Efeito do laser de baixa intensidade (660 nm) na regeneração do nervo isquiático lesado em ratos

Effect of low- power laser (660 nm) on regeneration of injured rat sciatic nerve

Resumos

Os nervos periféricos são estruturas que, ao sofrerem lesões, podem originar incapacidades motoras e sensitivas importantes. O laser de baixa intensidade é um dos diversos recursos terapêuticos para promover a regeneração nervosa precoce, mas ainda não há consenso sobre sua utilização. O objetivo deste estudo foi investigar, por meio de avaliação funcional, o efeito da terapia a laser de baixa intensidade (660 nm) na regeneração do nervo isquiático após esmagamento. Foram utilizados 18 ratos (Wistar) submetidos à lesão do nervo isquiático divididos em dois grupos, controle e grupo laser, submetido ao tratamento a laser (AsGaAl, 660 nm, 10J/cm2, 30 mW e 0,06 cm²) por 21 dias no local da lesão. Para a avaliação funcional, foi aplicado o índice funcional do ciático (IFC) no pré-operatório e nos 7º, 14º e 21º dias de pós-operatório. Quando comparados o IFC dos grupos no 14o dia de pós-operatório, foi encontrada melhora significante no grupo laser em relação ao controle. Na amostra analisada e nos parâmetros utilizados, pôde-se constatar que a aplicação do laser foi eficaz na recuperação funcional precoce do nervo ciático esmagado.

Nervo ciático; Regeneração nervosa; Síndromes de compressão nervosa; Terapia a laser de baixa intensidade

Peripheral nerves, when injured, may originate important motor and sensitive disability. Studies have used several therapeutic resources in order to achieve early nervous regeneration, such as low-power laser; but there is no consensus on its use, which leads to controversial conclusions. The purpose of this study was to assess the effect of GaAlAs laser (660 nm) on functional recovery of the sciatic nerve in rats. Sciatic nerves of 18 Wistar rats were crushed and divided into sham group and treated group, the latter submitted to laser therapy (660 nm, 10 J/cm², 30 mW and 0.06 cm2) for 21 days. The sciatic functional index (SFI) was measured before surgery and on the 7th, 14th and 21st postoperative days. A significant difference, showing better regeneration of the treated group, was found when comparing SFI on the 14th day. Hence, the use of low-power laser, with the parameters and methods here used, showed positive results in early regenerating rat crushed sciatic nerve.

Functional laterality; Infants and toddlers; Motor activity; Movement, reaching

PESQUISA ORIGINAL ORIGINAL RESEARCH

Efeito do laser de baixa intensidade (660 nm) na regeneração do nervo isquiático lesado em ratos

Effect of low- power laser (660 nm) on regeneration of injured rat sciatic nerve

Rafael Inácio Barbosa^I; Alexandre Marcio Marcolino^II; Rinaldo Roberto de Jesus Guirro^III; Nilton Mazzer^IV; Cláudio Henrique BarbieriIV; Marisa de Cássia Registro Fonseca^III

^IFisioterapeuta; Doutorando no RAL/FMRP/USP

^IIDoutorando no RAL/FMRP/USP

^IIIProfs. Drs. do Curso de Fisioterapia da FMRP/USP

^IVProfs. titulares da FMRP/USP

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Os nervos periféricos são estruturas que, ao sofrerem lesões, podem originar incapacidades motoras e sensitivas importantes. O laser de baixa intensidade é um dos diversos recursos terapêuticos para promover a regeneração nervosa precoce, mas ainda não há consenso sobre sua utilização. O objetivo deste estudo foi investigar, por meio de avaliação funcional, o efeito da terapia a laser de baixa intensidade (660 nm) na regeneração do nervo isquiático após esmagamento. Foram utilizados 18 ratos (Wistar) submetidos à lesão do nervo isquiático divididos em dois grupos, controle e grupo laser, submetido ao tratamento a laser (AsGaAl, 660 nm, 10J/cm₂, 30 mW e 0,06 cm²) por 21 dias no local da lesão. Para a avaliação funcional, foi aplicado o índice funcional do ciático (IFC) no pré-operatório e nos 7º, 14º e 21º dias de pós-operatório. Quando comparados o IFC dos grupos no 14o dia de pós-operatório, foi encontrada melhora significante no grupo laser em relação ao controle. Na amostra analisada e nos parâmetros utilizados, pôde-se constatar que a aplicação do laser foi eficaz na recuperação funcional precoce do nervo ciático esmagado.

Descritores: Nervo ciático; Regeneração nervosa; Síndromes de compressão nervosa/reabilitação; Terapia a laser de baixa intensidade

ABSTRACT

Peripheral nerves, when injured, may originate important motor and sensitive disability. Studies have used several therapeutic resources in order to achieve early nervous regeneration, such as low-power laser; but there is no consensus on its use, which leads to controversial conclusions. The purpose of this study was to assess the effect of GaAlAs laser (660 nm) on functional recovery of the sciatic nerve in rats. Sciatic nerves of 18 Wistar rats were crushed and divided into sham group and treated group, the latter submitted to laser therapy (660 nm, 10 J/cm², 30 mW and 0.06 cm2) for 21 days. The sciatic functional index (SFI) was measured before surgery and on the 7th, 14th and 21st postoperative days. A significant difference, showing better regeneration of the treated group, was found when comparing SFI on the 14th day. Hence, the use of low-power laser, with the parameters and methods here used, showed positive results in early regenerating rat crushed sciatic nerve.

Key words: Functional laterality; Infants and toddlers; Motor activity; Movement, reaching

INTRODUÇÃO

Os nervos periféricos são estruturas que, tal como outros tecidos, ao sofrer lesões originam incapacidades motoras e sensoriais importantes¹. Estima-se que a incidência das lesões traumáticas em alguns países seja superior a 500.000 novos casos anuais, dos quais 2,8% dos pacientes adquirem incapacidades vitalícias em virtude do elevado tempo de regeneração nervosa^2-6.

As causas das lesões do sistema nervoso periférico (SNP) incluem ferimentos cortantes, por arma de fogo⁷, traumas por alterações de temperatura, compressões, mecanismos de tração e ainda as causas infecciosas e tóxicas, sendo que pode haver diferentes mecanismos como laceração, avulsão, secção, estiramento, compressão e esmagamento^8,9. Essas lesões promovem uma agressão à integridade do tecido produzindo disfunções importantes nas estruturas inervadas pelo nervo lesado, pois implicam alterações da condução nervosa e no transporte axonal^10,11.

Dentre os instrumentos terapêuticos para regeneração do SNP mencionados na literatura, a estimulação elétrica¹², o ultra-som¹³ e o laser de baixa intensidade^14-19 são utilizados com o intuito de acelerar os processos regenerativos, buscando o retorno precoce da funcionalidade.

A laserterapia de baixa intensidade é utilizada em várias pesquisas clínicas e experimentais nas lesões do SNP por ocasionar um estímulo na microcirculação, pela paralisação dos esfíncteres pré-capilares, provocando a vasodilatação de arteríolas e capilares e pela neoformação vascular, levando assim a um aumento do fluxo sangüíneo na área irradiada. Também é empregada para cicatrização de vários tecidos, por estimular um aumento na produção de ATP celular, provocando aceleração na atividade mitótica celular^20-24. Nos estudos recentes sobre a influência do laser de baixa intensidade nas lesões do SNP, utilizam-se diferentes modelos, variando comprimentos de onda (632-904 nm), energia, densidade, tempo de intervenção, mecanismo e tipo de lesão, além de seu tratamento e a forma de avaliação (funcional e morfométrica)^15,19,25-30.

Em condições experimentais, a recuperação das lesões nervosas periféricas é estudada principalmente por técnicas de eletrofisiologia, histologia e morfometria. Embora os parâmetros eletrofisiológicos e morfológicos sejam úteis, eles não permitem um entendimento funcional do segmento¹⁵. Em 1982, De Medinacelli et al.³¹, tendo analisado a relação entre lesão no ciático e o apoio das patas na marcha, propuseram a utilização de um método de avaliação denominado índice funcional do ciático (IFC), baseado em mensurações nas patas traseiras de ratos. Gasparini et al.³² fizeram avaliação funcional da marcha de ratos com lesão por esmagamento do nervo isquiático pelo IFC, utilizando uma passarela de acrílico e registrando as pegadas por uma câmara digital. As imagens foram avaliadas por programa de computador para quantificar os parâmetros predeterminados por De Medinacelli et al.³¹, modificados por Bain et al.³³.

O objetivo deste estudo foi investigar, pelo grau de funcionalidade inferido pelo IFC, o efeito da terapia a laser de baixa intensidade (660 nm, utilizando energia emitida de 0,6J) na regeneração do nervo isquiático após esmagamento. Há evidências de que o laser de baixa intensidade pode melhorar a recuperação funcional na lesão nervosa por esmagamento; essa hipótese foi aqui testada visando contribuir com a literatura preexistente, pois a metodologia e os parâmetros estão bem definidos, para que outros autores possam reproduzi-los.

METODOLOGIA

Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal e Pesquisa da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo.

Foram utilizados 18 ratos Wistar adultos machos, pesando de 290 a 320 gramas, que foram divididos aleatoriamente em dois grupos:

■ Grupo controle (n=9): simulação da radiação laser

■ Grupo laser (n=9): radiação laser com fluência de 10 J/cm², energia emitida (E) = 0,6J e tempo de exposição de 20 s.

Procedimentos

Para o esmagamento do nervo isquiático dos ratos, foi utilizado um dispositivo portátil de peso morto, confeccionado pela Oficina de Precisão da Prefeitura do Campus de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (Figura 1). A carga de esmagamento utilizada foi a de 5000 g por um período de 10 minutos, sendo suficiente para provocar uma lesão tipo axonotmese no segmento, ocasionando uma disfunção na marcha dos animais34. Pachioni et al.35 concluíram que não há necessidade de utilizar cargas acima de 5000 g nesse modelo de esmagamento, pois esta é suficiente para lesar os vasos intraneurais, especialmente os capilares endoneurais, produzindo uma importante lesão axonal, caracterizando a axonotmese.

Todos os ratos foram anestesiados com uma mistura de Ketamina a 10% (0,1 ml/ 100 g peso corpóreo) e Xylazina a 2% (0,07 ml/100 g peso corpóreo), administradas por via intraperitonial. Após a incisão, o nervo isquiático foi abordado e o esmagamento, utilizando o dispositivo de peso morto, foi feito 5 mm acima da divisão dos três ramos principais (fibular, tibial e sural). Após o esmagamento, o nervo foi recolocado em seu leito e realizada a sutura dos músculos e da pele.

A radiação laser foi aplicada em um ponto predeterminado no ato cirúrgico, sobre o local da realização do esmagamento do nervo. A caneta foi posicionada a 90° em relação ao tecido cutâneo, utilizando a técnica pontual com contato, imediatamente após a operação e nos 20 dias subseqüentes.

Foi utilizado um equipamento laser (modelo Laserpulse da Ibramed Equipamentos Médicos, RS) de diodo de arseneto de gálio aluminizado (AsGaAl), com comprimento de onda de 660 nm, 10 J/cm2, potência de 30 mW e área do feixe de 0,06 cm², em modo de pulso contínuo. O equipamento foi adquirido para realização desta pesquisa; a emissão do laser foi aferida inicialmente pelo fabricante e, após o término do experimento, foi realizada aferição no Laboratório de Bioengenharia da USP São Carlos.

Para a avaliação funcional usando o IFC, procedeu-se ao registro das pegadas dos animais. As impressões foram registradas por uma câmera digital (Handycam - Digital Video Camera Recorder), tal como a utilizada por Gasparini et al.³², fixada sob uma passarela de acrílico transparente com 43 cm de comprimento, 5,5 cm de altura e 8,7 cm de largura, tendo ao seu final uma casinhola de madeira. Os vídeos das pegadas foram digitalizados pelo programa Magix para obtenção das imagens das pegadas. As imagens foram analisadas por meio do programa Image J, para transformar os pixels em milímetros, de modo a poder calcular os parâmetros predeterminados para a avaliação do índice funcional do ciático (Figura 2). As impressões das pegadas foram obtidas no pré-operatório e após 7, 14 e 21 dias da lesão inicial em ambos os grupos. As imagens foram avaliadas pela fórmula do IFC proposta por Bain et al.³³:

Análise estatística

Para comparar as atividades foi proposto um modelo linear de efeitos mistos com o alpha (nível de significância) assumido de 5%³⁶. Esse modelo (efeitos aleatórios e fixos) é utilizado na análise de dados onde as respostas de um mesmo indivíduo estão agrupadas e a suposição de independência entre observações num mesmo grupo não é adequada. No modelo de efeitos mistos utilizado, foram considerados como efeito aleatório os indivíduos e, como efeitos fixos, os grupos, os tempos e a interação entre os mesmos. Tal modelo tem como pressuposto que o resíduo obtido pela diferença entre os valores preditos pelo modelo e os valores observados tenha distribuição normal, com média 0 e variância constante. Nas situações onde tal pressuposto não foi observado, foram feitas transformações na variável resposta. O ajuste do modelo foi feito pelo programa SAS (v.9)^37,38.

RESULTADOS

Para a análise funcional da marcha foram utilizados os registros das pegadas tomados no pré-operatório, no 7º, 14º e 21º dias do pós-operatório, totalizando 72 pegadas.

O IFC médio dos grupos foi: no pré operatório, controle -6,10 e grupo laser, -8,42; no 14o dia, controle -83,70 e grupo laser, -59,01; e, no 21º dia, controle -32,58 e grupo laser, -22,97. A Figura 3 permite visualizar a variação do IFC em todo o período de estudo. A análise intergrupos apontou diferença estatisticamente significante quando comparados os grupos controle e laser no 14º dia (p<0,01). A análise intragrupos mostrou diferença significante entre o pré-operatório e o 21º dia (p<0,01 em ambos os grupos), indicando que até esse dia nenhum dos grupos tinha alcançado seu padrão inicial de marcha.

DISCUSSÃO

Vários parâmetros, como comprimento de onda, densidade de energia, modo do pulso e potência do laser, estão sendo utilizados para estimular a regeneração e acelerar a recuperação funcional do nervo periférico^{15,16,28,39-42}. Em geral as publicações cujo tratamento utilizou o laser de emissão contínua apresentaram resultados positivos na regeneração nervosa periférica, podendo ser esse modelo a primeira escolha para tal na regeneração⁴³.

Rochkind et al.^19,44,45 e Anders et al.⁴⁶ descreveram os mecanismos da atuação do laser na recuperação do tecido nervoso, relatando efeito imediato de proteção e aumento da atividade funcional, manutenção da atividade funcional na lesão nervosa em tempo excedente, influência na diminuição da formação de tecido cicatricial no local da lesão, prevenção ou diminuição da degeneração no neurônio motor correspondente na medula espinhal e influência no crescimento axonal e da bainha de mielina.

Estudos recentes utilizaram o laser com comprimento de onda de 660 nm para otimizar o processo de regeneração neural. Reis et al.¹⁶ utilizaram-no (26,3 mW, 0,63 cm², 2,54 J) na recuperação do nervo isquiático de ratos após neurotmese; os grupos foram tratados por 20 dias consecutivos, com densidade de energia de 4 J/cm² por 3 pontos na incisão cirúrgica, encontrando melhora significante na avaliação morfométrica. Belchior et al.¹⁵ utilizaram os mesmos parâmetros do estudo anterior também no processo de regeneração após lesão por esmagamento do nervo isquiático, tendo obtido resultados positivos considerando a recuperação funcional pelo IFC se comparado o grupo experimental ao controle. No presente estudo, os parâmetros utilizados foram diferentes dos estudos anteriores; quanto aos valores médios de IFC, porém, que foram de -59,01 no 7º e -22,97 no 14º dia no grupo experimental, são melhores do que os encontrados por Belchior et al.¹⁵, cujos valores médios de IFC foram -83,0 no 7º e -57,8 no 14º dia de pós-operatório.

Gonçalves et al.⁴⁷ verificaram os efeitos da irradiação do laser 830 mn na regeneração do nervo isquiático de ratos submetido a esmagamento e concluíram que contribuiu para a redução do processo inflamatório, tendo verificado menor degeneração da bainha de mielina e menos infiltrado inflamatório. Estudos que utilizaram o laser de baixa intensidade na regeneração de lesão nervosa periférica apresentam variação na energia utilizada, de 0,086 J até 105 J; foram feitos em células isoladas e em experimentação em animais. Dentre os relatos avaliados como benéficos, pode-se observar uma "janela terapêutica" que varia de 0,6 J a 28,8 J.

A interação da luz laser com as biomoléculas depende de vários parâmetros físicos, sendo evidente a relação entre o comprimento de onda e a resposta biológica. As vias de ativação propostas para o laser de baixa intensidade levam em conta a sua ação sobre os cromóforos situados na mitocôndria e na membrana celular. A radiação vermelha apresenta uma ação preferencial na mitocôndria e a infravermelha sobre os cromóforos da membrana celular^48,49. Portanto, os efeitos terapêuticos são específicos, o que leva a crer que exista possibilidade de se utilizar comprimentos de ondas definidos com objetivo de incrementar uma resposta biológica particular.

Um ponto bastante estudado e que pode ter relação com os resultados obtidos está relacionado com a produção de ATP. Nas células animais, os controles de gradiente de Na⁺-K⁺ dirigem o transporte ativo de açúcares e aminoácidos, tornando as células nervosas e musculares eletricamente excitáveis. O fato de mais de um terço do ATP consumido por um animal em repouso ser usado para operar essa bomba ressalta a importância desse mecanismo⁵⁰. Há de se considerar que um citocromo c-oxidase é um fotorreceptor da região vermelha do espectro, sendo responsável pela ativação da síntese de ATP e, conseqüentemente, do metabolismo celular. A possibilidade de a célula ter maior aporte energético durante o processo de reparação pode estar ligada à melhor resposta observada no uso do laser 660 nm, já que uma mitocôndria absorve seletivamente nesse comprimento de onda⁵⁰.

No presente estudo o laser foi aplicado sobre a pele e portanto sobre o tecido muscular, onde se pode considerar a possibilidade de um aumento dos níveis do fator de crescimento do nervo, que é um fator neurotrópico secretado pelos músculos esqueléticos, já que foi demonstrado que o laser de baixa intensidade, no comprimento de onda de 632 nm, possibilita tal resposta⁵¹.

A avaliação funcional da marcha é uma oportunidade de avaliar os aspectos específicos da recuperação nervosa de maneira não-invasiva³³. O método pelo IFC foi utilizado em nosso laboratório em pesquisas com o nervo isquiático de ratos, mostrando clara correlação entre o IFC e a avaliação morfométrica do nervo^12,13. As imagens das pegadas forneceram os dados para o cálculo do índice funcional do ciático, que alguns autores avaliaram como um método quantitativo confiável e reprodutível⁴⁸. A medida do IFC apresentou alto grau de correlação com a recuperação funcional e a regeneração morfológica e morfométrica das lesões do tecido nervoso periférico⁴⁵. De fato, o IFC tem-se mostrado um instrumento confiável para avaliar o processo de regeneração nervosa periférica, fornecendo um valor numérico à função e permitindo a análise estatística dos resultados.

Um grande número de pesquisas são feitas com o laser de baixa intensidade, mas não há padronização dos parâmetros empregados; a falta de dados nos estudos consultados dificulta a comparação dos resultados e o entendimento dos mecanismos envolvidos. Enwemeka²⁵ relata, em uma recente revisão, que por volta de 30% dos artigos publicados com uso do laser de baixa intensidade carecem de informações relevantes para determinar a dose ou reportam dados imprecisos. Dessa forma, tornam-se necessários novos estudos para verificar a importância e a dependência entre os parâmetros do laser usando a mesma metodologia, o que pode levar à melhor utilização do laser de baixa intensidade em protocolos de tratamento mais seguros e eficazes em humanos.

CONCLUSÃO

Na amostra e nos parâmetros utilizados, verificou-se que a utilização do laser AsGaAl (660 nm) foi eficaz na recuperação funcional precoce do nervo isquiático de ratos, sugerindo uma benéfica atuação do laser no processo de regeneração nervosa.

Apresentação: ago. 2009

Aceito para publicação: jun. 2010

Estudo desenvolvido no RAL/FMRP/USP - Depto. de Biomecânica, Medicina e Reabilitação do Aparelho Locomotor da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil

Este estudo teve apoio financeiro da Fapesp - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  14 Mar 2012
• Data do Fascículo
  Dez 2010

Histórico

• Recebido
  Ago 2009
• Aceito
  Jun 2010