Fator de crescimento e diferenciação - 9 (GDF-9) aumenta a taxa de crescimento in vitro de folículos antrais iniciais caprinos isolados

Resumo

Este estudo teve como objetivo investigar o efeito do GDF-9 durante o cultivo in vitro de folículos antrais iniciais caprinos isolados. Os folículos antrais iniciais isolados e selecionados foram cultivados individualmente por 18 dias, e os seguintes tratamentos foram testados: α MEM+ (tratamento controle) ou α-MEM+ suplementado com 200 ng/mL de GDF-9 (tratamento GDF-9). Os seguintes parâmetros foram avaliados: crescimento e morfologia folicular, produção de estradiol, maturação nuclear do oócito e expressão relativa de genes-chave relacionados a esteroidogênese (CYP19A1, CYP17 e receptor de insulina) e remodelamento da membrana basal (MMP-9 e TIMP-2). Em ambos os tratamentos, observou-se diminuição na porcentagem de folículos morfologicamente intactos com aumento concomitante nas taxas de folículos extrusos e degenerados (P < 0,05). O tratamento GDF-9 apresentou maiores taxas de folículos extrusos apenas no 6º dia de cultivo (P < 0,05). O diâmetro do folículo aumentou progressivamente ao longo do período de cultivo (P < 0,05) com diâmetros semelhantes entre os tratamentos em todos os tempos de cultivo (P > 0,05). O GDF-9 aumentou a taxa de crescimento diário do primeiro para o segundo terço de cultivo, sendo maior (P < 0,05) que o controle no segundo terço. A taxa de maturação oocitária assim como os níveis de estradiol e a expressão relativa de RNAm para os genes CYP19A1, CYP17, MMP-9, TIMP-2 e receptor de insulina foram similares entre os tratamentos (P > 0,05). Em conclusão, este estudo mostra pela primeira vez que GDF-9 adicionado a um meio de cultivo aumentou a taxa de crescimento de folículos antrais iniciais caprinos cultivados in vitro.

Palavras-chave:
cultivo in vitro; folículo antral; cabra; GDF-9

Abstract

This study aimed to investigate the effect of growth and differentiation factor 9 (GDF-9) during the in vitro culture of isolated caprine early antral follicles. The isolated and selected early antral follicles were individually cultured for 18 days, and the following treatments were tested: α-MEM⁺ (control treatment) or α-MEM⁺ supplemented with 200 ng/mL GDF-9. The following endpoints were evaluated: follicular growth and morphology, estradiol production, oocyte nuclear maturation, and relative expression of key genes related to steroidogenesis (CYP19A1, CYP17, and insulin receptor) and basement membrane remodeling (MMP-9 and TIMP-2). In both treatments, a decrease was observed in the percentage of morphologically intact follicles with a concomitant increase in the rates of extruded and degenerated follicles (P < 0.05). The GDF-9 treatment showed higher rates of extruded follicles only on day 6 of culture (P < 0.05). Follicle diameter increased progressively throughout the culture period (P < 0.05) with similar diameters between treatments at all culture times (P > 0.05). Growth and differentiation factor 9 increased the daily growth rate from the first to the second third of culture, with higher values (P < 0.05) than control in the second third. Oocyte maturation rate as well as estradiol levels and relative mRNA expression for CYP19A1, CYP17, MMP-9, TIMP-2, and insulin receptor genes were similar between treatments (P > 0.05). This study shows for the first time that GDF-9 added to a culture medium increased the follicle growth rate of goat early antral follicles cultured in vitro.

Keywords:
in vitro culture; antral follicle; goat; GDF-9

1. Introdução

A biotecnologia de cultivo folicular in vitro (CFIV) tem por objetivo recuperar e cultivar in vitro folículos ovarianos em diferentes estágios de desenvolvimento para utilizá-los em tecnologias de reprodução assistida. Durante o CFIV, vários antioxidantes e fatores de crescimento como o anetol e o fator de crescimento e diferenciação-9 (GDF-9), respectivamente, têm um papel fundamental na foliculogênese in vitro quando adicionados aos meios de cultivo. O anetol ou trans-anetol (1-Metoxi-4[1-propenil] benzeno) é um fenilpropanóide natural com várias propriedades relacionadas, como a antioxidante, que pode ser obtido a partir de várias espécies de plantas(¹). Recentemente, tem sido relatado resultados promissores com a adição de anetol durante o cultivo in vitro de folículos secundários caprinos, que aumentou as taxas de retomada da meiose dos oócitos e reduziu a concentração de espécies reativas de oxigênio (EROs) quando comparado com outros antioxidantes, como o ácido ascórbico(¹). Além disso, foi relatado pela primeira vez uma gestação após o cultivo in vitro de folículos antrais iniciais caprinos em meio contendo anetol(²).

Outro aditivo que tem ganhado atenção para a utilização nos meios de CFIV é o fator de crescimento e diferenciação-9 (GDF-9), um membro da superfamília do fator de crescimento transformador-beta (TGF-β) derivado dos oócitos(³) que está presente em todas as fases da foliculogênese in vivo(⁴). In vitro, o GDF-9 manteve a sobrevivência, estimulou o crescimento do oócito e do folículo e promoveu a ativação do folículo primordial quando os folículos foram cultivados in situ, isto é, inseridos nos fragmentos de ovários de mulheres(⁵) e de cabras(⁶). Quando folículos pré-antrais foram cultivados na forma isolada, o GDF-9 estimulou o crescimento de folículos e oócitos de camundongos(⁷). De acordo com isso, nosso grupo relatou os efeitos benéficos da adição de 200 ng/mL de GDF-9 a um meio contendo ácido ascórbico na sobrevivência de folículos pré-antrais caprinos isolados cultivados in vitro(⁸). No entanto, ao nosso conhecimento, não existe informação sobre a influência do GDF-9 no cultivo in vitro de folículos antrais iniciais isolados em mamíferos.

Portanto, o presente estudo teve como objetivo investigar o efeito do GDF-9 durante o cultivo in vitro de folículos antrais iniciais caprinos isolados. Para tanto, os seguintes parâmetros foram avaliados: (1) crescimento e morfologia folicular, (2) produção de estradiol, (3) maturação nuclear do oócito e (4) expressão relativa de RNA mensageiro para genes relacionados com a esteroidogênese e o remodelamento da membrana basal.

2. Material e métodos

Todas as diretrizes internacionais, nacionais e/ou institucionais aplicáveis para o cuidado e uso de animais foram seguidas. Comitê de Ética para Uso de Animais da Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, CE, Brasil - número 2422377/2016.

2.1 Produtos químicos e meios

Os reagentes e produtos químicos utilizados neste estudo foram obtidos da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA), salvo indicação em contrário.

2.2 Coleta de ovários, isolamento e seleção de folículos antrais iniciais

Os ovários (n = 60) de 30 cabras adultas e mestiças foram coletados em abatedouro local. Imediatamente após o abate, foram lavados em álcool (70%), seguido de duas lavagens em meio essencial mínimo (MEM) suplementado com penicilina (100 µg/mL), estreptomicina (100 µg/mL) e HEPES (25 mM), denominado MEM-HEPES. Os ovários foram transportados para o laboratório em meio MEM-HEPES no intervalo de 1 h, a 4 ºC(⁹). No laboratório, a gordura e o tecido conjuntivo que rodeiam os ovários foram mecanicamente removidos. Em seguida, foram obtidos fragmentos corticais (1 a 2 mm de espessura) com auxílio de uma lâmina cirúrgica (em condições estéreis). Os fragmentos foram colocados em meio MEM-HEPES. Os folículos antrais iniciais, com cerca de 300-350 µm de diâmetro, foram visualizados em estereomicroscópio (SMZ 645 Nikon, Tóquio, Japão) e microdissecados manualmente a partir de fragmentos do córtex ovariano com agulhas de calibre 26 (26 G). Apenas os folículos morfologicamente viáveis foram selecionados para o cultivo in vitro(¹⁰).

2.3 Meio de cultivo e cultivo in vitro

Os folículos selecionados foram cultivados individualmente em gotas de 100 µL de meio de cultivo α-MEM (M5650, pH 7,2-7,4) suplementado com 3 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA), 10 ng/mL de insulina, 5,5 µg/mL de transferrina, 5 ng/mL de selênio, 2 mM de glutamina, 2 mM de hipoxantina, 0,911 mM de piruvato, 50 ng/mL de hormônio do crescimento (GH) e 300 µg/mL de anetol, designado por α-MEM⁺⁽²⁾. A concentração de anetol (300 µg/mL) foi utilizada com base em estudo anterior realizado pelo nosso grupo(¹). Os seguintes tratamentos foram testados: α-MEM⁺ (controle) ou α-MEM⁺ suplementado com 200 ng/mL de GDF-9 (GDF-9). Nestas condições, os folículos foram cultivados durante 18 dias a 38,5ºC e 7,5% de CO₂ sob óleo mineral. O meio fresco foi preparado antes da utilização e pré-equilibrado overnight, sendo substituído 60 µL de meio em cada gota a cada dois dias de cultivo(²). O experimento foi repetido cinco vezes e uma média de 12 ovários foram utilizados por réplica, sendo utilizados aproximadamente 65 folículos por tratamento.

2.4 Avaliação do desenvolvimento folicular

A morfologia e o crescimento folicular foram avaliados a cada seis dias (dias 6, 12 e 18). Durante e após o cultivo, os folículos foram classificados de acordo com as suas características morfológicas em: folículos extrusos, caracterizados por terem a membrana basal rompida; folículos degenerados, quando apresentavam contorno irregular, oócito e/ou células da granulosa escurecidos e diâmetro reduzido; e folículos intactos, caracterizados quando translúcidos, com membrana basal intacta e rodeados por células da granulosa homogêneas e brilhantes, sem sinais de degeneração ou extrusão(¹¹). A taxa de crescimento folicular em cada intervalo de cultivo (dias 0-6, 6-12 e 12-18) foi calculada considerando-se o diâmetro dos folículos durante o período em que permaneceram morfologicamente intactos, ou seja, o diâmetro final menos o diâmetro inicial do período considerado, dividido pelo número de dias de cultivo (6 dias). O diâmetro folicular foi medido apenas nos folículos intactos a partir da membrana basal e calculado utilizando-se a média de duas medidas perpendiculares de cada folículo por uma ocular micrométrica (aumento de 100X) inserido em um estereomicroscópio (SMZ 645 Nikon, Tóquio, Japão) a cada seis dias de cultivo (nos dias 0, 6, 12 e 18 de cultivo).

2.5 Maturação in vitro (MIV)

Ao final do cultivo, todos os folículos morfologicamente viáveis foram cuidadosa e mecanicamente abertos. Os complexos cumulus-oócitos (CCO) contendo oócitos com citoplasma homogêneo e rodeados por, pelo menos, uma camada compacta de células do cumulus foram selecionados para a MIV(¹¹). O meio de MIV consistiu em meio de cultivo de tecidos-199 (TCM-199) suplementado com 1 µg/mL de 17β-estradiol, 5 µg/mL de hormônio luteinizante (LH), 0,5 µg/mL de rFSH, 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico (EGF), 1 mg/mL de BSA, 22 µg/mL de piruvato, 50 ng/mL de fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-I) e 100 µM de cisteamina(²). Os CCO foram maturados individualmente a 38,5 ºC em 7,5% de CO₂ durante 32 horas(¹¹). O meio de MIV e o óleo mineral frescos foram preparados antes da utilização e pré-equilibrados overnight.

2.6 Avaliação da viabilidade e configuração da cromatina do oócito

Após a MIV, os CCO foram mecanicamente desnudados e incubados individualmente em gotas de 10 µL de PBS suplementado com 5,5 µg/mL de Hoechst 33342 e 1% de glutaraldeído, em temperatura ambiente, durante 30 minutos. Em seguida, os oócitos foram processados como descrito anteriormente(¹⁰). Após a incubação, os oócitos foram lavados três vezes em PBS e montados com meio de montagem contendo 5 µg/mL de Hoechst 33342. A viabilidade dos oócitos e a configuração da cromatina foram avaliadas em microscópio de fluorescência (Nikon, Eclipse 80i, Tóquio, Japão). De acordo com a configuração da cromatina, os oócitos foram classificados como vesícula germinal (VG), metáfase I (MI), metáfase II (MII) ou degenerados (DEG).

2.7 Extração de RNA da parede folicular e PCR em tempo real (RT-qPCR)

As amostras foram processadas como descrito anteriormente(¹²). Foram coletados três pools de 10 paredes foliculares (células da granulosa e células teca) de folículos antrais iniciais de cada tratamento após o período de cultivo para isolamento do RNA total com o método do reagente Trizol® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). A purificação do RNA total foi realizada com o PureLink™ RNA Mini Kit (Ambion®, Carlsbad, CA, EUA), de acordo com as recomendações do fabricante. Após a extração, a concentração de RNA foi determinada utilizando o sistema NanoDrop (Thermo Scientific NanoDrop Products), efetuada com 2 μL do material. Antes da síntese do cDNA, todas as amostras foram padronizadas com a mesma quantidade de RNA para minimizar a variabilidade da qPCR. Para a síntese de cDNA, foram seguidas as instruções do manual Superscript III RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), utilizando primers aleatórios (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) a partir de 1 ng de RNA total.

Os primers foram desenhados para efetuar a amplificação do RNAm da aromatase (CYP19A1), do citocromo P450 17α-hidroxilase/17,20-liase (CYP17), da metaloproteinase-9 (MMP-9), do inibidor tecidual de metaloproteinases-2 (TIMP-2) e do receptor de insulina (Tabela 1). Como controles endógenos, foram selecionados dois genes de referência para estudar a expressão e a estabilidade e normalizar a expressão dos genes em todas as amostras: gliceraldeído-3-fosfatodesidrogenase (GAPDH) e peptidilprolil isomerase A (PPIA). As reações foram realizadas com um Sistema de Detecção de PCR em tempo real IQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). A deteção dos produtos de PCR foi medida através da monitorização do aumento da fluorescência emitida pelo marcador Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA). Para todas as amplificações, foi realizada uma curva de dissociação (curva de fusão) para a verificação de amplificações inespecíficas resultantes de contaminação. O ciclo térmico da qPCR foi o seguinte: desnaturação inicial e ativação da polimerase durante 15 min a 94ºC, seguida de 40 ciclos de 15 s a 94ºC, 30 s a 60ºC e 45 s a 72ºC. A extensão final foi de 10 min a 72ºC. A quantificação das transcrições dos genes alvo foi calculada a partir da diferença dos valores dos valores Cq (threshold cycle PCR) em relação às transcrições do gene endógeno, PPIA. Inicialmente, foi determinada a média dos Cqs das três leituras de cada amostra, tanto do gene alvo como do gene endógeno. De cada amostra, a subtração do valor médio do Cqgene-alvo ao Cqgeneendógeno forneceu o ΔCq. Subsequentemente, foi escolhido um ΔCq correspondente a um calibrador, normalizando todos os valores através da subtração do ΔCq resultante escolhido, para obter o ΔΔCq. Finalmente, o valor final da quantificação relativa foi dado por 2ΔΔCq, em que o calibrador ou a amostra padrão escolhida foi igual a um(¹³).

Tabela 1.
Primers de oligo nucleotídeos utilizados para a análise PCR de folículos caprinos

Gene alvo	Sequência do primer (5’→3’)	Sentido/anti-sentido *	Acesso ao banco de genes nº
Receptor de insulina	ATGCCCTGGTGTCACTTTCCTTCT TTAGGTTCTGGTTGTCCAAGGCGT	S AS	XM_012177947.3 (Ovis aries)
CYP19A1	CGGCATGCATGAGAAAGGCATCAT ACACGTCCACATAGCCCAAGTCAT	S AS	NM_001285747.1 (Capra hircus)
CYP17	ACTGAATGCCTTTGCCCTGT CTGATTATGTTGGTGATCC	S AS	NM_001314145.1 (Capra hircus)
MMP9	TTTCCTCCTGGCTCAGGCATTCA GTTTCCGAAGTAGGTCGGGATCACA	S AS	NM_001314269.1 (Capra hircus)
TIMP2	AGAAGAAGAGCCTGAACCACAGGT TGATGTTCTTCTCCGTGACCCAGT	S AS	XM_018063674.1 (Capra hircus)
GAPDH	ATGCCTCCTGCACCACCA AGTCCCTCCACGATGCCAA	S AS	XM_027541122.1 (Ovis aries)
PPIA	TCATTTGCACTGCCAAGACTG TCTCCAAACGTTATCGTC	S AS	XM_018047035.1 (Capra hircus)

• S, Sentido; AS, Anti-sentido. Fonte: Dados da própria investigação.

2.8 Ensaio de estradiol

A relação potencial entre o desenvolvimento folicular e a produção de estradiol nos folículos antrais iniciais foi investigada utilizando o meio de cultivo coletado no dia 18 do cultivo in vitro de cada tratamento e armazenado a -80 ºC até a análise. Os níveis de estradiol foram medidos apenas no meio de cultivo a partir do qual os folículos produziram oócitos que retomaram a meiose após a maturação in vitro(¹⁴). Foi utilizado um ensaio fluorescente ligado a uma enzima (ELFA), (Vidas® Estradiol II - 30431), e um analisador automático miniVIDAS® (bioMérieux SA, Lyon, França), para determinar as concentrações de estradiol. O coeficiente de variação intra-ensaio foi de 5%.

2.9 Análises estatísticas

As análises estatísticas foram realizadas com o programa Sigma Plot 11 (Systat Software Inc., EUA). A normalidade (teste de Shapiro-Wilk) e a homogeneidade da variância (teste de Levene) foram previamente avaliadas. A comparação das médias foi analisada por ANOVA, seguida do teste posthoc de Student-Newman-Keuls. As variáveis proporcionais (intactos, degenerados, extrusos e retomada da meiose) foram analisadas entre os tratamentos e dias de cultivo pelo teste do qui-quadrado ou teste G. As diferenças foram consideradas significativas com P < 0,05 e os valores são apresentados como média (± erro padrão da média, EPM) ou porcentagens.

3. Resultados e discussão

Em ambos os tratamentos, observou-se uma diminuição na porcentagem de folículos morfologicamente intactos (Fig. 1A) com um aumento concomitante nas taxas de folículos extrusos (Fig. 1B) e degenerados (Fig. 1C) (P < 0,05). Observou-se também que o tratamento com GDF-9 não afetou a porcentagem de folículos intactos em comparação com o tratamento controle nos diferentes intervalos de cultivo avaliados (P > 0,05). Num estudo recente, a adição de GDF-9 na mesma concentração que a utilizada neste estudo também não afetou a viabilidade de folículos pré-antrais incluídos em fragmentos ovarianos de catetos(¹⁵). Além disso, a suplementação de GDF-9 durante o cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos acrescida de concentrações fisiológicas de insulina (10 ng/mL) igualmente contidas no meio, parece ter sido desnecessária para o desenvolvimento folicular(¹⁶). O resultado obtido neste estudo é semelhante aos resultados de trabalhos anteriores em que a adição de insulina (10 ng/mL), por si só, mostrou-se capaz de manter a viabilidade de folículos antrais isolados(¹⁷,¹⁸). Isto sugere que a manutenção da viabilidade dos folículos antrais durante o cultivo in vitro não depende apenas de fatores específicos, como o GDF-9, mas está também relacionada com a riqueza da composição do meio como um todo, incluindo a insulina, a transferrina, o selênio e a suplementação com anetol. De fato, o anetol é um antioxidante promissor e estudos recentes demonstraram que o anetol aumentou a percentagem de retomada da meiose de oócitos maduros após o cultivo in vitro de folículos pré-antrais tardios isolados de cabras(¹). Além disso, o anetol foi capaz de aumentar a produção in vitro de embriões após a fertilização in vitro de oócitos caprinos provenientes do cultivo in vitro de folículos antrais iniciais(²).

Figura 1.
Percentagem de folículos antrais iniciais caprinos morfologicamente (A) intactos, (B) extrusos e (C) degenerados nos dias 6, 12 e 18 de cultivo na ausência (tratamento controle) ou presença de GDF-9 (tratamento GDF-9). ^a-c Valores sem uma letra comum indicam uma diferença entre dias dentro do mesmo tratamento (P < 0,05). ^A,B Os valores sem uma letra comum indicam uma diferença entre os tratamentos (P < 0,05).

Em comparação com o tratamento controle, o tratamento com GDF-9 apresentou taxas mais elevadas de folículos extrusos apenas no sexto dia de cultivo (P < 0,05).

A preservação da parede folicular durante o crescimento do folículo depende de um equilíbrio fino entre os fatores envolvidos no remodelamento da membrana basal, por exemplo, a metaloproteinase-9 da matriz (MMP-2 e MMP-9) e o inibidor tecidual de metaloproteinases-2 (TIMP-1 e TIMP-2)(¹⁹). Embora o tratamento com GDF-9 tenha apresentado taxas mais elevadas de folículos extrusos no sexto dia de cultivo, no final do período de cultivo (18º dia), as taxas de extrusão de folículos eram semelhantes (P > 0,05) entre os tratamentos. Estes resultados estão de acordo com a análise da expressão dos genes realizada no 18º dia de cultura que mostrou níveis equivalentes (P > 0,05) de mRNA para MMP-9 e TIMP-2 entre os tratamentos (figura 2). O diâmetro do folículo aumentou progressivamente ao longo do período de cultura (P < 0,05) com diâmetros semelhantes entre os tratamentos em todos os intervalos de cultivo (P > 0,05), conforme mostrado na tabela 2.

Figura 2.
Expressão média (± EPM) relativa do RNAm de CYP19A1, CYP17, TIMP-2, MMP-9 e receptor de insulina em folículos antrais iniciais de cabras cultivados durante 18 dias na ausência (tratamento controle) ou na presença de GDF-9 (tratamento GDF-9). Entre os tratamentos (P > 0,05).

Tabela 2.
Diâmetro folicular médio (± EPM) dos folículos antrais iniciais caprinos cultivados na ausência (tratamento controle) ou na presença de GDF-9 (tratamento GDF-9)

Tratamentos (n)	Diâmetro folicular (mm)
	Dia 0	Dia 6	Dia 12	Dia 18
Controle (63)	328.2 ± 3.7aA	384.4 ± 8.3bA	425.8 ± 11.6cA	477.6 ± 16.8dA
GDF-9 (65)	323.4 ± 2.8aA	365.9 ± 5.9bA	436.4 ± 10.1cA	474.0 ± 15.4dA

• Abreviações: EPM, erro padrão da média. ^a-d Letras diferentes denotam diferenças significativas entre os períodos de cultivo dentro do mesmo tratamento (P < 0,05). Fonte: Dados da própria pesquisa.

Por outro lado, o GDF-9 aumentou a taxa de crescimento diário do primeiro para o segundo terço do cultivo, sendo superior (P < 0,05) ao controle no segundo terço (Tabela 3). No entanto, essa diferença se dissipou no último terço do cultivo (dias 12-18). Diferentemente do nosso estudo, um trabalho anterior demonstrou que o GDF-9 promoveu o crescimento in vitro de folículos préantrais humanos inclusos em tecido ovariano, estimulando a proliferação e diferenciação das células da granulosa(⁵). As diferenças entre o sistema de cultivo (isolado vs. in situ) e as fases do folículo (pré-antral vs. antral inicial) podem explicar estes resultados. Adicionalmente, o efeito do GDF-9 promovendo um aumento na taxa de crescimento dos folículos antrais do primeiro para o segundo terço do cultivo in vitro pode estar associado ao efeito mitogénico desta substância nas células da granulosa. Em um estudo prévio, observou-se que o GDF-9 estimulou a progressão das fases G0 e G1 para a fase S, e da fase S para a fase M do ciclo celular de células da granulosa luteinizadas humanas cultivadas in vitro(²⁰). Uma possível resposta para o efeito transitório do GDF-9 para esse parâmetro pode estar ligada ao perfil transcricional das células da granulosa e do oócito, embora apresentem receptores BMPR-II em todos os estágios foliculares(⁴), o GDF-9 parece ser mais requerido nas fases iniciais do desenvolvimento folicular, e durante os eventos de ovulação e maturação do oócito, na espécie caprina.

Tabela 3.
Média (± EPM) das taxas de crescimento folicular em cada intervalo de cultivo (μm/dia) e concentração de estradiol (pg/mL) de folículos antrais iniciais caprinos cultivados na ausência (tratamento controle) ou na presença de GDF-9 (tratamento GDF-9)

Tratamentos (n)	Taxas médias de crescimento folicular em cada intervalo de cultivo (μm)			E2 (pg/mL)
	Dias 0-6	Dias 6-12	Dias 12-18	Dia 18
Controle (65)	9.4 ± 1.0aA	7.0 ± 0.8aA	6.7 ± 1.0aA	146.4 ± 32.2a
GDF-9 (63)	7.2 ± 0.7aA	11.6 ± 1.0bB	7.2 ± 1.1aA	146.8 ± 54.8a

• Abreviaturas: EPM, erro padrão da média. ^A,B Letras diferentes dentro de uma coluna denotam diferenças significativas entre os tratamentos no mesmo ponto de tempo (P < 0,05). ^a,b Letras diferentes denotam diferenças significativas entre os períodos de cultivo dentro do mesmo tratamento (P < 0,05). Fonte: Dados da própria pesquisa.

Todos os outros parâmetros avaliados no dia 18 foram comparáveis entre os dois tratamentos, ou seja, a produção de estradiol (Tabela 3), os níveis de RNAm para o receptor de insulina, CYP19A1, CYP17 (Figura 2) e as taxas de sobrevivência, crescimento e maturação de oócitos (P > 0,05), os últimos mostrados na tabela 4. A expressão de RNAm para genes-chave relacionados com a esteroidogênese, bem como a produção de estradiol(²¹), mostrou que tanto o controlo como o tratamento com GDF-9 proporcionaram condições adequadas para o desenvolvimento folicular in vitro.

Tabela 4.
Média (± EPM) do diâmetro dos oócitos e percentagens de oócitos degenerados, vesícula germinativa, retomada da meiose, metáfase I e metáfase II de folículos antrais iniciais de cabras cultivados durante 18 dias na ausência (tratamento controle) ou na presença de GDF-9 (tratamento GDF-9)

Tratamentos (n)	Diâmetro do oócito (μm)	DEG (%)	VG (%)	Retomada da meiose (%)	MI (%)	MII (%)
Controle (65)	113.8 ± 2.3a	49.23 (32/65) A	13.85 (9/65) A	36.92 (24/65) A	9.23 (6/65) A	23.08 (15/65) A
GDF-9 (63)	108.5 ± 2.2a	38.10 (24/63) A	19.05 (12/63) A	42.86 (27/63) A	19.05 (12/63) A	19.05 (12/63) A

• Abreviaturas: EPM, erro padrão da média; vesícula germinal, VG; oócito degenerado, DEG; metáfase I, MI; e metáfase II, MII. Fonte: Dados da própria pesquisa.

No presente estudo, a adição de GDF-9 estimulou o crescimento folicular durante o cultivo, mas não afetou nenhum outro parâmetro estudado. Uma possível explicação para estes resultados é a elevada qualidade do meio de base utilizado no presente estudo, que continha, entre outros suplementos, anetol. De fato, o anetol adicionado durante o CFIV de folículos antrais iniciais caprinos já havia demonstrado aumentar o crescimento folicular, a produção de estradiol, o crescimento de oócitos, a maturação e a produção de embriões in vitro(²).

4. Conclusão

Em conclusão, este estudo mostrou pela primeira vez que o GDF-9 adicionado a um meio de cultura contendo anetol aumentou a taxa de crescimento folicular de folículos antrais iniciais isolados de cabras e cultivados in vitro. No entanto, não teve qualquer efeito na produção de estradiol ou na maturação de oócitos in vitro. Tendo em conta a importância fisiológica do GDF-9 durante a ativação e o desenvolvimento folicular subsequente in vivo, seria muito importante que futuros estudos investigassem o efeito da adição de GDF-9 durante o cultivo in vitro de folículos na produção in vitro de embriões.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer às agências de fomento à pesquisa do Brasil. Esta pesquisa foi financiada por bolsas do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq-79/2013 área 3 - Rede Nordeste de Biotecnologia, e Rede de Pesquisa em Ovários Artificiais, processo no. 407594/2013-2). André Santos foi financiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brasil.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  22 Set 2023
• Data do Fascículo
  2023

Histórico

• Recebido
  13 Jan 2023
• Aceito
  02 Jun 2023
• Publicado
  14 Ago 2023