Material experimental

Os materiais vegetais utilizados nesse trabalho foram provenientes da fase de multiplicação de três clones de Eucalyptus urophylla x Eucalyptus globulus (C01, C04 e C16) e três clones de Eucalyptus grandis x Eucalyptus globulus (C26, C29 e C30), oriundos da empresa Celulose Nipo-Brasileira S.A. (CENIBRA), localizada no município de Belo Oriente, Minas Gerais. Esses clones foram obtidos pela hibridação interespecífica, realizada em programa de melhoramento estabelecido pela empresa, com a utilização de pólen de Eucalyptus globulus, procedente do Instituto Raiz, de Portugal, e como genitores femininos, genótipos superiores de Eucalyptus urophylla e Eucalyptus grandis da própria empresa.

A partir de minicepas estabelecidas em minijardim clonal, sob sistema semi-hidropônico de canaletão de areia, no Viveiro de Pesquisas Florestais do Departamento de Engenharia Florestal da Universidade Federal de Viçosa, coletaram-se brotações, contendo um par de gemas, para a introdução in vitro dos referidos clones. O estabelecimento in vitro foi realizado conforme protocolo descrito por Borges et al. (2011).

Multiplicação in vitro

Nesta fase, as brotações formadas na fase de estabelecimento in vitro foram inoculadas em tubos de ensaio de 15 x 2.5 cm, contendo 10 mL de meio de cultura MS, suplementado com 0,5 mg L^-1 de BAP, 0,01 mg L^-1 de ANA, 800 mg L^-1 de PVP-30, 30 g L^-1 de sacarose e 6 g L^-1 de ágar.

Realizou-se a transferência das brotações multiplicadas para um novo meio de cultura de igual composição e sob as mesmas condições de cultivo, a cada 30 dias, isolando-se tufos de brotações. Os tufos de brotações foram padronizados como sendo um aglomerado de brotações múltiplas com três a quatro gemas maiores do que 3 mm. A fase de multiplicação in vitro compreendeu a realização de um total de 25 subcultivos sucessivos.

A taxa de multiplicação de cada clone foi determinada ao final de cada subcultivo, dividindo o número de tufos de brotações, obtidas ao final de cada período de 30 dias, pelo número inicial de tufos de brotações do explante proveniente da fase de estabelecimento in vitro. Para tanto os tufos de brotações foram subdivididos ao final de cada subcultivo.

O número de tufos de brotações produzidas por cada clone foi avaliado ao término de cada subcultivo, sendo o experimento conduzido em delineamento inteiramente casualizado, testando-se seis clones híbridos de Eucalyptus globulus com 4 repetições compostas cada uma por 5 tubos de ensaio.

Alongamento in vitro

Os explantes constituídos de tufos de brotações contendo 5 brotações maiores que 3 mm, obtidos na fase de multiplicação, foram inoculados em frascos de 7 x 6 cm contendo 40 mL de meio de cultura, MS ou JADS, ambos suplementados com 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0 mg L^-1 de AIB e 0,05 mg L^-1 de BAP. Adicionou-se ainda aos meios de cultura 800 mg L^-1 de PVP30 e 6 g L^-1 de ágar.

O número de subcultivos realizados na etapa de multiplicação in vitro antes do alongamento variou entre os clones, sendo realizados para os clones C01, C04, C16, C26, C29 e C30 ao todo 16, 15, 18, 14, 16 e 14 subcultivos, respectivamente.

O vigor, a hiper-hidricidade, a oxidação, o número e comprimento das brotações (gemas axilares maiores que 1,0 cm) foram avaliados 35 dias após a inoculação, de acordo com uma escala de notas (Tabela 1). A oxidação das brotações foi avaliada indiretamente por meio da avaliação do escurecimento do meio de cultura.

O delineamento estatístico utilizado para o experimento de alongamento in vitro foi o inteiramente casualizado (DIC) em esquema fatorial (6x5x2), testando-se 6 clones, 5 concentrações de AIB e 2 meios de cultura. Utilizou-se6 explantes por frasco de cultivo, tendo cada tratamento 6 repetições.

Análise dos dados

Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) (p<0,05), sendo as médias comparadas pelo teste de Tukey (p<0,05) e por regressão polinomial. Utilizaram-se o programa STATISTICA 7.0 (STASOFT^(r)) para os procedimentos estatísticos e para o ajuste das equações de regressão o programa CURVE EXPERT 1.3.

Condições de cultura

Os meios de cultura, foram preparados utilizando água desionizada e o pH ajustado para 5,8 ± 0,05 com NaOH (0,1 M) e HCl (0,1 M), antes da autoclavagem e adição do ágar. A autoclavagem do meio de cultura foi realizada à temperatura de 121º C e pressão de aproximadamente 1 kgf cm^-2, durante 15 minutos.

Os reguladores de crescimento BAP, ANA e AIB foram adicionados ao meio de cultura antes da autoclavagem. Em todos os experimentos realizados, os explantes foram cultivados em sala de cultura com temperatura de 25 ± 2 ºC, fotoperíodo de 16 horas e irradiância de 40μmol m^-2s^-1, fornecidas por lâmpadas fluorescentes de luz branca-fria.

Multiplicação in vitro

Os resultados demonstraram variação na taxa de multiplicação ao longo dos subcultivos para todos os clones (Figura 1), dificultando distinguir um ponto específico da estabilização desta taxa, na qual não se observa o incremento no número de brotações produzidas. Bennett et al. (1994) afirmam que a duração desse período de estabilização é variável de acordo com a espécie e idade do material de origem.

FIGURA 1: Taxa de multiplicação dos clones de Eucalyptus urophylla x Eucalyptus globulus (C01, C04 e C16) e Eucalyptus grandis x Eucalyptus globulus (C26, C29 e C30), na fase de multiplicação in vitro no meio de cultura MS com 0,5 mg L^-1 de BAP e 0,01 mg L^-1 de ANA, em 25 subcultivos.  

FIGURE 1 Multiplication rate of Eucalyptus urophylla x Eucalyptus globulus (C01, C04 and C16) and Eucalyptus grandis x Eucalyptus globulus (C26, C29 and C30) clones, during the in vitro multiplication stage in MS culture medium supplemented with 0,5 mg L^-1 BAP and 0,01 mg L^-1 NAA, during 25 subcultures. 

As variações das respostas nos diferentes subcultivos podem ser resultantes, em parte, das condições de cultivo. De acordo com ^{Mankessi et al. (2009)}, a exposição excessiva, através de regimes de subcultivos de longo prazo, com inadequadas concentrações dos componentes do meio, pode resultar em elevação das concentrações ideais de determinadas substâncias dentro dos tecidos vegetais, refletindo no desempenho da cultura como na obtenção de baixas taxas de multiplicação. Essa situação é especialmente aplicável ao regulador de crescimento BAP, uma citocinina sintética mais estável e menos suscetível à degradação por oxidases, do que seus homólogos naturais (^{GEORGE, 2008}).

O incremento do enraizamento das brotações micropropagadas, normalmente é obtido conforme se prolongam os subcultivos, devido ao rejuvenescimento ocorrido nos explantes (TRINDADE; PAIS, 1997). O efeito rejuvenescedor dos sucessivos subcultivos, em meio enriquecido com BAP, já foi relatado para diferentes espécies arbóreas micropropagadas (^{HACKETT, 1987}; ^{PIERIK, 1990}; ^{VON ADERKAS; BONGA, 2000}), dentre essas Eucalyptus (^{WARRAG; LESNEY; ROCKWOOD, 1990}; TRINDADE; PAIS, 1997; SHARMA; RAMAMURTHY, 2000; MANKESSI et al., 2009). Contudo o período de tempo necessário para o rejuvenescimento de cada clone tem sido variável. No presente estudo, há indicativo de reversão à juvenilidade dos clones híbridos de Eucalyptus globulus em razão dos valores positivos da taxa de multiplicação in vitro, apesar da sua variação no decorrer dos subcultivos. De acordo com ^{Chalupa (2002)}, a juvenilidade dos explantes é um fator determinante para a obtenção de elevadas taxas de multiplicação.

Os clones apresentaram diferença significativa quanto à produção média de tufos de brotações ao longo dos subcultivos, sendo obtido o maior número de tufos de brotações para os clones C26 e C29, os quais não diferiram dos clones C01, C04 e C16 (Figura 2). Esse resultado reflete a variação de resposta de diferentes genótipos à multiplicação in vitro. Sotelo e Monza (2007) definiram um protocolo de micropropagação de clones adultos de Eucalyptus globulus sub. maidenii, por meio de gemas epicórmicas, observando que apenas 5 clones de um total de 58 avaliados apresentaram resposta à multiplicação in vitro, evidenciando que o genótipo tem efeito direito nesta variação.

FIGURA 2:  Número médio de tufos de brotações (NBF) produzidos por explante em 25 subcultivos pelos clones de Eucalyptus urophylla x Eucalyptus globulus(C01, C04 e C16) e Eucalyptus grandis x Eucalyptus globulus(C26, C29 e C30), na fase de multiplicação in vitro em meio de cultura MS contendo 0,5 mg L^-1 de BAP e 0,01 mg L^-1 de ANA.  

FIGURE 2 Mean number of shoot clusters per explant of25 subcultures of Eucalyptus urophylla x Eucalyptus globulus (C01, C04 and C16) and Eucalyptus grandis x Eucalyptus globulus (C26, C29 and C30) clones, during the multiplication stage in MS culture medium supplemented with 0,5 mg L^-1BAP and 0,01 mg L^-1NAA. 

O número médio de tufos de brotações (2,4 a 3,6) produzidos pelos clones híbridos de Eucalyptus globulus foi superior ao valor de 2,25 obtido por Gomes e Canhoto (2003) na proliferação de gemas de Eucalyptus nitens. Não obstante, outros trabalhos utilizando o meio MS suplementado com ANA e BAP apresentaram resultados superiores para a multiplicação in vitro de Eucalyptus tereticornis x Eucalyptus grandis (^{JOSHI et al., 2003}), Eucalyptus tereticornis (SHARMA; RAMAMURTHY, 2000). No entanto, o número de subcultivos realizados foi muito menor ao realizado no presente estudo (25 subcultivos), não permitindo averiguar se o protocolo de multiplicação seria adequado para o subcultivo prolongado das brotações de Eucalyptus conforme apresentado no presente trabalho.

Em relação aos reguladores de crescimento, nesse estudo a combinação de BAP e ANA adotada permitiu estimular a multiplicação in vitro dos clones avaliados, com o desenvolvimento de brotações com um bom vigor vegetativo. BAP é à citocinina mais utilizada na micropropagação de Eucalyptus spp. (DEL PONTE et al., 2001; ^{ALVES; XAVIER; OTONI, 2004}). Para Eucalyptus globulus e seus híbridos, o uso do BAP associado ao ANA foi a melhor combinação para promover a multiplicação das brotações ao longo dos subcultivos realizados (CALDERÓN-BALTIERRA, 1994; GÓMEZ; RÍOS; SÁNCHEZ-OLATE, 2007; BORGES et al., 2011). Entretanto, Sotelo e Monza (2007) obtiveram melhores resultados de multiplicação após 5 subcultivos em meio de cultura suplementado com 0,2 mg L^-1 de BAP e 0,02 mg L^-1 de AIB. Diferentemente, Bennett et al. (1994) conseguiram maior número de brotações de materiais adultos de Eucalyptus globulus ao realizar a alternância do uso de BAP e cinetina nos subcultivos.

De modo geral, as respostas dos clones à multiplicação in vitro mostraram-se satisfatórias, apesar de haver diferenças entre os materiais genéticos. Os resultados obtidos para os clones, possivelmente devem-se a estes materiais serem adultos, uma vez que o grau de maturação dos explante sutilizados tem efeito direto nos resultados obtidos na micropropagação, (SOTELO; MONZA, 2007). Dessa forma, os incrementos na taxas de multiplicação ao longo dos subcultivos indicaram que a multiplicação in vitro mostrou-se eficiente para provocar o seu rejuvenescimento, uma vez que a juvenilidade é um fator determinante para a obtenção de elevadas taxas de multiplicação (CHALUPA, 2002).

Alongamento in vitro

De acordo com o teste F (p<0,05) houve interação dos clones em relação ao meio de cultivo e aos tratamentos com AIB para todas as características avaliadas (Tabela 2). Esse resultado indica a diversidade de resposta dos clones em relação ao meio de cultivo e aos tratamentos com AIB, o que reforça o efeito do material genético na propagação vegetativa.

Os clones apresentaram comportamento polinomial de segundo grau para o vigor vegetativo das brotações nos meios MS e JADS (Figura 3). No entanto, no meio MS os valores máximos estimados para o vigor das brotações foram observados nas concentrações de 0,42 a 0,78mg L^-1 de AIB, enquanto no meio JADS, os valores máximos estimados foram observados nas concentrações de AIB superiores a 0,58 mg L^-1. Dessa forma, não há uma única concentração ótima de AIB para obter brotações com o máximo de vigor vegetativo para todos os clones nos dois meios de cultura. Salienta-se que, na ausência de AIB, as brotações apresentaram crescimento reduzido, constatando-se muitas vezes a morte de explantes com o decorrer do tempo de subcultivo.

FIGURA 3: Vigor das brotações de Eucalyptus urophylla x Eucalyptus globulus (C01, C04 e C16) e Eucalyptus grandis x Eucalyptus globulus (C26, C29 e C30), aos 35 dias após a inoculação, em função das doses de AIB aplicados aos meios de cultura MS (A) e JADS (B) contendo 0,05 mg L^-1 de BAP.  

FIGURE 3 Vigor of shoots of Eucalyptus urophylla x Eucalyptus globulus (C01, C04 and C16) and Eucalyptus grandis x Eucalyptus globulus (C26, C29 and C30) clones, 35 days after inoculation, in function of IBA concentrations applied in MS (A) and JADS (B) culture media supplemented with 0.05 mg L^-1BAP. 

De modo geral, as brotações dos clones cultivados no meio JADS apresentaram vigor vegetativo de médio a bom, considerando os valores máximos estimados para essa variável, exceto apenas o clone C16, cuja estimativa do vigor das brotações foi de 2,3, considerado regular (Figura 3B). Por outro lado, no meio MS, os valores máximos estimados do vigor das brotações ficaram na classificação de regular a médio (Figura 3A).

Em relação à oxidação das brotações, observou-se o seu acréscimo nas maiores concentrações de AIB testadas no meio JADS, obtendo-se valores máximos estimados acima de 0,69 mg L^-1, sendo estas estimativas da oxidação classificadas dentro de uma faixa de alta a total (Figura 4B). Este resultado confirma que as altas concentrações de reguladores de crescimento no meio de cultura são um dos fatores responsáveis pela oxidação das brotações (^{RIBEIRO et al., 2012}).

FIGURA 4: Oxidação das brotações de Eucalyptus urophylla x Eucalyptus globulus (C01, C04 e C16) e Eucalyptus grandis x Eucalyptus globulus (C26, C29 e C30), aos 35 dias após a inoculação, em função das doses de AIB aplicados aos meios de cultura MS (A) e JADS (B).  

FIGURE 4 Oxidation of shoots of Eucalyptus urophylla x Eucalyptus globulus (C01, C04 and C16) and Eucalyptus grandis x Eucalyptus globulus (C26, C29 and C30), 35 days after inoculation in function of IBA concentrations applied in MS (A) and JADS (B) culture media. 

De maneira geral, a hiper-hidricidade das brotações foi média a baixa para os clones em ambos meios de cultura, com exceção apenas do clone C29 no meio de cultura MS no qual a hiperidricidade foi acima da média (Figura 5A). A hiperidricidade em brotações micropropagadas pode ser ocasionada por uma série de fatores, dentre os quais o elevado conteúdo de citocininas e alteração da composição iônica do meio de cultura (^{KEVERS et al., 2004}). Contudo, os tratamentos com diferentes concentrações de AIB não tiveram efeito proeminente sobre a hiperidricidade das brotações dos clones estudados.

FIGURA 5: Hiper-hidricidade das brotações de Eucalyptus urophylla x Eucalyptus globulus (C01, C04 e C16) e Eucalyptus grandis x Eucalyptus globulus (C26, C29 e C30), aos 35 dias após a inoculação, em função das doses de AIB aplicados aos meios de cultura MS (A) e JADS (B).  

FIGURE 5 Shoot hyperhydricity of Eucalyptus urophylla x Eucalyptus globulus (C01, C04 and C16) and Eucalyptus grandis x Eucalyptus globulus (C26, C29 and C30) clones, 35 days after inoculation in function of IBA concentrations applied in MS (A) and JADS (B) culture media. 

O clone C29 apresentou maiores valores médios de hiperidricidade em ambos meios de cultura em comparação aos demais clones (Tabela 3). As brotações hiperídricas caracterizaram-se pela hipertrofia dos tecidos foliares, espessamento da lâmina foliar, folhas encarquilhadas com aspecto translúcido, além do engrossamento excessivo dos caules das brotações. Esses sintomas denotam as sérias limitações que a hiperidricidade pode acarretar à sobrevivência ex vitro das brotações alongadas. Além disso, esse resultado reflete e reforça a especificidade de comportamento dos materiais genéticos quanto à micropropagação nos diferentes meios de cultura, e a necessidade de adequação das condições de cultivo in vitro para contornar esse problema.

Os clones não apresentaram respostas semelhantes quanto ao número e comprimento das brotações alongadas para as diferentes concentrações de AIB (Figuras 6 e 7). Os clones C04, C16, C26 e C30, no meio de cultura MS, apresentaram os valores máximos estimados para o número médio de brotações alongadas entre 0,47 e 0,61 mg L^-1 de AIB, correspondendo a uma estimativa de 3,4, 1,6, 2,5 e 3,3 brotos alongados por explante, respectivamente (Figura 6A). Esses resultados foram semelhantes ao observado por Brondani et al. (2009) no alongamento de Eucalyptus benthamii x Eucalyptus dunnii em meio de cultura 1/2MS.

FIGURA 6: Número médio (A) e comprimento médio (B) das brotações alongadas por explante dos clones de Eucalyptus urophylla x Eucalyptus globulus (C01, C04 e C16) e Eucalyptus grandis x Eucalyptus globulus (C26, C29 e C30), aos 35 dias após a inoculação, em função das doses de AIB aplicados ao meio de cultura MS.  

FIGURE 6 Mean number (A) and mean length (B) of elongated shoots per explant of Eucalyptus urophylla x Eucalyptus globulus (C01, C04 and C16) and Eucalyptus grandis x Eucalyptus globulus (C26, C29 and C30) clones, 35 days after inoculation in function of IBA concentrations applied in MS culture medium. 

FIGURA 7: Número médio (A) e comprimento médio (B) de brotações alongadas por explante dos clones de Eucalyptus urophylla x Eucalyptus globulus (C01, C04 e C16) e Eucalyptus grandis x Eucalyptus globulus (C26, C29 e C30), em meio JADS, aos 35 dias após a inoculação, em função das doses de AIB aplicadas ao meio de cultura JADS.  

FIGURE 7 Mean number (A) and mean shoot length (B) of elongated shoots per explant of Eucalyptus urophylla x Eucalyptus globulus (C01, C04 and C16) and Eucalyptus grandis x Eucalyptus globulus (C26, C29 and C30) clones, 35 days after inoculation in function of IBA treatments applied in JADS culture medium. 

Por outro lado, os clones C01 e C29 apresentaram comportamentos diferentes aos dos demais clones no meio MS, sendo estimado maior número de brotações alongadas para o clone C01 em baixas concentrações de AIB, enquanto foi constatado o inverso para o clone C29 (Figura 6A).

Em relação ao comprimento das brotações alongadas em meio MS, os clones C01 e C29 apresentaram resultados divergentes aos observados para os demais clones. Enquanto para o clone C01 foi estimada a concentração de 0,25 mg L^-1 de AIB como sendo a mais adequada para um bom alongamento, para o clone C29 esse valor foi de 1 mg L^-1 (Figura 6B). Para os demais clones, as concentrações estimadas de AIB entre 0,48 e 0,74 mg L^-1 promoveram maior alongamento das gemas. As estimativas de comprimento das gemas alongadas foram de 1,7 cm para os clones C04 e C16 e de 2 cm para os clones C26, C29 e C30. Em meio MS, as concentrações de AIB, em torno de 1 mg L^-1, promoveram a indução de calos na base dos explantes, que em seguida ocasionaram oxidação das brotações, comprometendo o efetivo alongamento desses explantes.

Os clones apresentaram comportamento diferenciado em relação aos tratamentos com AIB para o número e comprimento das brotações alongadas no meio de cultura JADS (Figura 7). De modo geral, ocorreu maior indução no alongamento das brotações dos clones C01, C29 e C30 quando foram subcultivadas em meio JADS comparativamente ao meio MS (Figuras 6A e 7A).

Os clones C29 e C30 apresentaram valores máximos estimados de 6,9 e 5,2 brotações alongadas por explante, no meio de cultura JADS, sendo esses valores bem superiores aos obtidos em meio MS. O meio JADS também foi utilizado no alongamento in vitro de Eucalyptus urophylla (SANTOS et al., 2004) e Grevillea robusta (SANTOS; WENDLING; GROSSI, 2004). Provavelmente, essa diferença deve-se à composição do meio de cultura JADS ser mais adequada ao alongamento dos clones híbridos de Eucalyptus grandis, explicando os resultados superiores para os clones C29 e C30. Além disso, o meio JADS possui uma composição nutricional definida para Eucalyptus grandis (CORREIA et al., 1995), o que pressupõe que tenha um balanço mineral mais próximo do adequado para a micropropagação de outras espécies do gênero.

A presença de AIB no meio de cultura suplementado com BAP favoreceu o alongamento das brotações dos clones do presente trabalho. De maneira semelhante, Santos et al. (2004) verificaram melhores resultados para alongamento in vitro de Eucalyptus urophylla utilizando 0,1 mg L^-1 de AIB e 0,1 mg L^-1 de BAP, após 30 dias de cultivo em meio de cultura JADS. Sotelo e Monza (2007) determinaram que o tratamento com 0,1 mg L^-1 de BAP e 0,5 mg L^-1 de AIB era a melhor combinação para promover o alongamento das brotações de Eucalyptus globulus sub. maidenii.Além disso, outras metodologias, como o uso de carvão ativado no meio de multiplicação, ou a permanência das culturas no escuro por alguns dias, podem contribuir para alongar brotações de Eucalyptus (CALDERÓN-BALTIERRA, 1994; SHARMA; RAMAMURTHY, 2000; GLOCKE et al., 2006).

Considerando o número de gemas alongadas dos clones em ambos os meios de cultura, os resultados demonstraram a eficiência do AIB no alongamento in vitro de clones de Eucalyptus urophylla x Eucalyptus globulus e de Eucalyptus grandis x Eucalyptus globulus provenientes de materiais adultos. Novos estudos buscando definir ajustes melhores e mais específicos são imprescindíveis para maximizar os resultados de micropropagação de híbridos de Eucalyptus globulus.