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Fisioterapia e Pesquisa

versão On-line ISSN 2316-9117

Fisioter. Pesqui. vol.24 no.2 São Paulo abr./jun. 2017

http://dx.doi.org/10.1590/1809-2950/17409924022017 

PESQUISA ORIGINAL

Análise do perfil oxidativo de diferentes amostras biológicas de pacientes com lesão de ligamento cruzado anterior

Análisis del perfil oxidativo de diferentes muestras biológicas de pacientes con lesión de ligamento cruzado anterior

Bruna Pierezan1 

Bruna Webber1 

Marlon Francys Vidmar2 

César Antônio de Quadros Martins3 

Carlos Rafael de Almeida3 

Luciano de Oliveira Siqueira4 

1Graduada em Farmácia pela Universidade de Passo Fundo (UPF) - Passo Fundo (RS), Brasil.

2Mestre em Ciências pela Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre (UFCSPA) - Porto Alegre (RS), Brasil.

3Mestre em Ciências pela Universidade de Passo Fundo (UPF) - Passo Fundo (RS), Brasil.

4Professor adjunto da Universidade de Passo Fundo (UPF) - Passo Fundo (RS), Brasil.

RESUMO

O joelho é uma das articulações mais importantes para locomoção. No entanto, devido a sua complexidade, torna-se suscetível a diversos tipos de lesões, como a ruptura do ligamento cruzado anterior (LCA). Essa complicação desencadeia um processo inflamatório, que pode culminar em formação de radicais livres e, consequentemente, em estresse oxidativo (EO). O objetivo do estudo foi comparar o perfil oxidativo de pacientes com lesão do LCA, analisando duas amostras biológicas: líquido sinovial e soro. Foram analisados 11 indivíduos do gênero masculino, com ruptura total do LCA, com idade superior a 18 anos. Coletou-se amostras de sangue e líquido sinovial 15 minutos antes da artroplastia e se analisou biomarcadores de EO, catalase, flavonoides e peroxidação lipídica, isto é, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Os resultados apontam menor concentração de flavonoides, combinada a aumento de TBARS e de atividade de catalase no soro quando comparado com o líquido sinovial. A análise dos resultados indica que a lesão de LCA induz a quadro de EO, caracterizado por consumo de antioxidantes e elevação de dano lipídico no líquido sinovial quando comparado com o soro, indicando que análises séricas podem não ser adequadas para medir EO em partes como a articulação do joelho.

Descritores: Joelho; Ligamento Cruzado Anterior; Radicais Livres; Biomarcadores; Estresse Oxidativo

RESUMEN

La rodilla es una de las articulaciones más importantes para locomoción. Sin embargo, debido a su complejidad, se torna susceptible a diversos tipos de lesiones, como la ruptura del ligamento cruzado anterior (LCA). Esa complicación desencadena un proceso inflamatório, que puede culminar en formación de radicales libres y, en consecuencia, en estrés oxidativo (EO). El objectivo del estudio fue comparar el perfil oxidativo de pacientes con lesión del LCA, analizando dos muestras biológicas: fluido sinovial y suero. Fueron analizados 11 individuos del género masculino, con ruptura total del LCA, con edad superior a 18 años. Se recogió muestras de sangre y fluido sinovial 15 minutos antes de la artroplastia y se analizó biomarcadores de EO, catalasa, flavonoides y peroxidación de las grasas, o sea, substancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS). Los resultados apuntan menor concentración de flavonoides, combinada a aumento de TBARS e de actividad de catalasa en el suero cuando comparado con el fluido sinovial. El análisis de los resultados indica que la lesión de LCA induce a cuadro de EO, caracterizado por consumo de antioxidantes y elevación de daño de las grasas en el fluido sinovial cuando comparado con el suero, indicando que análisis séricas pueden no ser adecuadas para medir EO en partes como la articulación de la rodilla

Palabras clave: Rodilla; Ligamento Cruzado Anterior; Radicales Libres; Biomarcadores; Estrés Oxidativo

INTRODUÇÃO

O joelho é uma articulação intermédia do membro inferior, assumindo um dos papéis mais importantes durante a locomoção, o que o torna um alvo suscetível a diversas lesões, principalmente desportistas, pois é o alvo mais vulnerável de um atleta. A lesão de maior frequência em esportistas é a ruptura do ligamento cruzado anterior (LCA)1.

A lesão do LCA do joelho é responsável por aproximadamente 50% de todas as lesões ligamentares2. O crescente número de praticantes de atividades físicas colabora para o aumento do índice dessa patologia. Nos Estados Unidos, são realizadas em torno de 70.000 reconstruções ligamentares ao ano por meio de procedimento cirúrgico3.

Uma das consequências da ruptura do LCA é o aumento da produção de radicais livres (RL) pelo organismo, desencadeado pela inflamação4. O aumento de RL está associado ao aumento do consumo de oxigênio (O2) pelos tecidos ativos5, bem como pelo próprio processo inflamatório4), (5), (6), (7.

A geração de RL ocorre como parte do processo fisiológico do organismo como respiração celular. Esses radicais ativos podem ter vários efeitos fisiológicos, como mecanismo de defesa contra a agressão de microrganismos, controle de estímulos e sinais moleculares8.

As células mediadoras de inflamação (macrófagos, neutrófilos, linfócitos e células endoteliais) são recrutadas até o local da lesão em que, além de produzirem RL de O2, vão provocar a formação de enzimas proteolíticas para reparo do tecido lesado9. Além disso, a ruptura do LCA promove aumento da produção de mediadores inflamatórios e proteínas de fase aguda que podem agir como RL5. Dessa forma, o desequilíbrio entre a produção de radicais e as defesas antioxidantes, com predomínio dos RL, podem desencadear o estresse oxidativo (EO)6), (7), (8), (10.

Durante o EO, os RL na presença de moléculas de lipídios, DNA, proteínas, carboidratos ou proteoglicanos desencadeiam amplificação da lesão oxidativa aos tecidos subjacentes8, podendo acarretar lesão de células normais adjacentes ao local lesado, amplificando o processo inflamatório e oxidativo9), (11), (12.

A determinação do EO depende da habilidade de aferição da presença de espécies reativas12, as quais podem ser medidas diretamente, por meio de sua concentração em fluídos biológicos e tecidos, ou indiretamente, mediante avaliação do dano que causam13.

Por ser um procedimento de coleta simples, o dano oxidativo em humanos é rotineiramente determinado em amostras de sangue, uma vez que os biomarcadores se difundem do local da inflamação para o soro em que é determinado. Estudos em líquidos biológicos, como o líquido sinovial, são restritos, por se tratar de procedimento invasivo e relativamente traumático14), (15.

Não há relatos na literatura a respeito da comparação entre níveis dos biomarcadores bioquímicos de inflamatórios ou de EO no soro e em compartimentos, como o líquido sinovial, mantendo a dúvida de que em estudos de EO e inflamação em articulações podem ser usadas amostras de sangue como matriz biológica de diagnóstico de inflamação e de EO.

Dessa forma, o objetivo deste estudo foi analisar o perfil oxidativo sistêmico (sangue) e local (líquido sinovial) de indivíduos com ruptura do LCA do joelho, com intuito de avaliar se parâmetros bioquímicos de inflamação se difundem do tecido para o sangue e se equivalem de forma sistêmica nos indivíduos.

METODOLOGIA

Delineamento

Este trabalho é um estudo transversal com objetivo de avaliar a intensidade e a diferença do dano oxidativo entre o líquido sinovial e o sangue de pacientes com ruptura do LCA.

Casuística

A amostra foi composta por 11 indivíduos do gênero masculino, com ruptura total do LCA associada ou não a lesão meniscal e/ou condral. Foram incluídos no estudo pacientes com idade superior a 18 anos que não fizeram uso de medicação anti-inflamatória nas 48 horas antecedentes à coleta e que não fizeram uso de suplementos antioxidantes.

Aspectos éticos

Todos os indivíduos foram informados dos objetivos e possíveis riscos do estudo e aceitaram participar voluntariamente. A seguir, foi assinado o termo de consentimento informado, conforme o Código de Nuremberg (1947), Declaração dos Direitos do Homem (1948) e a Declaração de Helsinque. O protocolo do estudo foi previamente submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa, seguindo o regulamento 196/1996 do Conselho Nacional de Saúde, sob registro de nº 0164.0.398.000-11.

Modelo experimental

Inicialmente, cada participante do estudo foi submetido a anamnese para caracterização dos dados demográficos e determinação dos critérios de inclusão no estudo.

Para a realização das artroplastias, os pacientes foram previamente sedados e, 15 minutos antes do procedimento cirúrgico, coletou-se 8 mL de sangue da fossa antecubital, acondicionados em um tubo de ensaio sem anticoagulante. A seguir, coletou-se 4 mL de líquido sinovial, mediante punção do joelho (artrocentese) com agulha introduzida na região suprapatelar externa (fundo de saco subquadricipital) e aliquotado em tubos de Eppendorf. Os procedimentos de coleta e cirúrgicos foram realizados no período da manhã.

Após a coleta, as amostras de sangue foram centrifugadas a 1500 rpm durante 15 minutos. O soro foi extraído e acondicionado em frascos Eppendorf para realização das dosagens bioquímicas. As amostras de soro e líquido sinovial foram armazenadas a -18°C até o momento das análises bioquímicas.

Análises bioquímicas

A capacidade de induzir a peroxidação lipídica foi aferida por meio da formação da medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) durante uma reação ácida aquecida, conforme descrito por Esterbauer e Cheeseman16.

O teor de compostos fenólicos no soro dos indivíduos foi determinado pelo método de Folin-Ciocalteau17.

A atividade da catalase se deu em meio com peróxido de hidrogênio, descrito anteriormente por Aebi15.

Após o procedimento experimental, as concentrações dos analitos foram medidas espectrofotometricamente com equipamento semiautomatizado Biosystems BTS 350.

Análise estatística

Cada variável foi submetida a análise estatística por meio do teste de normalidade Kolmogorov-Smirnov e teste de variância de Levene, sendo o nível de confiança assumido de 95% e as diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando p<0,05.

Os resultados foram transcritos para uma planilha de trabalho e analisados estatisticamente por comparação de médias, utilizando o teste de Wilcoxon-Mann-Whitney (dados não paramétricos) no pacote estatístico do SPSS 16.0, considerando p<0,05 como nível mínimo de significância. Os resultados foram expressos como média±erro padrão.

RESULTADOS

A análise estatística dos resultados mostra diminuição estatisticamente significativa na concentração de polifenóis (flavonoides) no líquido sinovial quando comparado com o soro (LS=2,9±0,9; S=8,0±4,4). A determinação de polifenóis é um tipo de indicador de defesa antioxidante e, assim, essa diminuição é indicativa de consumo desse substrato via RL oriundos da inflamação do LCA.

Gráfico 1 Análise comparativa da concentração de polifenóis no sangue e líquido sinovial de pacientes com ruptura de LCA. Resultados expressos como média±erro padrão. *p<0,01 análise de dados não paramétricos pelo teste de Wilcoxon-Mann-Whitney 

A análise da concentração de TBARS como indicador de dano lipídico via RL no soro e líquido sinovial de pacientes com ruptura do LCA (Gráfico 2) aponta aumento estatisticamente significante no líquido sinovial quando comparado ao soro (LS=1,8±1,76; S=0,06±0,04). Esse achado indica dano lipídico provocado por RL no líquido sinovial. A implicação desse encontro é que a produção e o dano oxidativo podem se estender a todos os tecidos subjacentes banhados pelo líquido na articulação podendo amplificar o dano, mas que se difunde de forma muito limitada do ponto de vista sistêmico.

Gráfico 2 Análise comparativa da concentração de TBARS no sangue e líquido sinovial de pacientes com ruptura de LCA. Resultados expressos como média±erro padrão. *p<0,01 Análise de dados não paramétricos pelo teste de Wilcoxon-Mann-Whitney 

A catalase é uma enzima antioxidante implicada na neutralização de endoperóxidos. A determinação da atividade da catalase no soro e líquido sinovial de pacientes com ruptura do LCA (Gráfico 3) mostra maior atividade da enzima no líquido sinovial quando comparado com o soro (LS=3,4±2,17; S=3,3±2,9), porém essa diferença não foi estatisticamente significante.

Gráfico 3 Análise comparativa da atividade da catalase no sangue e líquido sinovial de pacientes com ruptura de LCA. Resultados expressos como média±erro padrão 

DISCUSSÃO

O crescente interesse pela prática de atividades físicas nos dias atuais faz com que se eleve o número de complicações associadas, como o rompimento de LCA. A ruptura do LCA é a lesão de joelho de maior prevalência que, além de causar instabilidade articular no joelho, pode desencadear alterações a nível sistêmico18.

O joelho é uma das articulações mais vulneráveis do corpo durante exercícios pois, ao mesmo tempo que desenvolve movimentos complexos, tem que associá-los à manutenção do peso corporal, o que dificulta ainda mais sua atividade19), (20. Citando as partes envolvidas com a articulação, o LCA é o mais acometido21 e, conforme descrito por Cintra Neto22, quando rompido, acarreta diversas consequências para essa articulação pois a instabilidade permanente é mais alta do que qualquer outra lesão articular.

Segundo Sebben et al.23, o processo inflamatório (como o verificado após uma lesão no LCA) acarreta na produção de RL, que são produzidos incessantemente durante a ocorrência de processos metabólicos e desencadeiam um mecanismo de EO24, que nada mais é do que um desequilíbrio entre sistemas oxidantes e defesas antioxidantes, sendo favorável aos primeiros24), (25. De acordo com Pereira26, a produção de RL com a consequente formação de espécies reativas de oxigênio (ERO) é o que envolverá toda a problemática.

A relação que se estabelece entre o surgimento de um processo oxidativo no organismo após lesão articular no joelho ainda não foi bem fundamentada no que se refere a comparações entre amostras de líquido sinovial e soro, porém, segundo Baccarin27, é possível afirmar que, de modo geral, esse processo desencadeia desequilíbrio na relação entre oxidantes e antioxidantes. Os RL estão envolvidos na amplificação do dano inflamatório do líquido sinovial via EO28), (29. A maior parte dos estudos analisados avaliam o grau de estresse oxidativo no plasma dos pacientes e não no próprio líquido, como realizado neste estudo. As diferenças apontadas aqui mostram que o dano oxidativo é maior no local da inflamação e que essa intensidade não reflete diretamente de forma sistêmica (soro).

A análise dos resultados para flavonoides, eleito neste estudo como biomarcador antioxidante hidrossolúvel (Gráfico 1), mostra diminuição estatisticamente significante da concentração desses compostos no líquido sinovial induzido provavelmente por seu consumo via RL do processo inflamatório, o que não foi refletido no soro dos pacientes.

A meia-vida dos RL é extremamente curta, sendo quase impossível determiná-los em condições clínicas normais. No entanto, o dano oxidativo é possível de ser determinado analiticamente. O dano lipídico via RL pode ser determinado mediante análise da peroxidação lipídica16), (25), (26. A dosagem de TBARS se trata de um produto da oxidação de lipídeos via RL, também denominada lipoperoxidação30.

A análise do dano lipídico pela determinação de TBARS demonstra dano oxidativo significantemente mais elevado no líquido sinovial quando comparado com o soro (Gráfico 2). A correlação dos resultados elencados nos Gráficos 1 e 2 aponta que a lesão de LCA provoca consumo de antioxidantes combinado a maior dano lipídico induzido por RL de forma mais intensa no local da inflamação e que isso não repercutiu de forma sistêmica. O impacto desse desequilíbrio culmina no EO que pode ser amplificado por grau e tempo de lesão do paciente. Além disso, o líquido sinovial num perfil de EO pode expandir o dano oxidativo a tecidos subjacentes banhados por ele, agravando o quadro oxidativo e inflamatório.

Rodrigues e Barboni31) mencionam que a função da catalase está implicada na decomposição de endoperóxidos provenientes do metabolismo celular normal. Essa conversão é uma forma de proteção ao organismo contra o EO32, caso contrário, os endoperóxidos exerceriam ações degradativas e tóxicas sobre alguns tipos celulares, como eritrócitos31. A análise estatística dos resultados aponta que não houve diferença significante da atividade dessa enzima no líquido sinovial quando comparado com o soro. Considerando que a catalase é uma enzima antioxidante produzida pelo organismo em condições de EO e que a lesão de LCA geralmente é de caráter agudo, é possível que esse encontro seja reflexo de que o organismo ainda não se adaptou à condição inflamatória provocada pela lesão. Em uma fase de cronificação, possivelmente a atividade dessa enzima apresentaria aumento.

Todos os pacientes avaliados foram tratados durante a fase aguda da lesão, o que poderia justificar o EO de forma mais intensa no local da inflamação quando comparada com o soro. Isso indica que estudos de EO relacionados à lesão de LCA que utilizam o soro como matriz biológica podem apresentar sérias limitações quando realizados durante a fase aguda, uma vez que durante a cronificação os biomarcadores podem se difundir para o sangue e se alterando de forma sistêmica.

O estudo se limita pelo baixo número amostral em razão do procedimento de coleta de ambas amostras biológicas serem invasivas. Estudos futuros avaliando pacientes durante a fase aguda e fase crônica podem esclarecer se as alterações de EO sistêmicas podem ser utilizadas com confiança em estudos de lesão de LCA, uma vez que os resultados aqui obtidos permitem concluir que durante a fase aguda o soro não é uma amostra que reflete a real intensidade do processo de EO local.

O EO no líquido sinovial pode ser amplificado pelo dano a tecidos sadios banhados pelo mesmo líquido, o que pode agravar o dano e a condição clínica dos pacientes. Nesse sentido, o uso de antioxidantes se mostra uma alternativa promissora na condução clínica e pós-operatória desses pacientes.

CONCLUSÃO

A análise dos resultados obtidos neste estudo permitem concluir que o perfil oxidativo das amostras de soro e líquido sinovial de pacientes com ruptura do LCA apresentaram maior consumo de antioxidantes, associado a maior dano oxidativo provocado por RL, indicando condição de EO induzido pela lesão de LCA.

A comparação da medida de EO entre o soro e o líquido sinovial aponta que estudos desses biomarcadores no soro durante a fase aguda podem subestimar a real intensidade do dano inflamatório local.

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1Fonte de financiamento: Não houve

3Aprovado pelo Comitê de Ética sob parecer nº 0164.0.398.000-11.

Recebido: Janeiro de 2017; Aceito: Maio de 2017

Endereço para correspondência: Luciano de Oliveira Siqueira - Instituto de Ciências Biológicas, Universidade de Passo Fundo - BR Km 292, Avenida Brasil Leste, 285, São José - Passo Fundo (RS), Brasil - CEP: 99052-900 - E-mail: luciano@upf.br

Conflito de interesses: Nada a declarar

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