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Isolamento, caracterização de rizobactérias e análise da produção de ácido indolacético visando ao enraizamento de estacas de oliveira (Olea europaea L.)

Isolation, characterization of rhizobacteria and analysis of indole acetic acid production aiming at the rooting of olive (Olea europaea L.) cuttings

Resumo

As rizobactérias promotoras do crescimento de plantas (RPCP) são capazes de proporcionar o melhor desenvolvimento vegetal por meio de diversos mecanismos. Um desses mecanismos trata da produção de reguladores de crescimento vegetal, como por exemplo, o ácido indolacético (AIA). Com isso, o objetivo do presente trabalho foi o isolamento, a caracterização fenotípica e a avaliação do potencial de produção de AIA de rizobactérias, obtidas da rizosfera de oliveiras (Olea europaea L.), visando a sua aplicação na indução do enraizamento durante a produção de mudas. Para isso, amostras de rizosfera de 17 diferentes cultivares de oliveira, do banco de germoplasma da Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais (EPAMIG), em Maria da Fé - MG, foram utilizadas para o isolamento de RPCP em meios de cultura JNFb, NFb e LGI, posteriormente caracterizadas fenotipicamente em meio batata-dextrose-ágar e submetidas ao teste de produção de AIA. Pôde-se observar efeito das cultivares no número de RPCP nos diferentes meios de cultura. Na caracterização fenotípica, os isolados de RPCP apresentaram alta similaridade entre si (93% a 100%). Quanto à produção de AIA, esses isolados apresentaram índices relevantes (0,16 e 29,08 μg mL-1) quando comparados a outros estudos, sendo aqueles obtidos no meio JNFb os maiores produtores. Pôde-se concluir que 11 isolados (KRJ2, GLJ2, G57J2, MFJ1, ADJ2, G57N1, AUSAL3, FTJ1, AUSAN1, AUSAJ2, KRN1), com produção acima de 20 μg mL-1 de AIA, apresentam potencial de utilização em futuros testes na indução de enraizamento de estacas de plantas de oliveira.

Palavras-chave:
Inoculante; Fitormônios; Mudas

Abstract

Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) are capable of enhancing plant development through various mechanisms. One of them is the production of plant-growth regulators, e.g., indole acetic acid (IAA). On this basis, this study proposes to isolate, phenotypically characterize and evaluate the IAA production potential of rhizobacteria obtained from the rhizosphere of olive trees (Olea europaea L.), aiming at its application in the induction of rooting during seedling production. Samples of the rhizosphere of 17 olive cultivars from the germplasm bank of the Agricultural Research Corporation of Minas Gerais (EPAMIG), in Maria da Fé - MG, Brazil, were used for isolation of PGPR in JNFb, NFb and LGI culture media. Subsequently, they were characterized phenotypically in potato dextrose agar and subjected to an IAA production trial. There was an effect of cultivars on the number of PGPR in the different culture media. In phenotypic characterization, the PGPR isolates showed high similarity to each other (93% to 100%). These isolates showed relevant IAA production rates (0.16 and 29.08 μg mL-1) when compared with reports of other studies, and the isolates obtained in JNFb medium had the highest IAA production. In conclusion, 11 isolates (KRJ2, GLJ2, G57J2, MFJ1, ADJ2, G57N1, AUSAL3, FTJ1, AUSAN1, AUSAJ2 and KRN1), with IAA production rates above 20 μg mL-1, have potential for use in future rooting induction trials in olive cuttings.

Keywords:
Inoculant; Plant hormones; Seedlings

1. INTRODUÇÃO

A oliveira (Olea europaea L.) é uma planta característica da região Mediterrânea, com cultivo disperso para diversos países, passando a ser conhecida pela produção de azeitonas e azeite de oliva (SANTOS et al., 2015aSANTOS, F. F. et al. Relações entre viabilidade, vigor e cultivo in vitro de embriões e sementes de oliveira (Olea europaea L.). Revista Brasileira de Biociências, Porto Alegre, v. 13, n. 3, p. 130-133, 2015a.). No Brasil, a olivicultura é uma atividade em expansão, cujo cultivo em escala comercial teve início há menos de uma década (SILVA et al., 2012cSILVA, L. F. O. et al. Variação na qualidade do azeite em cultivares de oliveira. Bragantia , Campinas, v. 71, n. 2, p. 202-209, 2012c. ). Atualmente, o país é considerado um grande importador de azeite de oliva e está posicionado entre os maiores consumidores no mundo (INTERNATIONAL OLIVE COUNCIL, 2018INTERNATIONAL OLIVE COUNCIL. Brasil: olive oil imports. Market Newsletter, 2018. 6 p.). Em Maria da Fé (MG), o Núcleo Tecnológico da Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais (EPAMIG) - Azeitona e Azeite, vem desenvolvendo pesquisas com a oliveira objetivando reverter a dependência das importações. O Núcleo possui um banco de germoplasma com diversos genótipos diferentes de oliveira, possibilitando que essas plantas sejam estudadas para melhoramento genético e experimentos relacionados a tratos culturais e produção, nas condições edafoclimáticas de Minas Gerais (SILVA et al., 2012aSILVA, L. F. O. et al. Caracterização agronômica e carpométrica de cultivares de oliveira. Pesquisa Agropecuária Tropical, Goiânia, v. 42, n. 3, p. 350-356, 2012a.). Tais bancos se caracterizam como patrimônio genético das espécies, permitindo o estudo de diversas cultivares, de origens diferentes, em mesmas condições de cultivo (SILVA et al., 2012aSILVA, L. F. O. et al. Caracterização agronômica e carpométrica de cultivares de oliveira. Pesquisa Agropecuária Tropical, Goiânia, v. 42, n. 3, p. 350-356, 2012a.).

Na produção de mudas de oliveira, outra forma de assegurar as características genéticas das espécies é pela propagação por estaquia. Dessa forma, permite-se explorar o potencial das plantas por meio da regeneração de raízes através de segmento de ramos, a qual leva à homogeneidade na produção, pela produção de mudas bem formadas, uniformes e frutos com características bem definidas (OLIVEIRA et al., 2010OLIVEIRA, M. C. et al. Enraizamento de estacas de oliveira submetidas à aplicação de fertilizantes orgânicos e AIB. Ciências agrotécnicas, Lavras, v. 34, n. 2, p. 337-344, 2010.). Na estaquia em oliveira, a aplicação de reguladores de crescimento, muitas vezes, é fundamental para formação de raízes, os quais têm, por finalidade, o aumento da porcentagem de estacas que formam raízes, acelerar sua iniciação, aumentar número e a qualidade das raízes formadas e uniformizar o enraizamento (OLIVEIRA et al., 2010OLIVEIRA, M. C. et al. Enraizamento de estacas de oliveira submetidas à aplicação de fertilizantes orgânicos e AIB. Ciências agrotécnicas, Lavras, v. 34, n. 2, p. 337-344, 2010.). Na ausência desses reguladores, o enraizamento natural não ocorre ou ocorre de forma desuniforme, prejudicando a produção comercial de mudas de oliveira. Porém, a utilização de formulações sintéticas de reguladores de crescimento vegetal na indução de enraizamento foi proibida, como o ácido indolbutírico (AIB), em países da Europa e Estados Unidos e na agricultura orgânica. Com isso, estudos utilizando sistemas alternativos para o melhoramento de enraizamento natural têm sido incentivados (ERTURK et al., 2010ERTURK, Y. et al. Effects of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) on rooting and root growth of kiwifruit (Actinidia deliciosa) stem cuttings. Biological Research, Santiago, v. 43, n. 1, p. 91-98, 2010. ).

Nesse sentido, a utilização de microrganismos do solo na produção pode ser uma alternativa para promover o melhoramento do enraizamento natural dessa espécie. Um exemplo desses microrganismos são as rizobactérias promotoras do crescimento de plantas (RPCP), encontradas na rizosfera, em associação com as raízes e em superfícies radiculares, capazes de promover melhor desenvolvimento das plantas, pela suplementação de nutrientes ou pela inibição ou redução de pragas e doenças por meio de antibióticos e antifúngicos (CARDOSO; ANDREOTE, 2016CARDOSO, E. J. B. N.; ANDREOTE, F. D. Microbiologia do solo. 2. ed. Piracicaba: ESALQ, 2016. 221 p.). Além dessas, outras formas de melhorar e promover o desenvolvimento vegetal ocorrem por meio da mobilização de fosfato, inibição da síntese de etileno na planta, produção de sideróforos e outros oligoelementos para absorção pelas plantas (CANELLAS et al., 2015CANELLAS, L. P. et al. Foliar application of plant growth-promoting bacteria and humic acid increase maize yields. Journal of Food Agriculture Environment, Helsinki, v. 13, p. 131-138, 2015.).

As rizobactérias também são capazes de produzir reguladores de crescimento vegetal, os fitormônios, bem como auxinas, giberilinas, citocininas, entre outros (VEJAN et al., 2016VEJAN, P. et al. Role of plant growth promoting rhizobacteria in agricultural sustainability - a review. Molecules, Basel, v. 21, n. 5, p. 573, 2016.). O aumento da produtividade das culturas está diretamente relacionado à produção de hormônios de crescimento vegetal pelas rizobactérias e, um exemplo de hormônio produzido por elas e que permite esse incremento na produtividade, é o ácido indolacético (AIA). O AIA é uma auxina produzida pelas rizobactérias que possui capacidade de induzir o crescimento e formação de raízes e o aumento de pelos radiculares, permitindo, assim, maior absorção de água e de nutrientes presentes no solo, favorecendo o crescimento vegetal (CABALLERO-MELLADO, 2006CABALLERO-MELLADO, J. Microbiología agrícola e interacciones microbianas con plantas. Revista Latino-Americana de Microbiologia, Cidade do México, v. 48, n. 2, p. 154-161, 2006.).

A partir das capacidades de promoção de formação de raízes e de crescimento das plantas por parte das rizobactérias, elas passaram a ser avaliadas em estacas de oliveira (Olea europaea L.). No Brasil, Mariosa et al. (2017MARIOSA, T. N. et al. Rizobactérias e desenvolvimento de mudas a partir de estacas semilenhosas de oliveira (Olea europaea L.). Revista de Ciências Agrárias, Belém, v. 60, n. 4, p. 302-306, 2017.) e Silva et al. (2017SILVA, T. F. et al. Bactérias diazotróficas não simbióticas e enraizamento de estacas semilenhosas de oliveira (Olea europaea L.). Ciência Florestal, Santa Maria, v. 27, n. 1, p. 61-71, 2017. ) conduziram os primeiros trabalhos que estudaram essa capacidade das bactérias, resultados positivos e promissores no enraizamento das estacas de oliveiras, quando comparados com o AIB, comercialmente utilizado. Com isso, o presente estudo objetivou isolar e caracterizar fenotipicamente rizobactérias promotoras do crescimento de plantas presentes na rizosfera de oliveiras do banco de germoplasma do Núcleo Tecnológico de Maria da Fé e analisar a produção de ácido indolacético (AIA) dos isolados, a fim de utilizá-los na indução do enraizamento de estacas semilenhosas de oliveira (Olea europaea L.).

2 MATERIAL E MÉTODOS

Os isolados de rizobactérias utilizados neste trabalho foram obtidos da rizosfera de oliveiras do banco de germoplasma de oliveira instalado no ano de 2005, situado na Fazenda Experimental da EPAMIG, em Maria da Fé, Sul de Minas Gerais a 22°18’ de latitude Sul e 45°23’ de longitude Oeste, altitude média de 1.276 metros e classificação climática de Köppen tipo Cwb, ou seja, clima temperado chuvoso (mesotérmico), também denominado subtropical de altitude. O solo da área de estudo é do tipo Latossolo Vermelho, com textura média argilosa (SILVA et al., 2012bSILVA, L. F. O. et al. Enraizamento de estacas semilenhosas de cultivares de oliveira. Bragantia, Campinas, v. 71, n. 4, p. 488-492, 2012b. ). O banco ocupa uma área de 1,5 ha, apresenta 66 cultivares de oliveira e, em média, seis plantas por cultivar, em espaçamento de 7 x 6 m, sendo considerados uma importante fonte genética e agronômica do país (SILVA et al., 2012bSILVA, L. F. O. et al. Enraizamento de estacas semilenhosas de cultivares de oliveira. Bragantia, Campinas, v. 71, n. 4, p. 488-492, 2012b. ).

2.1 Seleção das Cultivares para Amostragem da Rizosfera

Inicialmente, foi realizada a seleção das cultivares de oliveira das quais a rizosfera seria amostrada e estudada. Entre as 66 cultivares presentes no banco de germoplasma, selecionaram-se 17, considerando aspectos relacionados à diversidade de país de origem, quantidade (cultivares com mais de três plantas disponíveis no banco para servirem como três repetições), vigor das plantas (livres de pragas e doenças) e aptidão comercial para cultivo e produção. As selecionadas foram: Galega (GAL), Negroa (NEG), Grapollo 541(GRA 541), Barnea (BAR), Leccino (LECC), Alto d’ouro (ALT), Frantoio (FRA), Tafahi (TAF), Maria da Fé (MDF), Arbequina (ARBE), Ascolano 315 (ASC 315), Arbosana (ARBO), Ascolano USA (ACS USA), Grapollo (GRA), Grapollo 575 (GRA 575), Mission (MISS) e Koroneiki (KOR).

Após a seleção, amostras da rizosfera foram coletadas em agosto de 2017 para análise. As amostras foram obtidas com auxílio de enxada manual, desinfestada utilizando álcool etílico 70% (v/v), em profundidade de 10 cm, realizados em três pontos ao redor de cada planta, com 20 cm de distância da base, baseando-se no Manual de Descrição e Coleta de Solo no Campo (SANTOS et al., 2015bSANTOS, R. D. et al. Manual de descrição e coleta de solo no campo. 7. ed. rev e ampl. Viçosa, MG: Sociedade Brasileira de Ciência de Solo, 2015b.). Foi utilizado no estudo o delineamento inteiramente casualizado (DIC), sendo três repetições (3 plantas) por cultivar, totalizando 51 unidades experimentais. Cada uma das amostras da rizosfera coletadas foi acondicionada em sacos plásticos, identificada e peneirada em malha de 2 mm e, posteriormente, mantida em câmara fria (4oC) para realização das análises microbiológicas.

2.2 Quantificação e Isolamento das Rizobactérias

Para etapa de isolamento das rizobactérias, diluições sucessivas de 10 g das amostras de rizosfera foram realizadas em solução salina para diluição (DÖBEREINER; BALDANI; BALDANI, 1995DÖBEREINER, J.; BALDANI, V. L. D.; BALDANI, J. I. Como isolar e identificar bactérias diazotróficas de plantas não-leguminosas. Itaguaí: Embrapa; CNPAB, 1995. 60 p. ), de 10-2 a 10-6, e foi inoculado 0,1 mL de cada suspensão em frascos contendo os meios de cultura semissólidos específicos, sendo três repetições por diluição. Os meios de cultura semissólidos utilizados foram: NFb para Azospirillum spp, JNFb para Herbaspirillum spp. e o meio LGI para Azospirillum amazonense, conforme Döbereiner, Baldani e Baldani (1995DÖBEREINER, J.; BALDANI, V. L. D.; BALDANI, J. I. Como isolar e identificar bactérias diazotróficas de plantas não-leguminosas. Itaguaí: Embrapa; CNPAB, 1995. 60 p. ). A escolha da utilização desses meios de cultura nas análises é devida à ausência de meio específico para isolamento de bactérias produtoras de AIA, além do fato dos isolados apresentarem, adicionalmente, a capacidade de fixação biológica de N2 em condições onde há limitação desse nutriente (KUSS et al., 2007KUSS, A. V. et al. Fixação de nitrogênio e produção de ácido indolacético in vitro por bactérias diazotróficas endofíticas. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 42, p. 1459-1465, 2007.; SILVA et al., 2017SILVA, T. F. et al. Bactérias diazotróficas não simbióticas e enraizamento de estacas semilenhosas de oliveira (Olea europaea L.). Ciência Florestal, Santa Maria, v. 27, n. 1, p. 61-71, 2017. ). Para avaliar a densidade bacteriana, utilizou-se o método do número mais provável (NMP) (HUNGRIA; ARAÚJO, 1994HUNGRIA, M.; ARAÚJO, R. S. Manual de métodos empregados em microbiologia agrícola. Brasília: Embrapa, 1994. 542 p.). Os valores de

NMP por g de solo seco foram submetidos ao teste de comparação de médias ScottKnott a 5% de significância pelo programa estatístico Sisvar (FERREIRA, 2008FERREIRA, D. F. Sisvar: um programa para análises e ensino de estatística. Symposium, Lavras, v. 6, p. 36-41, 2008.).

2.3 Caracterização Fenotípica Cultural dos Isolados

A fase de caracterização fenotípica cultural dos isolados de rizobactérias foi baseada em Melloni et al. (2004MELLONI, R. et al. Densidade e diversidade de bactérias diazotróficas endofíticas em solos de mineração de bauxita em reabilitação. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa, MG, v. 28, p. 85-93, 2004. ). Os isolados dos meios sólidos foram transferidos para ágar-batata-dextrose, em triplicata, e realizada a caracterização com relação ao diâmetro, cor e consistência das colônias (Tabela 1), sendo estabelecidos 7 cores, 5 diâmetros e 4 tipos de consistência. Também foram caracterizadas fenotipicamente em ágar-batata-dextrose as estirpes-tipo Azospirillum amazonense (BR11040T), Azospirillum brasilense (BR11001T), Azospirillum lipoferum (BR11080T), Burkholderia brasilensis (BR11340T) e Herbaspirillum seropedicae (BR11175T), para realizar uma comparação com os isolados obtidos das rizosferas. Por meio da utilização do método Complete Linkage e Distância Euclidiana (EVERITT, 1993EVERITT, B. S. Cluster analysis. New York: J. Wiley, 1993.), agruparam-se os isolados e estirpes-tipo caracterizados em dendrogramas de similaridade, pelo programa STATISTICA 10 (STATISTICA, 2010STATISTICA. Statistic analysis. Versão 10.0. Cary, 2010.).

Tabela 1
Características fenotípicas das rizobactérias avaliadas e seus respectivos números utilizados no dendrograma de similaridade

2.4 Quantificação da Produção de AIA

A etapa de quantificação da produção de AIA dos isolados de rizobactérias foi baseada na metodologia de Kuss et al. (2007KUSS, A. V. et al. Fixação de nitrogênio e produção de ácido indolacético in vitro por bactérias diazotróficas endofíticas. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 42, p. 1459-1465, 2007.). Para isso, os isolados foram colocados para crescimento em erlenmeyers contendo 10 mL de meio líquido Dygs (RODRIGUES NETO; MALAVOLTA JÚNIOR; VICTOR, 1986RODRIGUES, NETO J. ; MALAVOLTA, V. A. Jr ; VICTOR, O. Meio simples para isolamento e cultivo de Xanthomonas campestris pv. citri Tipo B. Summa Phytopatológica, São Paulo, v. 12, p. 16, 1986. ) e por 72 horas em temperatura ambiente foram submetidos à agitação. Após esse período, foram centrifugados a 3.000 rpm por 10 min. Foi descartado o sobrenadante e adicionados 5 mL de solução salina 0,85% ao precipitado de células. Para ajuste da densidade ótica (DO) das suspensões, utilizou-se o espectrofotômetro (PerkinElmer, UV/VIS Spectrometer, Lambda 25) a 600 nm e, com base nos valores de absorbância, foram ajustadas, acrescentandose alíquotas de solução salina até obter DO=0,5, utilizando a própria solução salina para leitura como branco.

Após o ajuste da DO, foi inoculado 0,500 mL da suspensão com os isolados em 20 mL de meio líquido Dygs e agitados por mais 72 horas a 30°C. Em seguida, foram centrifugados 15 mL de cada suspensão por 30 min a 3.600 rpm, até que ficasse translúcido. Após a centrifugação, 3 mL do sobrenadante foram adicionados a 2 mL de reagente Salkowski, preparado da seguinte forma: 1 mL de FeCL3.6H2O 0,5M (1,35g 10 mL-1), 50 mL de HClO4 (35%). Os frascos com a suspensão foram armazenados em ambiente escuro por 30 min para desenvolvimento de cor, na qual quanto mais intenso o tom de rosa-avermelhado maior a quantidade de ácido indolacético. A intensidade da cor foi determinada em espectrofotômetro a 535 nm, utilizando meio líquido Dygs autoclavado, com reagente Salkowski como branco para leitura.

Previamente, foi realizada a construção da curva-padrão com a concentração dos compostos indólicos para comparação com a produção dos isolados e estirpestipo segundo metodologia de Galdiano Júnior (2009GALDIANO JÚNIOR, R. F. Isolamento, identificação e inoculação de bactérias produtoras de auxinas associadas às raízes de orquídeas. 2009. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento de Plantas) - Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, 2009.). Isso foi feito a partir de diluições da solução de 1 mg mL-1 de AIA comercial padrão (Sigma-Aldrich®), com a utilização do meio líquido Dygs esterilizado e quantidades conhecidas do hormônio, adicionadas 2 mL de reagente Salkowski para cada 3 mL da diluição. Foram utilizadas cinco diferentes concentrações de AIA comercial (0, 50, 100, 200, 300 μg ml-1) para gerar a equação. Para formação de cor, as diluições foram mantidas por 30 min em ambiente escuro e a intensidade da cor determinada em espectrofotômetro a 535 nm (KUSS et al., 2007KUSS, A. V. et al. Fixação de nitrogênio e produção de ácido indolacético in vitro por bactérias diazotróficas endofíticas. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 42, p. 1459-1465, 2007.). Os valores obtidos de absorbância foram inseridos na equação resultante da curvapadrão para gerar os resultados expressos em μg mL-1 de cada isolado.

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

O NMP das RPCP na rizosfera de cada cultivar de oliveira, obtido pela formação de película nos meios semissólidos JNFb, NFb e LGI, está apresentado na Tabela 2.

No meio JNFb, foram obtidas médias que variaram de log NMP 5,35 a 7,13 g-1 de solo seco, enquanto a variação no meio NFb foi de 4,53 a 6,88 e, no meio LGI, de 5,21 a 6,61. Sendo assim, foram observados maiores valores do número de RPCP no meio JNFb em cultivares de oliveira como Leccino, Frantoio, Alto D’oro, entre outras. É possível notar, também, variação no número de rizobactérias por grama de solo seco nas diferentes cultivares e em uma mesma cultivar, de acordo com o meio de cultura. Na rizosfera da cultivar Leccino, por exemplo, obtiveram-se, no meio JNFb, 7,01 g-1 de solo seco, 5,25 g-1 de solo seco no meio NFb e 6,47 g-1 de solo seco no meio LGI. As cultivares de oliveira promoveram os maiores NMP na soma dos valores obtidos em todos os meios de cultura como, por exemplo, Tafahi, Koroneiki, Ascolano USA e Frantoio (Tabela 2), em relação às demais. Pode-se explicar essa diferença significativa observada entre as cultivares a presença de exsudatos radiculares que são capazes de atrair microrganismos para região rizosférica (VALÉ et al., 2005VALÉ, M. et al. Microbial activity in the rhizosphere soil of six herbaceous species cultivated in a greenhouse is correlated with shoot biomass and root C concentrations. Soil Biology and Biochemistry, Amsterdam, v. 37, p. 2329-2333, 2005.).

Tabela 2
Rizobactérias isoladas de amostras de solo rizosférico de cultivares de oliveira utilizando meio de cultura JNFb, NFb e LGI

De forma geral, na análise dos dados foi observado efeito das cultivares no número de isolados para os meios de cultura JNFb e NFb (Tabela 2). Isso pode ser explicado, principalmente, pela maior especificidade que o meio de cultura LGI apresenta e por ser indicado apenas para isolamento e quantificação de rizobactérias da espécie A. amazonense, diferente dos demais meios que são capazes de quantificar outras espécies ao mesmo tempo.

Baldani et al. (1999BALDANI, J. I. et al. Fixação biológica de nitrogênio em gramíneas: avanços e aplicações. In: SIQUEIRA, J.O. et al. (ed.). Inter-relação fertilidade, biologia do solo e nutrição de plantas. Viçosa, MG: SBCS; UFLA; DCS, 1999. p. 621-666.) destacaram a menor especificidade que o meio JNFb apresenta, já que esse meio permite o crescimento de outras rizobactérias do gênero Azospirillum. Da mesma forma, Magalhães e Döbereiner (1984MAGALHÃES, F. M. M.; DÖBEREINER, J. Ocorrência de Azospirillum amazonense em alguns ecossistemas da Amazônia. Revista de Microbiologia, São Paulo, v. 15, p. 246-252, 1984.) mostraram que mesmo o meio NFb favoreça o desenvolvimento das espécies de Azospirillum outros microrganismos diazotróficos também podem crescer nestes meios, o que pode ser a justificativa para o ocorrido no presente estudo, ou seja, uma maior probabilidade de isolamento de outras bactérias.

Após a análise do NMP das RPCP nas diferentes rizosferas das oliveiras, foram obtidos, na etapa de isolamento, 70 isolados de rizobactérias, os quais foram caracterizados com base nos aspectos descritos na Tabela 1. De forma geral, foi registrada alta homogeneidade fenotípica, independentemente do meio de cultura utilizado, apresentando similaridade de 93 a 100% (Figura 1). Porém, mesmo com a alta homogeneidade apresentada, os fenótipos utilizados para caracterização foram suficientes para diferenciar os isolados obtidos nos respectivos meios de cultura, importante nos ensaios posteriores de quantificação de AIA por grupo. As características fenotípicas mais observadas nos isolados obtidos nos diferentes meios foram consistência pegajosa, coloração branca e diâmetros entre 1 e 3 mm.

Ao avaliar a densidade e diversidade fenotípica de bactérias diazotróficas endofíticas em solos de mineração de bauxita, em reabilitação, Melloni et al. (2004MELLONI, R. et al. Densidade e diversidade de bactérias diazotróficas endofíticas em solos de mineração de bauxita em reabilitação. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa, MG, v. 28, p. 85-93, 2004. ) registraram maior número de isolados no meio JNFb, porém, foi indicada que estes não mostravam maior similaridade à Herbaspirillum. No caso em questão, as maiores médias do número de bactérias foram encontradas no meio de cultura JNFb e, na análise de similaridade, mesmo com a alta homogeneidade, nem todos foram semelhantes à estirpe-tipo Herbaspirillum seropedicae.

Figura 1
Dendrograma de similaridade construído com base nas características fenotípicas culturais de cor, consistência e diâmetro de colônias

Em que: Os isolados foram comparados com estirpes-tipo de Azospirillum amazonense (BR11040T), Burkholderia brasilense (BR11340T), Herbaspirillum seropedicae (BR11075T), Azospirillum lipoferum (BR11080T). Galega (GAL), Negroa (NEG), Grapollo 541(GRA 541), Barnea (BAR), Leccino (LECC), Alto d’ouro (ALT), Frantoio (FRA), Tafahi (TAF), Maria da Fé (MDF), Arbequina (ARBE), Ascolano 315 (ASC 315), Arbosana (ARBO), Ascolano USA (ACS USA), Grapollo (GRA), Grapollo 575 (GRA 575), Mission (MISS), Koroneiki (KOR).

Após a caracterização, na avaliação da produção de AIA por parte dos isolados, as concentrações produzidas variaram de 0,16 a 29,08 μg mL-1. Alguns isolados obtidos no meio JNFb (Figura 2) quando comparados com os obtidos nos demais meios NFb e LGI (Figuras 3 e 4, respectivamente) apresentaram maior concentração de AIA. Pode-se considerar relevantes as concentrações obtidas por parte de alguns isolados, já que, no presente estudo, não foi utilizada a adição de triptofano. O triptofano é considerado o precursor de AIA, pois sua adição em meios de cultura promove aumento da síntese. Entretanto, existem vias independentes de triptofano para a produção de AIA (KUSS et al., 2007KUSS, A. V. et al. Fixação de nitrogênio e produção de ácido indolacético in vitro por bactérias diazotróficas endofíticas. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 42, p. 1459-1465, 2007.).

Figura 2
Concentração de AIA produzido, em μg mL-1, pelas estirpes-tipo e isolados obtidos pelo meio de cultura JNFb

A maioria dos trabalhos relacionados à produção de AIA envolve a adição de triptofano ao meio de cultura, contudo, como citado anteriormente, existem vias independentes de produção. Especificamente, em estudos como de Mariosa et al. (2017MARIOSA, T. N. et al. Rizobactérias e desenvolvimento de mudas a partir de estacas semilenhosas de oliveira (Olea europaea L.). Revista de Ciências Agrárias, Belém, v. 60, n. 4, p. 302-306, 2017.) e Silva et al. (2017SILVA, T. F. et al. Bactérias diazotróficas não simbióticas e enraizamento de estacas semilenhosas de oliveira (Olea europaea L.). Ciência Florestal, Santa Maria, v. 27, n. 1, p. 61-71, 2017. ), nos quais este trabalho foi baseado, não houve sua adição ao meio de cultura e os isolados de rizobactérias continuaram produzindo AIA. Por essa razão, optou-se pela não utilização.

Figura 3
Concentração de AIA produzido, em μg mL-1, pelas estirpes-tipo e isolados obtidos pelo meio de cultura NFb

Figura 4
Concentração de AIA produzido, em μg mL-1, pelas estirpes-tipo e isolados obtidos pelo meio de cultura LGI

O estudo realizado por de Kuss et al. (2007KUSS, A. V. et al. Fixação de nitrogênio e produção de ácido indolacético in vitro por bactérias diazotróficas endofíticas. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 42, p. 1459-1465, 2007.) é outro exemplo em que não houve adição de triptofano. Com o objetivo de isolar e quantificar bactérias diazotróficas associadas a raízes de diferentes variedades de arroz irrigado, e avaliar a produção de AIA e o potencial de FBN destas bactérias, os autores registraram uma produção entre 2,79 e 13,47 µg mL-1. Em Chaves et al. (2015CHAVES, V. A. et al. Desenvolvimento inicial de duas variedades de cana-de-açúcar inoculadas com bactérias diazotróficas. Revista Brasileira Ciência do Solo, Viçosa, MG, v. 39, p. 1595-1602, 2015.), o mesmo foi avaliado na ausência de triptofano, obtendo-se uma média de produção pelas cinco estirpes estudadas de 6,35 µg mL-1. Ao comparar os resultados obtidos pelos autores citados, é possível verificar que são inferiores aos do presente estudo, sendo assim um indicativo de que, mesmo optando pela não utilização do triptofano, houve uma produção de AIA pelos isolados considerada alta.

Outro exemplo e que permite considerar a boa produção por parte dos isolados obtidos no presente estudo, é a comparação com estudos nos quais houve adição de triptofano e, ainda assim, apresentaram produção semelhante. Como no estudo de Montero-Calasanz et al. (2013)MONTERO-CALASANZ, M. C. et al. Alternative rooting induction of semi-hardwood olive cuttings by several auxin-producing bacteria for organic agriculture systems. Spanish Journal of Agricultural Research, Madrid, v. 11, n. 1, p. 146-154, 2013., com objetivo de avaliar a eficiência de enraizamento em estacas de oliveira de Arbequina, Hojiblanca e Picual pela inoculação de diferentes bactérias selecionadas através de suas características fisiológicas como promotoras de crescimento. Nesse caso, foram registradas produções de AIA entre 7,6 a 20 μg mL-1 pela rizobactéria A. brasilense Cd ATCC 29729.

Florentino et al. (2017FLORENTINO, L. A. et al. Inoculação de bactérias produtoras de ácido 3-indol acético em plantas de alface (Lactuca sativa L.). Revista colombiana de Ciências Hortícolas, Tunja, v. 11, n. 1, p. 89-96, 2017.), ao avaliarem a produção in vitro de AIA por bactérias diazotróficas cultivadas na presença ou ausência do triptofano e o efeito da sua inoculação em sementes de alface (Lactuca sativa L.), observaram que a UNIFENAS 100-153 foi a maior produtora de AIA, independentemente da presença de triptofano, indicando maior versatilidade metabólica. A produção por parte dos outros isolados variou de 3,99 a 46,97 μg mL-1 e 2,68 a 37,63 μg mL-1, nos meios contendo ou não triptofano, respectivamente.

Esses valores de AIA, obtidos nos estudos citados e no presente estudo, estão em conformidade com os apresentados por outros autores, os quais observaram alta variação na capacidade de produção deste fitormônio pelas estirpes bacterianas (CHAVES et al., 2015CHAVES, V. A. et al. Desenvolvimento inicial de duas variedades de cana-de-açúcar inoculadas com bactérias diazotróficas. Revista Brasileira Ciência do Solo, Viçosa, MG, v. 39, p. 1595-1602, 2015.). Cassán, Vanderleyden e Spaepen (2014CASSÁN, F.; VANDERLEYDEN, J.; SPAEPEN, S. Physiological and agronomical aspects of phytohormone production by model plantbacteria-promoting rhizobacteria (PGPR) belonging to the genus Azospirillum. Journal Plant Growth Regulation, New York, v. 33, p. 59-440, 2014.) apontam que a produção de AIA é capaz de variar de 5 a 50 µg mL-1, em condições de cultivo, de acordo com meio de cultivo e da estirpe testada.

Sendo assim, com base na produção de AIA pelos isolados, principalmente aos que apresentaram produção acima de 20 µg mL-1, os mesmos podem ser considerados viáveis para utilização em ensaios de indução de enraizamento de estacas semilenhosas de oliveira. Especificamente, os isolados KRJ2, GLJ2, G57J2, MFJ1, ADJ2, G57N1, AUSAL3, FTJ1, AUSAN1, AUSAJ2 e KRN1 apresentam potencial de utilização como inoculantes no enraizamento de estacas de oliveira durante a produção de mudas.

4 CONCLUSÃO

Foi possível concluir que as cultivares de oliveira influenciam, diferentemente, o número de bactérias e as diferenças na caracterização fenotípica observada, apesar da alta similaridade entre si.

Os isolados apresentam produção de AIA satisfatória quando comparada com outros estudos, mesmo na ausência de triptofano, com destaque para aqueles obtidos no meio JNFb, independentemente das cultivares de oliveira. Pela produção superior a 20 μg mL-1 de AIA, 11 deles (KRJ2, GLJ2, G57J2, MFJ1, ADJ2, G57N1, AUSAL3, FTJ1, AUSAN1, AUSAJ2, KRN1) apresentam potencial de utilização na indução de enraizamento de estacas de oliveira.

AGRADECIMENTOS

À Capes e Fapemig, pelo apoio financeiro. À Epamig, pela infraestrutura para realização da pesquisa.

Referências

  • BALDANI, J. I. et al Fixação biológica de nitrogênio em gramíneas: avanços e aplicações. In: SIQUEIRA, J.O. et al (ed.). Inter-relação fertilidade, biologia do solo e nutrição de plantas. Viçosa, MG: SBCS; UFLA; DCS, 1999. p. 621-666.
  • CABALLERO-MELLADO, J. Microbiología agrícola e interacciones microbianas con plantas. Revista Latino-Americana de Microbiologia, Cidade do México, v. 48, n. 2, p. 154-161, 2006.
  • CANELLAS, L. P. et al Foliar application of plant growth-promoting bacteria and humic acid increase maize yields. Journal of Food Agriculture Environment, Helsinki, v. 13, p. 131-138, 2015.
  • CARDOSO, E. J. B. N.; ANDREOTE, F. D. Microbiologia do solo. 2. ed. Piracicaba: ESALQ, 2016. 221 p.
  • CASSÁN, F.; VANDERLEYDEN, J.; SPAEPEN, S. Physiological and agronomical aspects of phytohormone production by model plantbacteria-promoting rhizobacteria (PGPR) belonging to the genus Azospirillum Journal Plant Growth Regulation, New York, v. 33, p. 59-440, 2014.
  • CHAVES, V. A. et al Desenvolvimento inicial de duas variedades de cana-de-açúcar inoculadas com bactérias diazotróficas. Revista Brasileira Ciência do Solo, Viçosa, MG, v. 39, p. 1595-1602, 2015.
  • DÖBEREINER, J.; BALDANI, V. L. D.; BALDANI, J. I. Como isolar e identificar bactérias diazotróficas de plantas não-leguminosas. Itaguaí: Embrapa; CNPAB, 1995. 60 p.
  • ERTURK, Y. et al Effects of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) on rooting and root growth of kiwifruit (Actinidia deliciosa) stem cuttings. Biological Research, Santiago, v. 43, n. 1, p. 91-98, 2010.
  • EVERITT, B. S. Cluster analysis. New York: J. Wiley, 1993.
  • FERREIRA, D. F. Sisvar: um programa para análises e ensino de estatística. Symposium, Lavras, v. 6, p. 36-41, 2008.
  • FLORENTINO, L. A. et al Inoculação de bactérias produtoras de ácido 3-indol acético em plantas de alface (Lactuca sativa L.). Revista colombiana de Ciências Hortícolas, Tunja, v. 11, n. 1, p. 89-96, 2017.
  • GALDIANO JÚNIOR, R. F. Isolamento, identificação e inoculação de bactérias produtoras de auxinas associadas às raízes de orquídeas. 2009. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento de Plantas) - Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, 2009.
  • HUNGRIA, M.; ARAÚJO, R. S. Manual de métodos empregados em microbiologia agrícola. Brasília: Embrapa, 1994. 542 p.
  • INTERNATIONAL OLIVE COUNCIL. Brasil: olive oil imports. Market Newsletter, 2018. 6 p.
  • KUSS, A. V. et al Fixação de nitrogênio e produção de ácido indolacético in vitro por bactérias diazotróficas endofíticas. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 42, p. 1459-1465, 2007.
  • MAGALHÃES, F. M. M.; DÖBEREINER, J. Ocorrência de Azospirillum amazonense em alguns ecossistemas da Amazônia. Revista de Microbiologia, São Paulo, v. 15, p. 246-252, 1984.
  • MARIOSA, T. N. et al Rizobactérias e desenvolvimento de mudas a partir de estacas semilenhosas de oliveira (Olea europaea L.). Revista de Ciências Agrárias, Belém, v. 60, n. 4, p. 302-306, 2017.
  • MELLONI, R. et al Densidade e diversidade de bactérias diazotróficas endofíticas em solos de mineração de bauxita em reabilitação. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa, MG, v. 28, p. 85-93, 2004.
  • MONTERO-CALASANZ, M. C. et al Alternative rooting induction of semi-hardwood olive cuttings by several auxin-producing bacteria for organic agriculture systems. Spanish Journal of Agricultural Research, Madrid, v. 11, n. 1, p. 146-154, 2013.
  • OLIVEIRA, M. C. et al Enraizamento de estacas de oliveira submetidas à aplicação de fertilizantes orgânicos e AIB. Ciências agrotécnicas, Lavras, v. 34, n. 2, p. 337-344, 2010.
  • RODRIGUES, NETO J. ; MALAVOLTA, V. A. Jr ; VICTOR, O. Meio simples para isolamento e cultivo de Xanthomonas campestris pv. citri Tipo B. Summa Phytopatológica, São Paulo, v. 12, p. 16, 1986.
  • SANTOS, F. F. et al Relações entre viabilidade, vigor e cultivo in vitro de embriões e sementes de oliveira (Olea europaea L.). Revista Brasileira de Biociências, Porto Alegre, v. 13, n. 3, p. 130-133, 2015a.
  • SANTOS, R. D. et al Manual de descrição e coleta de solo no campo. 7. ed. rev e ampl. Viçosa, MG: Sociedade Brasileira de Ciência de Solo, 2015b.
  • SILVA, L. F. O. et al Caracterização agronômica e carpométrica de cultivares de oliveira. Pesquisa Agropecuária Tropical, Goiânia, v. 42, n. 3, p. 350-356, 2012a.
  • SILVA, L. F. O. et al Enraizamento de estacas semilenhosas de cultivares de oliveira. Bragantia, Campinas, v. 71, n. 4, p. 488-492, 2012b.
  • SILVA, L. F. O. et al Variação na qualidade do azeite em cultivares de oliveira. Bragantia , Campinas, v. 71, n. 2, p. 202-209, 2012c.
  • SILVA, T. F. et al Bactérias diazotróficas não simbióticas e enraizamento de estacas semilenhosas de oliveira (Olea europaea L.). Ciência Florestal, Santa Maria, v. 27, n. 1, p. 61-71, 2017.
  • STATISTICA. Statistic analysis. Versão 10.0. Cary, 2010.
  • VALÉ, M. et al Microbial activity in the rhizosphere soil of six herbaceous species cultivated in a greenhouse is correlated with shoot biomass and root C concentrations. Soil Biology and Biochemistry, Amsterdam, v. 37, p. 2329-2333, 2005.
  • VEJAN, P. et al Role of plant growth promoting rhizobacteria in agricultural sustainability - a review. Molecules, Basel, v. 21, n. 5, p. 573, 2016.

Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    14 Mar 2022
  • Data do Fascículo
    Oct-Dec 2021

Histórico

  • Recebido
    06 Maio 2019
  • Aceito
    29 Mar 2021
  • Publicado
    17 Nov 2021
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