Introdução

A raça Girolando tem apresentado crescimento significativo, colaborando na formação e desenvolvimento de novas bacias leiteiras, que estão embasadas na lucratividade da atividade, cujo objetivo primordial é alcançar a máxima produção de leite/vaca/dia⁽¹⁾. Caso a concepção seja atrasada, a ineficiência reprodutiva pode levar à redução na produção de leite, comprometendo economicamente a atividade. Dessa forma, a literatura na área de biotecnologia reprodutiva desenvolvida com a raça Girolando (pura sintética, com grau de sangue 5/8 e outros) merece incremento e enfoque pelo papel importante na pecuária nacional.

A fertilização in vitro (FIV), uma das técnicas mais avançadas das novas biotécnicas da reprodução animal, surgiu na tentativa de ampliar o potencial reprodutivo, resolvendo, em alguns casos, a própria infertilidade. No entanto, uma das dificuldades enfrentadas que precisam ser superadas nos estudos dessa técnica é a grande variação nos resultados na produção de blastocisto que pode ser resultado da interferência não só da doadora, mas também do sêmen utilizado⁽²⁾.

A sexagem do sêmen utilizado na FIV pode produzir embriões do sexo desejado em menor período de tempo, porém, o processo de sexagem debilita os espermatozoides, deixando-os mais sensíveis devido ao estresse químico e físico aos quais são expostos durante o processo, diminuindo sua capacidade de fecundação e consequentemente produzindo menores taxas de desenvolvimento embrionário, quando comparados aos não-sexados⁽³⁾. As razões específicas das baixas taxas de fertilidade do sêmen sexado não são totalmente conhecidas.

Desde 1940, cientistas reconhecem a necessidade de obter informações objetivas acerca da porcentagem de espermatozoides móveis (de um ejaculado/de uma palheta), por acreditarem que a obtenção de dados precisos sobre o movimento espermático poderia ser utilizada para prever o potencial de fertilidade de um macho ou selecionar o melhor procedimento para a preparação do sêmen⁽⁴⁾. O potencial de fertilização de uma amostra de sêmen pode ser obtido pela análise das características seminais correlacionando os resultados com a técnica de FIV⁽⁵⁾. Vários estudos têm sido realizados com o objetivo de identificar esse potencial fecundante peculiar e a maioria dos resultados mostram diferenças entre os tipos de sêmen (sexado/convencional), raça, reprodutores utilizados, partidas e palhetas de um mesmo animal^(6-8).

A utilização de análises computadorizadas e sondas fluorescentes por meio de microscopia de epifluorescência ou citometria de fluxo são métodos que vêm sendo utilizados amplamente nos últimos anos em diversas espécies^(9,10), incluindo humanos⁽¹¹⁾, pois estes procedimentos certificam com maior acurácia a qualidade do sêmen na tentativa de minimizar os efeitos da avaliação convencional⁽¹²⁾.

Testes laboratoriais são utilizados como critério para excluir amostras de sêmen de baixo potencial fecundante⁽¹³⁾, no entanto, o grande desafio seria apontar, dentre as diversas variáveis obtidas pelo CASA (Computer-Assisted Semen Analysis), aquelas que teriam uma maior influência sobre o potencial de fertilidade⁽¹⁴⁾, e dentre os animais férteis, aqueles que suportariam os danos causados pela técnica de sexagem mantendo sua capacidade fecundante⁽³⁾. Sua adoção na rotina poderia ajudar no diagnóstico do que está atualmente classificado como infertilidade inexplicável⁽¹³⁾.

Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi comparar a taxa de blastocistos produzidos com sêmen sexado e convencional de três touros da raça 5/8 Girolando, a partir da sua utilização na fertilização in vitro de oócitos provenientes de ovários obtidos em abatedouros, associando-os às análises laboratoriais (CASA e sondas).

Material e Métodos

O experimento foi realizado entre os meses de julho a dezembro de 2013, na Estação Experimental do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), localizada no município de Arcoverde, que está localizado a uma latitude 08°25'08" sul, longitude 37°03'14" oeste, a uma altitude de 663 metros, no sertão pernambucano, clima semiárido, precipitação pluviométrica anual de 694,2 mm e uma temperatura média anual de 23,75 °C. As análises do sêmen foram realizadas no Laboratório de Andrologia do Departamento de Medicina Veterinária - ANDROLAB, da Universidade Federal Rural de Pernambuco/Recife.

Os ovários bovinos foram coletados no matadouro dos municípios de Arcoverde e Pedra, imediatamente após o abate, e transportados em garrafa térmica contendo solução fisiológica a 0,9% e 30 mg/mL de sulfato de gentamicina, à temperatura de 37 °C, para o Laboratório de Reprodução e Melhoramento Genético Animal do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA).

No laboratório, os ovários foram lavados de 2 a 3 vezes com solução salina fosfatada e tamponada -PBS (pH 7.0-7.2) e colocados em banho maria à 37 °C. Os folículos entre 3 a 8 mm de diâmetro foram aspirados com seringa de 10 mL e agulha hipodérmica 40x12 mm e o aspirado foi alocado em um tubo cônico de 50 mL. Após 5 minutos de espera, para decantação, o sobrenadante foi desprezado e, posteriormente, foram adicionados 10 mL de PBS. O conteúdo foi colocado em uma placa de Petri com fundo riscado para facilitar a busca dos complexos cumulus- oócito (COC's), com auxílio de estereomicroscópio (SMZ-745, Nikon, Tóquio, Japão). Foram utilizados apenas os COC's com citoplasma homogêneo e pelo menos três camadas de células do cumulus compactas, classificados como grau 1, com base na classificação morfológica descrita por Gonçalves et al.⁽¹⁵⁾.

Anteriormente ao início do processo de produção in vitro, durante todas as etapas, os meios foram estabilizados em estufa com 5% de CO2 e atmosfera úmida à 38,5 °C por 24 horas. Os oócitos (n=959) foram lavados com meio TALP, divididos em grupos (15 estruturas/gota) e levados para maturação por 24 horas em estufa (WaterJacketed CO2 Incubators, Thermo Scientific Forma® Series II, USA/CANADA), com atmosfera saturada de umidade com 5% de CO2 a 38,5 °C, em uma placa de Petri de 35 mm com 4 gotas de 100 µL com meio TCM 199, cobertas com óleo mineral, segundo Camargo et. al.⁽¹⁶⁾.

Para a fertilização in vitro, o sêmen (palhetas com espermatozoides sexados de mesma partida; palhetas com espermatozoides não sexados/convencionais de mesma partida) congelado/descongelado dos mesmos touros (Descongelador de Sêmen WTA/Biodux, São Paulo, Brasil), à 37 °C por 30 segundos, proveniente de três touros da raça 5/8 Girolando (CRV Lagoa -Sertãozinho/SP), foi centrifugado a 6.000 g por 7 min (ESPRESSO Microcentrífuga pessoal, ThermoScientific, USA/Canada) e selecionado pelo método Gradiente descontinuo de Percoll (4590%), para obtenção de espermatozoides móveis. As células foram ressuspendidas em 1,5 mL de meio FERT- TALP contendo heparina (33µg/mL) e centrifugadas novamente com mesma velocidade e tempo. A fertilização in vitro foi realizada em gotas de 100 |iL de meio FERT- TALP contendo 15 oócitos desnudados parcialmente, completadas com uma concentração de 2,0 x 10⁵ espermatozoides/mL, cobertas com óleo mineral, segundo Camargo et. al.⁽¹⁶⁾. Espermatozoides e oócitos foram incubados por 18 horas em atmosfera saturada de umidade com 5% de CO2 à 38,5 °C. Os touros 1, 2 e 3 passaram pelos mesmos procedimentos.

Os zigotos foram lavados em três gotas de 70 |iL do meio SOF, transferidos para placas com gotas de 100 |iL do mesmo meio, cobertas com óleo mineral, e foram encaminhadas à estufa com atmosfera saturada de umidade com 5% de CO2, à 38,5 °C, para desenvolvimento. No terceiro dia, com 48 horas do início do cultivo, foi realizado o primeiro feeding (troca de 50% do meio de cultivo - SOF) e a avaliação da taxa de clivagem. No sétimo dia, foram observados os percentuais de blastocistos.

As mesmas palhetas de sêmen (sexado e convencional), de três touros da raça 5/8 Girolando, de igual partida, que foram utilizadas para a produção in vitro, foram usadas também para as análises de integridade da célula espermática, em todas as repetições do experimento. Foram feitas três repetições de cada procedimento, uma referente a cada repetição da produção in vitro.

Para a cinética, 5 µL de cada amostra foram colocados em uma lâmina previamente aquecida (37 °C) e uma lamínula depositada sobre a gota. A lâmina foi avaliada em microscopia de contraste de fase (Eclipse 50i; Nikon, Tóquio, Japão) e as imagens foram captadas com uma câmera digital Basler A312FC (Basler Vision Technologies, Ahrensburg, Alemanha). As imagens foram capturadas e analisadas utilizando-se o software SCA™ v 5.1 (Microptics, SL, Barcelona, Espanha). Pelo menos cinco campos microscópicos, não consecutivos, selecionados aleatoriamente por amostra, foram digitalizados, registrando-se pelo menos 2.000 espermatozoides móveis. As definições de parâmetros padrão foram: linearidade (LIN), retilinearidade (STR), expressos em valores porcentuais (%); velocidade curvilínea (VCL), velocidade linear progressiva (VSL) e velocidade média da trajetória (VAP), expressas em micrometros por segundo (µm/s); amplitude de deslocamento lateral da cabeça (ALH), expresso em micrometros (pm); e frequência de batimento flagelar (BCF), expresso em hertz (Hz).

Integridade acrossômica, integridade da membrana plasmática e potencial de membrana mitocondrial foram avaliados por microscopia de epifluorescência (Carl Zeiss, Gottingen, Alemanha). Para a determinação da integridade do acrossoma, os espermatozoides foram corados com isotiocianato de fluoresceína conjugado a Peanutagglutinin (FITC-PNA), segundo Silva et al.⁽¹⁰⁾. Alíquotas (10 µL) de sêmen foram utilizadas para preparação dos estiraços, os quais foram secos à temperatura ambiente. Para corar as células, uma alíquota de 30 pL da solução de FITC-PNA (100 µg/mL em PBS) foi depositada sobre cada lâmina, incubada em câmara úmida a 4 °C por 20 min., lavada em PBS e seca no escuro. No momento da avaliação, 5 µL de meio de montagem (4,5 mL glicerol, 0,5 mL PBS, 5 mg azida sódica e 5 mg p-phenylenediamine) foram depositados sobre a lâmina e coberto com lamínula. Um total de 200 espermatozoides por lâmina foi examinado, usando-se filtros LP 515-nm para emissão e 450 - 490 BP nm para excitação, em um microscópio de epifluorescencia (Carl Zeiss, Gottingen, Alemanha; 1000 X). Os espermatozoides foram classificados como portadores de acrossoma intacto, quando apresentavam a região acrossomal corada em verde fluorescente, ou de acrossoma reagido, quando apresentavam fluorescência apenas na região equatorial da cabeça ou quando não corados em verde fluorescente.

A integridade da membrana plasmática foi determinada empregando-se uma combinação de diacetato de carboxifluoresceína (CFDA) e iodeto de propídio (PI), tal como descrito por Silva et al.⁽¹⁷⁾. Alíquotas (50 µL) de sêmen foram diluídas em 150 pL de solução Tris, contendo 5 pL de CFDA (0,46 mg/mL em DMSO) e 20 pL de PI (0,5 mg/mL em PBS), incubadas por 10 min. à 37 °C, e fixadas com PBS contendo 0,5% de glutaraldeído. Usando-se PAD 485/20 nm de excitação e PAD 580-630 nm filtros de emissão, 200 células por lâmina foram examinados (400X). Fluorescências verdes e vermelhas foram interpretadas como membrana intacta e membrana danificada, respectivamente.

Para determinação do potencial da membrana mitocondrial, um método adaptado de Guthrie e Welch⁽¹⁸⁾ foi utilizado. Alíquotas (50 µL) de sêmen foram diluídas em 150 pL de Tris, contendo 5 pL de fluorocromo catiônico lipofílico JC-1 (0,15 mM em DMSO) e incubadas durante 10 min, à 37 °C, e fixadas com 0,5% de glutaraldeído. Duzentos espermatozoides por lâmina foram examinados (400X), utilizando-se LP 515 nm e emissão de 450-490 nm BP filtros de excitação. Os espermatozoides foram classificados como alto potencial de membrana mitocondrial, ao emitirem fluorescência laranja na peça intermediária, e baixo potencial de membrana mitocondrial, quando emitiram fluorescência verde.

Os dados foram analisados pelo programa estatístico SPSS 16.0, empregando-se a análise de variância (ANOVA). O teste t-Student foi usado para detectar diferenças entre os grupos e o Qui-quadrado, para análise dos resultados da produção in vitro. Para todas as análises, os valores foram considerados significativos (P< 0,05).

Previamente às análises, dados percentuais para motilidade progressiva, integridade de acrossoma, integridade da membrana plasmática e potencial da membrana mitocondrial, linearidade, retilinearidade foram transformados em arcoseno. Os resultados foram expressos em média ± erro padrão da média.

Resultados

Quando se comparou sêmen sexado com o convencional do mesmo touro, verificou-se que para o T3 houve menor clivagem com sêmen sexado, mas sem diferença na produção de blastocistos. Para o T2 não houve diferença na clivagem, mas foi diferente na produção de blastocistos. Para o T1 não houve diferença na clivagem ou na produção de blastocistos (Tabela 1).

O resultado estatístico evidenciou diferenças (P< 0,05) nas análises do CASA entre os touros, tanto em comparações feitas entre as amostras de sêmen sexado quanto nas amostras de sêmen convencional, em diversas variáveis, principalmente as que se referem ao padrão de movimento dos espermatozoides VCL (Velocidade curvilínea); VSL (Velocidade linear); e VAP (Velocidade de trajeto). No sêmen convencional, os valores médios de VCL, VSL e VAP obtidos pelo T1 foram 66,5±0,8µm/s; 36,9±0,3µm/s e 46,4±0,5µm/s, respectivamente, e pelo T2 foram 46,2±2,5µm/s; 27,6±2,3µm/s e 33,8±2,4µm/s, respectivamente (P<0,05). Os valores obtidos pelo T3 foram 64,6±5,1µm/s; 35,3±0,6µm/s e 44,2±1,0µm/s, respectivamente, e diferiram do T2 (P<0,05) como pode ser observado na Tabela 2.

Os estudos realizados entre as amostras de sêmen sexado apresentaram diferenças entre os touros nas variáveis VCL, VSL e VAP, em que o T1 (117,7±1,6µm/s; 60,0±0,3µm/s; 73,6±0,4µm/s, respectivamente), quando comparado aos touros T2 (80,2±2,3µm/s; 47,0±2,0µm/s; 57,7±0,9µm/s, respectivamente) e T3 (86,4±5,7µm/s; 46,2±2,7µm/s; 53,8±2,8µm/s, respectivamente), obteve valores mais elevados. Já para as variáveis LIN (Linearidade) e ALH (Deslocamento lateral da cabeça), não se observou diferença estatística. O resultado da BCF (frequência de batimento de cauda) foi significativo entre os touros, de modo que o T1 apresentou 14,5±0,3 Hz > T3 (13,0±0,4 Hz) > T2 (10,5±0,3 Hz). Essas diferenças foram vistas também através dos valores de P=0,04; P=0,009, respectivamente.

Ao se compararem os resultados para as análises com sondas fluorescentes, integridade de membrana plasmática, integridade de acrossoma e potencial mitocondrial não foram observadas diferenças entre os grupos de sêmen convencional. Já para o sêmen sexado, a integridade de membrana foi a única variável que diferiu estatisticamente entre os touros (Tabela 3), em que o T1 (38 ±2,7) diferiu do T3 (53,8 ± 1,8) (P=0,009).

Discussão

Os resultados evidenciaram que a diferença entre sêmen sexado e convencional foi inerente ao touro, não havendo diferença entre touros para o sêmen convencional, no entanto, foram observadas diferenças quando da utilização do sêmen sexado, provavelmente em decorrência do sêmen de alguns touros ser mais sensível aos processos da sexagem por citometria de fluxo do que o de outros, tendo em vista que, na produção de blastocisto do sêmen sexado, T2 (17,93%) apresentou resultados inferiores ao T1 (27,69%).

Os resultados apresentados, semelhante a dados da literatura^(6-8), evidenciaram o efeito inerente ao touro, no sêmen, sobre a fertilização in vitro de oócitos bovinos, apresentando diferenças significativas entre touros da mesma raça e em partidas do mesmo touro, tanto na taxa de fertilização quanto na taxa de sobrevivência embrionária, confirmando que o fator touro tem importância determinante quanto à capacidade de fertilização, bem como quanto à capacidade de crescimento dos embriões clivados até mórula e seu posterior desenvolvimento até o estádio de blastocisto. Como pode ser observado na Tabela 1, o sêmen não sexado do touro 1 apresentou na média geral valores maiores que os touros 2 e 3 quanto aos parâmetros da cinética espermática. É possível que estas características dos movimentos espermáticos (VCL, VSL, VAP, ALH e BCF) tenham contribuído para seu melhor desempenho na produção de embriões in vitro. Os parâmetros da cinética espermática têm sido positivamente correlacionados com fertilidade⁽¹⁹⁾, dentre esses parâmetros, o VCL, VSL e ALT já foram correlacionados à hiperatividade espermática, que é considerada um padrão de motilidade observado em espermatozóides que estejam no processo de capacitação⁽²⁰⁾, e a utilização do sêmen já em processo de capacitação pode ter favorecido à fertilização in vitro.

Ao se analisarem as amostras do sêmen sexado, o T1 obteve os melhores resultados para produção de blastocistos, diferindo do T2. Nas análises do CASA, essas diferenças foram expressas de forma ainda mais definida, distinguindo-o positivamente dos demais touros nas variáveis VCL, VSL, VAP, em que é possível observar claramente que o T1 foi superior aos demais e o T3 superior ao T2, confirmando os resultados obtidos com produção in vitro, fortalecendo e corroborando dados pulicados sobre o importância da qualidade do sêmen e de sua influência na fertilidade^(3,5).

A porcentagem de espermatozoides móveis demonstrada nas variáveis VCL, VAP, STR, BCF revela uma correlação significativa com a probabilidade de se alcançar a prenhez como publicado para fertilidade na espécie humana⁽¹¹⁾.

Em estudo realizado com sêmen sexado criopreservado, observaram-se valores baixos para motilidade⁽²¹⁾, o que não foi observado no presente estudo já que os valores da cinética (VCL, VSL e VAP) do sêmen sexado do T1 (117,7±1,6µm/s; 60,0±0,3µm/s; 73,6±0,4µm/s, respectivamente), T2 (80,2±2,3µm/s; 47,0±2,0µm/s; 57,7±0,9µm/s, respectivamente) e T3 (86,4±5,7µm/s; 46,2±2,7µm/s; 53,8±2,8µm/s, respectivamente), foram superiores aos do sêmen convencional, porém não refletindo na produção in vitro.

No entanto, a integridade de membrana está entre as características físicas afetadas pela sexagem, provavelmente, devido ao estresse mecânico, nesse sentido, a redução da pressão durante o processo de sexagem aumentou a sobrevivência do espermatozoide sexado e, consequentemente, as taxas de fertilização.

Índices de fertilidade têm sido associados aos padrões de movimento espermático, tendo em vista diferenças significativas observadas no padrão de movimento exercido por espermatozoides que atingem altas e baixas taxas de fertilização⁽²²⁾.

A variável frequência de batimento de cauda (BCF) diferiu significativamente entre os touros e evidenciou maior correlação quando comparado aos valores de VCL ao se utilizar sêmen sexado (r =0,80) do que quando correlacionado ao sêmen convencional (r = 0,69). É sabido que o deslocamento lateral de cabeça já foi correlacionado com a fertilização, por indicar vigor de batimento flagelar junto com a frequência de rotação da célula, que são, provavelmente, importantes para a progressão de espermatozoides⁽²⁴⁾. Os dados obtidos no presente estudo corroboram resultados observados em outro experimento, em que o autor observou que os espermatozoides sexados demonstraram a maioria dos parâmetros de motilidade superiores aos submetidos à técnica convencional e afirmou existir fortes indícios de que espermatozoides bovinos que passam pela técnica de citometria de fluxo entram em estado de hiperativação⁽²⁵⁾.

A avaliação espermática com o auxilio das sondas fluorescentes demonstrou que o sêmen sexado do T1 apresentou menor porcentagem de membrana plasmática íntegra em comparação ao T2 e T3 (respectivamente, 38±2,7; 44,1±4,4; 53,8±1,8), demonstrando importância estatística em relação ao T3 (P<0,05), o que contradiz com os resultados da produção embrionária e o princípio da importância da integridade de membrana para obter bom resultado fertilizante⁽⁵⁾. Provavelmente por se tratar de produção in vitro em que não existem barreiras naturais a serem transpassadas, o percentual de lesão na membrana, com essa intensidade, somada às outras características com valores superiores aos demais, não influenciou de forma negativa no seu desempenho.

Apesar de a utilização do sêmen sexado na FIV ter apresentado índice de produção embrionária menor (114 blastocistos), quando comparado com a produção embrionária alcançada pelo sêmen convencional (151 blastocistos), ela é viável quando se busca a produção de embriões do sexo feminino, que é o interesse na pecuária de leite.

Considerando-se que, no sêmen sexado, 90%⁽²⁶⁾ dos produtos obtidos são do sexo desejado, pode-se considerar para o presente trabalho 102 embriões do sexo feminino dos 114 produzidos, enquanto que com o uso de sêmen convencional seriam produzidos 60%⁽²⁷⁾ de embriões do sexo masculino ou seja, dos 151 blastocistos obtidos com o sêmen convencional, aproximadamente 61 embriões seriam do sexo feminino, o que aumentaria os custos com o descarte de machos⁽²⁸⁾, tornando-se justificável o emprego do sêmen sexado para a obtenção de embriões em explorações leiteiras⁽³⁾.

Conclusão

No presente trabalho o sêmen sexado foi menos eficiente na produção de blastocistos quando comparado ao sêmen convencional. As análises do CASA bem como as sondas fluorescentes foram compatíveis com o potencial fertilizante das amostras de sêmen sexado e convencional em touros da raça 5/8 Girolando. O uso de sêmen sexado na FIV é viável diante do número de embriões obtidos.