 13% dos pacientes com carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço. Há considerável variação étnica e geográfica na frequência da variante C677T do gene MTHFR. A prevalência do genótipo MTHFR 677TT varia cerca de 1% na população negra dos Estados Unidos, África e América do Sul para mais de 20% em europeus, colombianos e ameríndios e 12% dos japoneses apresentam-se homozigotos TT⁴⁴. Considerando a grande miscigenação brasileira, não foi realizada a análise de etnias na casuística estudada.

No presente estudo, não foi observada associação entre o polimorfismo MTHFR C677T e o carcinoma de cabeça e pescoço. Outros estudos mostram associação deste polimorfismo com vários tipos de cânceres, tais como câncer de pulmão^45,35, carcinoma hepatocelular⁴⁶, certas leucemias⁴⁷, câncer de próstata⁴⁸, de mama⁴⁹, de cólon⁴⁹, endométrio, esôfago, estômago, pâncreas e bexiga⁴⁶. Em carcinoma de cabeça e pescoço, uma meta-análise analisou nove estudos e não encontrou associação entre este polimorfismo e a doença, o que está de acordo com os resultados do nosso trabalho³². Porém, os estudos de Reljic et al. (2007)⁵⁰ e Solomon et al. (2008)²⁶ encontraram uma associação entre o carcinoma de cabeça e pescoço e o polimorfismo MTHFR C677T nas populações croata e indiana, respectivamente.

Reljic et al. em 2007⁵⁰ estudaram 81 pacientes com carcinoma de cabeça e pescoço e 102 indivíduos controles e observaram uma diferença estatisticamente significante na distribuição genotípica entre os grupos, o que fornece evidências da possível associação do polimorfismo MTHFR C677T no desenvolvimento do carcinoma de cabeça e pescoço. A análise demonstrou que o genótipo 677CT reduz em 2,8 vezes o risco para essa doença. Já o estudo de Solomon et al., em 2008²⁶, que analisou 126 indivíduos indianos com carcinoma oral (33 etilistas, 56 consumidores moderados de álcool e 37 não-etilistas) mostrou que indivíduos etilistas com o genótipo MTHFR 677TT possuem um alto risco para o desenvolvimento do carcinoma oral (odds ratio 3.0; 95% CI = 2.02-4.0) e portanto, o genótipo TT possui um efeito protetor somente em indivíduos não-etilistas e em consumidores moderados de álcool.

No Brasil, não há na literatura a descrição das alterações do gene estudado e carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço e apesar dos resultados não apresentarem significância, é interessante a pesquisa destas alterações devido aos resultados contraditórios e escassez de estudos.

Em relação aos parâmetros clínicos, o tipo mais frequente de sítio primário tumoral foi cavidade oral, que representa 40% dos cânceres na região de cabeça e pescoço^51,52. Em relação ao TNM, 19% dos casos pertenceram à categoria T1, 30% à categoria T2, 17% à categoria T3 e 17% à categoria T4, 73,4% não apresentaram comprometimento dos linfonodos e 99% não apresentaram metástase. Um estudo retrospectivo realizado no Brasil mostra frequência elevada desta doença em estágio avançado⁵³. A discrepância dos nossos achados parece refletir o tipo de população estudada, ou seja, pacientes que estão em seguimento.

O polimorfismo MTHFR C677T não mostrou associação com os parâmetros clínicos estudados (sítios primários do tumor, extensão tumoral e comprometimento de linfonodos). Em relação ao sítio anatômico de tumor, Capaccio et al.⁵⁴ em 2005 analisaram a presença deste polimorfismo nas diferentes localizações anatômicas na orofaringe e também não encontraram associação entre estas variáveis. Quanto à agressividade tumoral, não foi demonstrada associação deste polimorfismo com a extensão (categoria T) e com o estadiamento do tumor nas três grandes regiões de cabeça e pescoço (cavidade oral, faringe e laringe) analisadas, corroborando com o estudo feito por Vairaktaris et al.⁵⁵ (2006).

CONCLUSÃO

Em conclusão, não foi possível estabelecer uma associação entre o polimorfismo MTHFR C677T e carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço. Nossos dados mostram que essa doença é mais frequente a partir da quinta década de vida e em indivíduos tabagistas. A elucidação da associação desse polimorfismo com o desenvolvimento de carcinoma de cabeça e pescoço e da associação desse tipo de câncer com certos fatores de risco contribuirão no entendimento dos mecanismos envolvidos no processo neoplásico e na elaboração de estratégias de prevenção e controle desta doença.

Este artigo foi submetido no SGP (Sistema de Gestão de Publicações) da BJORL em 7 de janeiro de 2010. cod. 6868

Artigo aceito em 23 de maio de 2010.

Centro Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes)

FAMERP - Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  15 Dez 2010
• Data do Fascículo
  Dez 2010

Histórico

• Aceito
  23 Maio 2010
• Recebido
  07 Jan 2010