Efeito de diferentes frequências semanais de treinamento sobre parâmetros de estresse oxidativo

Resumos

Intense muscle contraction induced by physical exercise increases the production of reactive oxygen species, which causes oxidative stress in several organs, such as the liver and the heart. Physical training may increase antioxidative defenses and decrease oxidative stress. However, it is not clear what training frequency improves oxidative stress parameters. This study evaluated the effect of training two and three times a week on oxidative stress biomarkers in the liver and the heart. Eighteen young male mice (CF1) weighing 30 to 35 g were divided into three groups (n=6): no training (NT); twice a week training (T2); and three times a week training (T3). The training program lasted eight weeks, and the animals were killed 48 hours after the last training session. The liver and the heart were removed and stored at -70o C. The following analyses were conducted: thiobarbituric acid reactive substances, protein carbonylation, total thiol content, superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase. Oxidative damage was reduced only in the T3 group, and there was an increase in total thiol content, supeoxidase dismutase and catalase in T3 when compared with the NT group. Glutathione peroxidase was not significantly different between groups. Only training three times a week seemed to reduce oxidative stress and increase the efficiency of the antioxidant system in mice.

Antioxidant enzymes; Oxidative damage; Physical exercise; Training frequency

ARTIGO ORIGINAL

Efeito de diferentes frequências semanais de treinamento sobre parâmetros de estresse oxidativo

Camila Baumer Tromm; Guilherme Laurentina da Rosa; Karoliny Bom; Izadora Mariano; Bruna Pozzi; Talita Tuon; Luciano Acordi da Silva; Ricardo Aurino de Pinho

Universidade do Extremo Sul Catarinense. Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde. Laboratório de Fisiologia e Bioquímica do Exercício. Criciúma, SC. Brasil

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Durante a contração muscular intensa induzida pelo exercício físico, há aumento na produção de espécies reativas de oxigênio, ocasionando estresse oxidativo em diversos órgãos, dentre eles o fígado e o coração. O treinamento físico pode aumentar as defesas antioxidantes e diminuir o estresse oxidativo. Contudo, ainda existem dúvidas sobre a frequência de treinamento necessária para melhorar parâmetros de estresse oxidativo. Este trabalho tem como objetivo verificar o efeito das frequências de duas e três vezes de exercício por semana sobre biomarcadores de estresse oxidativo no fígado e coração. Foram utilizados 18 camundongos machos (CF1), jovens (30 a 35g) divididos em grupos (n=6/grupo): não treinado (NT); treinado duas vezes por semana (T2) e treinado três vezes por semana (T3). Os animais foram submetidos ao treinamento durante oito semanas. Quarenta e oito horas após a última sessão os animais foram sacrificados. O fígado e o coração foram removidos e armazenados em freezer – 70ºC. Foram analisadas as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, carbonilação de proteínas, conteúdo total de tióis, atividades da superóxido dismutase , catalase e glutationa peroxidase. Os resultados demonstraram que apenas o grupo T3 reduziu dano oxidativo. Ademais, houve aumento no conteúdo total de tióis, atividades da superóxido dismutase e catalase no mesmo grupo em comparação com o não treinado. A atividade da glutationa peroxidase não apresentou diferença significativa entre os grupos. Este estudo demonstrou que somente a frequência de treinamento de três vezes por semana reduz dano oxidativo e aumenta a eficiência do sistema enzimático antioxidante de camundongos.

Palavras-chave: Exercício físico; Estresse oxidativo; Antioxidantes.

INTRODUÇÃO

Durante a contração muscular induzida por exercícios, o consumo de oxigênio pode aumentar de 10 a 20 vezes em níveis sistêmicos e de 100 a 200 vezes em níveis musculares em relação aos valores de repouso¹, ocasionando concomitantemente elevada produção de espécies reativas de oxigênio (EROs)^2,3.

O desequilíbrio entre produção e remoção das ERO leva ao processo de estresse oxidativo (EO) que está associado a danos musculares e disfunções metabólicas e, por conseguinte, redução do desempenho físico^2,4. Adicionalmente, o EO altera o funcionamento fisiológico de diversos órgãos, dentre eles o fígado e o coração. A alta taxa metabólica apresentada por esses órgãos está associada ao alto fluxo de elétrons na cadeia respiratória mitocondrial e consequente elevada produção de EROs⁵.

O fígado é o principal órgão relacionado ao controle metabólico e diversos autores sugerem que o mesmo é acometido, de forma importante, ao EO durante e após o exercício físico^6,7. Do mesmo modo, o coração, órgão central do sistema circulatório, também apresenta um elevado consumo de oxigênio durante a realização de exercícios, o que favorece a produção de EROs. As EROs são produzidas principalmente em decorrência de vazamento de elétrons ao nível da Coenzima Q entre os complexos I e III da cadeia de transporte de elétrons (CTE). Ainda, a xantina oxidase presente no citosol e a NADPH oxidase presente na membrana celular são outras fontes importantes de produção de EROs durante a realização de exercício físico¹. O estresse oxidativo provoca diversas alterações em células hepáticas e cardíacas, podendo ocasionar doenças como esteatose hepática, hepatite C e aterosclerose. No entanto, o treinamento físico quando bem planejado, pode melhorar tanto os mecanismos de defesa antioxidantes^5,6,8, como a capacidade oxidativa do tecido⁹, podendo diminuir a magnitude do ataque oxidativo^10,11 e prevenir efeitos deletérios decorrentes do mesmo^12,13.

Estudos prévios em modelo animal já demonstraram que o treinamento físico altera positivamente o estado redox de inúmeras células e tecidos e pode melhorar parâmetros de estresse oxidativo^5,10,14,15. Conhecimento este que pode ser transponível aos humanos, dado o vínculo existente entre as diferentes espécies animais, extrapolando, assim, os dados obtidos em pesquisa animal para a espécie humana. Silva et al.⁵ e Frederico et al.¹² demonstraram que oito semanas de treinamento com cinco sessões semanais foram suficientes para reduzir o estresse oxidativo no fígado⁵ e no coração¹². Contudo, não se sabe se as frequências de duas e três sessões semanais efetuadas durante oito semanas de treinamento serão suficientes também para induzir melhorias nos parâmetros de EO nos tecidos hepático e cardíaco. Diante do exposto, o objetivo do presente estudo foi verificar os efeitos das frequências de duas e três vezes semanais de exercício por um período de oito semanas sobre parâmetros de estresse oxidativo em fígado e coração de camundongos.

PROCEDIMENTOS METODOLÓGICOS

O protocolo do estudo foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade do Extremo Sul Catarinense, Santa Catarina , Brasil, de acordo com "Guiding Principles in the Care and Uses Animals"¹⁶. Foi utilizado um total de 18 camundongos machos (CF1), com idade, aproximadamente, de 90 dias, com massa corporal entre 30 e 35g, provenientes do biotério da Universidade do Extremo Sul Catarinense. Os animais foram alojados em gaiolas coletivas de polipropileno, e foram alimentados "ad libitum'' com água e uma dieta equilibrada (Purina^®). Durante o período de experimento, todos os animais foram mantidos em uma sala com temperatura controlada de, aproximadamente, 23ºC e com um fotoperíodo definido de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão.

Protocolo experimental

Os camundongos foram divididos randomicamente em três grupos (n=6): não treinado (NT); treinado duas vezes por semana (T2) e treinado três vezes por semana (T3). Todos os animais foram adaptados em esteira ergométrica por uma semana (10m/min, sem inclinação, durante 10 min/dia) todos os dias da semana. Após o período de adaptação, os grupos T2 e T3 foram submetidos a oito semanas de treinamento (corrida em esteira), com velocidade constante de 13m/min, sem inclinação, totalizando 45 minutos por sessão⁹. Esta velocidade de treinamento corresponde a uma intensidade moderada de aproximadamente 78% do VO_{2 máx}¹⁷. Quarenta e oito horas após a última sessão de treinamento, os animais foram anestesiados através da administração intraperitoneal de Ketamina (80mg/kg) e Xilazina (12mg/kg) e posteriormente, sacrificados. O fígado e o coração foram cirurgicamente removidos e imediatamente armazenados em freezer – 70ºC para posterior análise.

Marcadores de dano oxidativo

Os danos oxidativos em lipídeos foram determinados a partir da formação de substâncias reativas ao aquecimento do ácido tiobarbitúrico (TBARS) o qual foi mensurado espectrofotometricamente (532nm), e expresso em nmol/mg de proteína, conforme descrito por Draper & Hadley¹⁸.

Os danos oxidativos em proteínas foram mensurados pela determinação de grupos carbonilas baseados na reação com dinitrofenilhidrazina. O conteúdo de carbonila foi determinado espectrofotometricamente (370nm), usando um coeficiente 22.000 Molar^-1, e expresso em nmol/mg de proteína, como previamente descrito por Levine et al.¹⁹.

O conteúdo total de tióis (TT) foi determinado numa reação dos grupos tióis com 5,5 ditióbis (ácido nitro-benzóico) (DTNB), gerando um derivado de coloração amarela. A leitura do conteúdo de TT foi feita espectrofotometricamente (412nm) e expressa em DTNB/mg de proteína²⁰.

Atividade enzimática antioxidante

A atividade enzimática da superóxido dismutase (SOD) foi determinada pela inibição da auto-oxidação da adrenalina medida espectrofotometricamente (480nm), expressa em U de SOD/mg de proteína, como previamente descrito por Bannister & Calabrese²¹.

A atividade enzimática da catalase (CAT) foi determinada pela diminuição no consumo de peróxido de hidrogênio, medido espectrofotometricamente (240nm) e expressa em U de CAT/mg de proteína, conforme previamente descrito por Aebi²².

A determinação da atividade da Glutationa Peroxidase (GPX) foi realizada a partir da taxa de decaimento da NADPH, determinada por espectofotômetria (340nm), e expressa em mM/min/mg de proteína, conforme Flohé e Gungler²³.A quantidade de proteínas em todos os ensaios foi mensurada usando a técnica de Lowry et al.²⁴.

Análise Estatística

Os dados foram expressos como média e erro padrão da média e analisados estatisticamente por meio da análise de variância (ANOVA) one-way, seguido pelo teste post hoc de Tukey. O nível de significância pré-estabelecido foi de 5% (p <0,05). O software utilizado para análise dos dados foi o Statistical Package for the Social Sciences (SPSS®), versão 17.0 para Windows.

RESULTADOS

Conforme figura 1A, os resultados demonstram menor nível de TBARs no fígado (0,13±0,02nmol/mg de proteína) e no coração (0,20±0,01 nmol/mg de proteína) no grupo T3 em relação ao não treinado (0,25±0,02; 0,36±0,06 nmol/mg/proteína), respectivamente. Da mesma forma, os resultados de carbonilação de proteínas (figura 1B) demonstram uma diminuição no conteúdo de carbonilas no fígado (0,19±0,049nmol/mg de proteína) e no coração (0,15±0,011nmol/mg de proteína) no grupo T3 em relação não treinado (0,35±0,041; 0,26±0,017nmol/mg de proteína), respectivamente. Entretanto o treinamento realizado duas vezes por semana (T2) não foi suficientemente capaz de alterar os níveis de TBARS e conteúdo de carbonilas no fígado (0,23±0,02; 0,32±0,09) e no coração (0,32±0,03; 0,24±0,04nmol/mg de proteína) em relação aos animais não treinados. Os resultados de tióis totais observados na figura 1C demonstram maior conteúdo no fígado (71,08±4,79DTNB/mg de proteína) e no coração (97,7±14,2DTNB/mg de proteína) dos animais pertencentes ao grupo T3 em relação ao grupo não treinado (41,7±4,07; 41,6±8,3DTNB/mg de proteína) respectivamente. Entretanto, o grupo submetido ao treinamento com duas sessões semanais não foi suficientemente capaz de alterar este marcador (47,7±4,2; 51,9±5,8DTNB/mg de proteína) em relação ao grupo não treinado.

Os valores foram apresentados em Média ±EPM, avaliados por ANOVA seguido pelo teste de Tukey. A lipoperoxidação e a carbonilação de proteínas foram expressas em nmol/mg de proteína e o conteúdo total de tióis expresso em DTNB/mg de proteíona. p < 0,05, * vs NT.

Em relação às atividades das enzimas antioxidantes, os resultados mostrados pela figura 2A denotaram aumento no fígado (0,37±0,05U/mg de proteína) e no coração (0,23±0,02U/mg de proteína) da atividade da SOD no grupo T3 em comparação ao grupo S (0,15±0,01; 0,12±0,01U/mg de proteína). Entretanto, o treinamento físico realizado apenas duas vezes por semana (T2) não foi suficientemente capaz de alterar este marcador (0,24±0,030,07±0,006U/mg de proteína). Similarmente, a atividade da CAT (figura 2B) mostrou-se aumentada no fígado (0,17±0,03U/mg de proteína) e no coração (0,45±0,04 U/mg de proteína) no grupo T3 em relação ao grupo não treinado (0,07±0,02; 0,02±0,001UdeCAT/mg de proteína). Novamente, o treinamento realizado duas vezes por semana (T2) não foi suficientemente capaz de aumentar a atividade da CAT no fígado (0,05±0,01) e no coração (0,02±0,001U/mg de proteína) em relação ao grupo não treinado. A atividade da GPX (figura 2C) no grupo T2 e T3 no fígado (0,8±0,06; 1,0±0,1mM/mg de proteína) e no coração (0,7±0,1; 0,9±0,1mM/mg de proteína) não foi significativamente diferente em relação ao grupo não treinado (0,7±0,1; 0,6±0,04 mM/mg de proteína).

DISCUSSÃO

Estudos demonstraram que o exercício físico exaustivo aumenta a produção das EROs e, consequentemente provoca EO em diversos órgãos e tecidos^6,7. Entretanto, estudos demonstraram que o exercício crônico moderado produz adaptações metabólicas que podem ajudar a reduzir o EO em diversos órgãos, principalmente, em populações especiais^13,14.

Sobre as adaptações fisiológicas decorrentes da prática de treinamento físico realizada com duas sessões semanais de exercício, Dalleck et al.²⁵ reportaram melhoras nos parâmetros fisiológicos de treinamento (lactato e VO₂max.). Entretanto, ainda não se tem claro as respostas bioquímicas sobre os marcadores de estresse oxidativo. O resultado do presente estudo demonstrou que duas sessões de exercício por semana não são suficientes para promover melhorias nos parâmetros de EO. É possível que um longo período de intervalo (>72horas) entre as sessões ultrapasse a fase de supercompensação inibindo o efeito adaptativo bioquímico do treinamento.

Sabe-se que a relação entre EO e exercício físico está diretamente relacionada à intensidade e duração do treinamento^2,26. Assim, o protocolo de treinamento deve ter intensidade e volume suficiente, a fim de criar uma resposta adaptativa ao organismo a cada sessão. Portanto, de acordo com nossos resultados, sugere-se que são necessárias no mínimo, três sessões semanais, durante oito semanas de exercício para reduzir danos oxidativos e aumentar a atividade das enzimas antioxidantes no fígado e no coração dos animais.

As EROs atacam lipídeos e proteínas celulares abstraindo seus elétrons, a fim de encontrar um estado químico estável1. Os resultados do presente estudo demonstram, ainda, que animais submetidos, no mínimo, a três sessões semanais de treinamento, apresentam menores níveis de danos em lipídeos (TBARS) e proteínas (CP). Estes achados corroboram os resultados de diversos estudos que encontraram redução nos parâmetros de estresse oxidativo com programa de treinamento similar (frequência semanal de três vezes)^14,27.

A diminuição dos danos oxidativos induzidos pelo treinamento físico pode ser explicada por, pelo menos, três principais mecanismos. Primeiro, pelo aumento tanto da expressão¹² como da atividade⁹ de enzimas antioxidantes. Segundo, pela redução na produção de oxidantes¹³ e também, por menor extravasamento de elétrons mitocondrial⁹. E terceiro, outro mecanismo que poderia explicar esse fenômeno é a exposição crônica do tecido às ERO, induzida pelo treinamento, tornando o órgão mais resistente aos efeitos derivados do mecanismo de estresse oxidativo¹⁰.

As EROs podem modificar aminoácidos por reações em cadeia por meio de agregados de proteínas suscetíveis a degradações proteolíticas. Durante esse processo, alguns aminoácidos são convertidos em derivados de carbonil¹. Está bem estabelecido na literatura que as proteínas oxidadas são menos degradadas por proteassomas. Essas proteases intracelulares são responsáveis por 70 a 80% da degradação após exposição oxidante, exercendo um papel essencial no sistema antioxidante²⁸. Um dos possíveis mecanismos para redução nos níveis de carbonilação de proteínas (CP), segundo Radák et al.¹¹ é que o treinamento físico aumenta a atividade de proteassomas como um processo adaptativo à oxidação de proteínas, acelerando o reparo das mesmas (turnover protéico).

Outro marcador importante da oxidação protéica é o conteúdo total de tióis (TT). O presente trabalho demonstrou aumento no conteúdo total de tióis somente no grupo T3. Esta técnica verifica a quantidade de sulfidrilas (SH) não oxidadas, que estão presentes nos aminoácidos²⁰. O grupo SH pode ser oxidado por radicais livres, comprometendo o funcionamento das proteínas. Uma possível explicação para esses resultados é o aumento das proteínas de estresse (HSP) induzidas pelo exercício²⁶. Essas proteínas têm a função de controlar a homeostase celular, protegendo contra a excessiva oxidação. Contudo, a dosagem das HSP foi uma limitação do presente estudo.

Em relação às atividades das enzimas antioxidantes, os resultados apontaram aumento da SOD e CAT somente no grupo treinado com três sessões semanais. A SOD dismuta o radical superóxido (O₂^•-) em peróxido de hidrogênio (H₂O₂)_, o qual é subsequentemente catalisado pela CAT e convertido em água e oxigênio molecular. Alguns estudos têm apontado que o treinamento físico não exerce efeito sobre as enzimas antioxidantes no fígado⁷ e no coração²⁹. Por outro lado, os resultados do presente estudo estão de acordo com outros estudos, demonstrando que o treinamento físico aumenta atividade da SOD no fígado^5,6 e no coração¹⁵.

Após o treinamento físico, a atividade da SOD aumenta, provavelmente, como resposta ao estresse oxidativo induzido pelo exercício. Este achado pode ser explicado pelo fato do treinamento físico regular ativar fatores de transcrição como o NF-kB, sendo este responsável por acionar uma variedade de genes, incluindo SOD mitocondrial³⁰.

O efeito do treinamento sobre a atividade e expressão da CAT é ainda inconsistente e controverso¹⁰. Contudo, o aumento da atividade dessa enzima foi observado no fígado⁵ e no coração de ratos treinados⁸. O treinamento físico ativa fatores de transcrição como a AMPK, que ativam CATmRNA, estimulando sua síntese protéica e possivelmente, aumentando a sua atividade^1,8. Ademais, a alta atividade da CAT pode ser atribuída à formação de H₂O₂ pela SOD. Segundo Halliwel e Gutteridge¹, a interação química do H₂O₂ no sítio ativo da catalase faz com que um dos átomos de hidrogênio seja transferido do primeiro oxigênio para o segundo, ocasionando uma quebra heterolitica entre os átomos e formando água (molécula não deletéria). Isto, por sua vez, explica a diminuição do dano oxidativo nos tecidos.

Em contrapartida, a atividade da glutationa peroxidase (GPX), não apresentou diferença significativa entre os grupos experimentais do presente estudo. A GPX e a CAT possuem funções similares no que se refere à decomposição do H₂O₂. No entanto, sob esse aspecto, a GPX é mais eficiente na presença de altas concentrações de EROs, enquanto que a CAT desempenha importante função em presença de baixas concentrações de H₂O₂³. Uma hipótese para os resultados supracitados é que o treinamento físico realizado três vezes por semana proporcionou um efeito adaptativo no balanço redox de antioxidantes, fazendo com que as baixas concentrações de H₂O₂ sofressem ação somente da CAT.

CONCLUSÃO

Tomados em conjunto, os resultados do presente estudo demonstraram que o treinamento em esteira com frequência semanal de três vezes, reduz o dano oxidativo e aumenta a eficiência do sistema enzimático antioxidante no fígado e coração de camundongos.

Recebido em 23/05/11

Revisado em 16/08/11

Aprovado em 18/08/11

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Jan 2012
• Data do Fascículo
  2012

Histórico

• Recebido
  23 Maio 2011
• Aceito
  18 Ago 2011
• Revisado
  16 Ago 2011