Caracterização histomorfológica e bioquímica de calos induzidos em Cenostigma pyramidale [Tul.] Gagnon & G.P. Lewis

Histomorphological and biochemical characterization of callus induction in Cenostigma pyramidale [Tul.] Gagnon & G.P. Lewis

RESUMO

Cenostigma pyramidale [Tul.] possui utilização madeireira, forrageira e medicinal e, em virtude da exploração de seus recursos naturais, pode acabar em via de extinção. Este trabalho objetivou induzir calos em Cenostigma pyramidale e identificar o potencial embriogênico por análises histomorfológica e bioquímica. Segmentos foliolares foram inoculados em meio de cultura MS contendo diferentes concentrações (0,0; 2,5; 5,0 e 10,0 μM) de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), combinadas com 6-benzilaminopurina (BAP; 0,0; 2,5 e 5,0 μM) e glutamina (0,0; 0,342 e 0,684 mM). A curva de crescimento foi realizada em intervalos de 7 dias, até o 77º dia, sendo coletadas amostras para análise histomorfológica e determinação do conteúdo de açúcares redutores (AR), sacarose e açúcares solúveis totais (AST). É possível a indução de calos utilizando segmentos foliolares no tratamento com 5,0 μM de BAP, 7,0 µM de 2,4-D e 0,684 mM de glutamina. A curva de crescimento apresenta comportamento sigmoidal com cinco fases distintas: lag, exponencial, linear, desaceleração e declínio. Verificou-se a presença de células com características meristemáticas a partir do 7º dia de indução, sugerindo que os calos possuem potencial embriogênico. Porém, não se observou a diferenciação de embriões somáticos. Verificaram-se redução no conteúdo de AR e aumento de AST e sacarose durante a fase lag e início da fase exponencial, seguido de degradação na fase exponencial até a fase de declínio, mostrando o envolvimento destes carboidratos com o crescimento dos calos. Esses resultados são inéditos para a espécie e sugerem estudos futuros relacionados à maturação dos calos visando a diferenciação de embriões somáticos.

Palavras-chave
Cultivo in vitro; Curva de crescimento; Carboidratos

ABSTRACT

Cenostigma pyramidale [Tul.] has timber, forage and medicinal uses, and due to the exploitation of its natural resources, it may become endangered. This work aimed to induce callus in Cenostigma pyramidale and to identify the embryogenic potential by histomorphological and biochemical analysis. Leaf segments were inoculated in MS culture medium containing different concentrations (0.0; 2.5; 5.0 and 10.0 μM) of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), combined with 6-benzylaminopurine (BAP; 0.0; 2.5 and 5.0 μM) and glutamine (0.0; 0.342 and 0.684 mM). The growth curve was performed at 7-day intervals until day 77, and samples were collected for histomorphological analysis and determination of reducing sugars (RA), sucrose, and total soluble sugars (TSS) content. Callus induction is possible using leaf segments in treatment with 5.0 μM of BAP, 7.0 µM of 2.4-D and 0.684 mM of glutamine. The growth curve shows sigmoidal behavior with five distinct phases: lag, exponential, linear, deceleration and decline. It was verified the presence of cells with meristematic characteristics from the 7th day of induction, suggesting that the calli have embryogenic potential. However, differentiation of somatic embryos was not observed. There was a reduction in RA content and increase in AST and sucrose during the lag phase and beginning of the exponential phase, followed by degradation in the exponential phase until the decline phase, showing the involvement of these carbohydrates with callus growth. These results are unprecedented for the species and suggest future studies related to callus maturation aiming the differentiation of somatic embryos.

Keywords
In vitro cultivation; Growth curve; Carbohydrates

1 INTRODUÇÃO

Cenostigma pyramidale [Tul.] Gagnon & G. P. Lewis (Fabaceae), conhecida popularmente como catingueira, catinga-de-porco ou pau-de-rato, é uma espécie lenhosa, arbórea, endêmica do bioma Caatinga, cuja vegetação inclui uma diversidade de plantas de usos múltiplos. A espécie possui utilização na medicina popular, cujas flores, folhas e cascas são utilizadas no tratamento das infecções catarrais e diarreias; o uso de sua madeira, servindo como fonte de lenha, carvão, estacas, mourões e outros, utilidades que resultam na retirada da árvore, podendo impedir sua reprodução natural, ocasionando problemas com a propagação, o que pode aproximá-la do risco de extinção (MAIA, 2012).

Diante disso, faz-se necessária a elaboração de estratégias para multiplicação, conservação, manejo e exploração de seus recursos de forma sustentável. Nesse sentido, destaca-se a importância do uso de técnicas biotecnológicas, como a cultura de tecidos de plantas, para a propagação vegetativa em larga escala e em qualquer época do ano (COPELAND, 2017). Dentre as vias de propagação in vitro, destaca-se a embriogênese somática, a qual pode ser considerada vantajosa em relação à regeneração por organogênese, devido à possibilidade de elevadas taxas de multiplicação e o desenvolvimento de plantas com maior integridade genética (GRANDO et al., 2013).

Na embriogênese somática, células somáticas se desenvolvem em plantas sem que haja a fusão de gametas (SMERTENKO; BOZHKOV, 2014). Esse processo pode ocorrer por via direta (sem fase de calos) ou indireta, na qual ocorre primeiro a calogênese e, em seguida, o início da formação de embriões somáticos a partir dos calos (ALVES et al., 2018). Esses embriões terão a presença dos meristemas radiculares e apicais simultaneamente, resultando numa planta completa (CAMPOS et al., 2009). Durante a indução da embriogênese somática, estudos da identificação das fases da curva de crescimento dos calos são importantes para identificar o momento adequado da transferência para o novo meio de cultura, ou mesmo a possibilidade da sua utilização em suspensões celulares (NOGUEIRA et al., 2007).

O uso de reguladores de crescimento vegetal é fundamental para que ocorra a desdiferenciação dos tecidos durante a indução de calos e a diferenciação para formação de embriões somáticos (VILELA et al., 2019). A auxina ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) é a mais amplamente utilizada pelo potencial embriogênico para obtenção de embriões somáticos em plantas (SHARMA; BRYAN; MILLAM, 2007). Dentre as citocininas, a 6-benzilaminopurina (BAP) se destaca na promoção da divisão e diferenciação celular, estimulando a proliferação celular formando massas celulares quando em concentrações adequadas (GEORGE et al., 2008). Além dos reguladores citados, a glutamina, uma forma de nitrogênio orgânico prontamente assimilável, pode estar relacionada à indução do processo embriogênico, considerando que os aminoácidos desempenham funções importantes em todas as etapas desse processo (BARTOS et al., 2018).

Durante a indução e o desenvolvimento in vitro da calogênese, estudos associados a alterações histomorfológicas, visando a caracterização e identificação de células com estruturas meristemáticas, são importantes para mostrar se o calo apresenta competência para a diferenciação de embriões somáticos (MACIEL et al., 2010). Ademais, a caracterização bioquímica dos calos pode contribuir na elucidação de processos desencadeados pela morfogênese dos tecidos (RODRIGUES et al., 2020), tal como a quantificação do conteúdo de carboidratos.

Desse modo, objetivou-se avaliar o efeito da auxina 2,4-D, da citocinina BAP e da glutamina na indução de calos em C. pyramidale visando identificar o seu potencial embriogênico por meio de estudos histomorfológicos, bem como compreender a dinâmica do conteúdo de carboidratos ao longo do período de cultivo in vitro.

2 MATERIAL E MÉTODOS

Os ensaios in vitro foram realizados no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais (LCTV) e as análises bioquímicas no Laboratório de Germinação, os quais estão alocados na Unidade Experimental Horto Florestal (UEHF) pertencentes à Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS). As análises histológicas foram feitas no Laboratório de Biologia Celular e Tecidual (LBCT), localizado na Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro.

2.1 Material vegetal

Foram utilizadas sementes de C. pyramidale coletadas no distrito de Juremal (Latitude 9°43’51.12’’Sul e Longitude 40°21’02.52’’Oeste) que está inserido no domínio territorial do município de Juazeiro – BA, as quais foram cedidas pela Embrapa Semiárido localizada no município de Petrolina - BA. Para os experimentos, foram utilizados segmentos foliolares obtidos de plântulas após 45 dias de germinação in vitro.

2.2 Germinação in vitro

As sementes foram lavadas com água e detergente neutro, permanecendo em água corrente por 10 minutos. Em seguida foi realizada a desinfestação em etanol a 70% (1 minuto) e hipoclorito de sódio (2,5% de cloro ativo) com duas gotas de detergente neutro por 10 minutos, posteriormente as sementes foram submetidas à lavagem por três vezes em água destilada estéril. Após este processo, foram inoculadas em tubos de ensaio (25 x 150 mm) contendo 10 mL de meio de cultura WPM (Woody Plant Medium) (LLOYD; MCCOWN, 1980), suplementado com 87,64 mM de sacarose e solidificado com 7 g L^-1 de ágar.

O pH do meio de cultura foi ajustado para 5,7 ± 0,1, antes da autoclavagem a uma temperatura de 121 ºC por 15 minutos. As sementes foram mantidas em sala de crescimento com temperatura de 25 ± 3 ºC, fotoperíodo de 14 horas e radiação fotossintética ativa de 60 µm.m^-2 s^-1. As plântulas obtidas após 45 dias da germinação in vitro foram utilizadas como fonte de explante para os experimentos.

2.3 Efeito do 2,4-D, BAP e da glutamina na indução da calogênese a partir de explantes foliolares

Segmentos foliolares (± 0,5 cm²), obtidos a partir dos foliólulos de plântulas germinadas in vitro de C. pyramidale, foram excisados nas extremidades longitudinais e posteriormente imersos em ácido ascórbico (1,14 mM) por 10 minutos. Em seguida, os explantes foram inoculados em placas de Petri (90 mm x 15 mm) contendo 30 mL de meio de cultura MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), suplementado com diferentes concentrações (0,0; 2,5; 5,0; 10,0 μM) de 2,4-D combinadas com concentrações (0,0; 2,5 e 5,0 μM) de BAP e glutamina (0,0; 0,342 e 0,684 mM). O meio de cultura foi acrescido com 87,64 mM de sacarose e solidificado com 7 g L^-1 de ágar, tendo o seu pH ajustado para 5,7 ± 0,1.

O delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC) em esquema fatorial 4 x 3 x 3 (concentrações de 2,4-D x concentrações de BAP x concentrações de glutamina), totalizando 36 tratamentos. Cada tratamento foi constituído por cinco repetições (placas), sendo cada repetição composta por 5 unidades experimentais (cinco explantes). As culturas foram mantidas em câmara de incubação, tipo B.O.D (Biochemical Oxygen Demand), com temperatura de 25 ± 3 ºC, na ausência de luz. Após 45 dias de cultivo, foram avaliadas a porcentagem dos explantes responsivos para formação de calos (ERFC) e a massa fresca dos explantes com e sem calos (MFEC).

2.4 Estabelecimento da curva de crescimento de calos

Para o estabelecimento da curva de crescimento, foi utilizado o tratamento contendo meio de cultura MS suplementado com 5,0 μM de BAP, 7,0 µM de 2,4-D e 0,684 mM de glutamina (melhor tratamento obtido no item anterior), acrescido com 87,64 mM de sacarose e solidificado com 7 g L^-1 de ágar, tendo o seu pH ajustado para 5,7 ± 0,1. A curva foi determinada pela quantificação da massa fresca (mg) dos explantes durante a indução de calos a partir do dia “zero” (explantes antes da inoculação) até completar 77 dias, em intervalos de 7 dias, totalizando 12 períodos. O percentual de crescimento dos calos foi determinado por meio da equação: Pf – Pi/Pf x 100, onde Pi = Peso inicial e Pf = Peso final de calos (SMITH, 1992). Foram utilizadas quatro repetições, sendo cada repetição constituída por cinco unidades experimentais (cinco calos).

Amostras obtidas em cada período de incubação (em intervalos de 7 dias), contados a partir do dia “zero” (explantes antes da inoculação) foram coletadas para análises histomorfológicas e bioquímicas.

2.5 Análises do conteúdo de carboidrato

A quantificação bioquímica realizada foi baseada na metodologia descrita por Nogueira et al. (2007), com modificações. Para determinação dos açúcares redutores (AR) e açúcares solúveis totais (AST), as amostras (100 mg de massa fresca), em triplicata biológica para cada tratamento, foram maceradas com auxílio de almofariz e pistilo em 10 mL de água destilada. Em seguida, foram colocados em tubo de centrífuga e permaneceram em banho-maria à temperatura de 40 °C por 30 minutos e, logo após, foram submetidos à centrifugação por 15 minutos a 25 °C e 3000 rpm. O sobrenadante foi obtido e armazenado a ± -20 ºC até a realização da análise. A quantificação dos AST foi realizada pelo método de Antrona (YEMM; WILLIS, 1954) e do AR pelo método do DNS (MILLER, 1959), utilizando solução de glicose como padrão. A leitura da absorbância foi realizada em espectrofotômetro Uv-Vis a 540 nm para AR e 620 nm para AST. O equipamento foi zerado com o branco (0,5 mL de água destilada no lugar da amostra), sendo a quantificação baseada em curva padrão para glicose. As concentrações de sacarose foram determinadas pela diferença entre os teores de açúcares solúveis totais e açúcares redutores, multiplicada pelo fator 0,95.

2.6 Análises histomorfológicas dos calos

Foram realizadas avaliações histomorfológicas nas amostras de calos obtidos a cada período da curva de crescimento, visando caracterizar a presença de células em divisão com características embriogênicas e/ou embriões somáticos. Para tanto, as amostras foram fixadas em FAA 70% durante 72 horas e, após a fixação, foram progressivamente desidratadas em série etanólica (70, 90 e 100%), por duas vezes de aproximadamente 1 hora em cada tempo de desidratação.

Após a desidratação, as amostras foram infiltradas com historesina e etanol 100% (1:1) durante 12 horas e, subsequentemente, com historesina pura durante 24 horas, em seguida foram emblocadas em historesina (Leica Microsystems®). Secções longitudinais (com aproximadamente 7 μm) das amostras embebidas foram obtidas com micrótomo rotatório (Leica RM2235®), utilizando lâmina descartável (Leica 818®). As secções histológicas foram montadas em lâminas e coradas com azul de toluidina (1%) durante 1 minuto. As amostras foram observadas em microscópio óptico Axioplan (Zeiss), e as imagens foram obtidas com câmera Axioncam MRc5 (Zeiss) e processadas com auxílio de Software AxioVision LE Versão 4.8 (Zeiss).

2.7 Análise Estatística

Os dados foram avaliados estatisticamente por meio do Software R (v.3.5.3) com auxílio do aplicativo de apoio RStudio. Esses foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade de variâncias, Shapiro-Wilk e Bartlett a 5% de probabilidade, respectivamente. Em seguida, foi realizada a análise de variância. As médias originais foram submetidas à regressão.

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A análise de variância demonstrou efeito altamente significativo (p ≤ 0,01) do fatorial triplo (2,4-D x BAP x Glutamina) para as duas variáveis avaliadas. Ao analisar a porcentagem de explantes responsivos para a formação de calos (ERFC), verificou-se que na ausência de glutamina foi constatado comportamento quadrático ascendente (Figura 1A) tanto em meio isento (p ≤ 0,05) de BAP, quanto em maior concentração (p ≤ 0,01). A resolução da equação polinomial indica que o ponto de máxima (87,85%) para “ERFC”, na ausência da citocinina, é atingido com a utilização do valor calculado de 7,1 µM de 2,4-D. Já, na maior concentração de BAP testada (5,0 µM), o ponto de máxima estimado (109,76%) é alcançado com a utilização de 7,0 µM de 2,4-D (Figura 1A).

Figura 1
Percentagem de explantes responsivos para formação de calos (ERFC) e massa fresca dos explantes com calos (MFEC) obtidos a partir de segmentos foliolares de Cenostigma pyramidale aos 45 dias de cultivo em meio de cultura MS contendo diferentes concentrações de BAP, 2,4-D e Glutamina

Esses resultados mostram a importância da interação entre os reguladores de crescimento para ERFC em C. pyramidale, já que as plantas possuem um sistema de sinalização que as possibilita perceber e responder aos sinais do ambiente, os quais são mediados por hormônios vegetais, como auxinas e citocininas, possuindo funções essenciais em processos celulares, como divisão, expansão e diferenciação, eventos considerados vitais ao crescimento e desenvolvimento das plantas (NORDSTRÖM et al., 2004).

Dessa forma, os hormônios são compostos químicos endógenos de fácil transporte entre células responsivas, sendo diretamente associados a eventos, como o controle da atividade gênica na transcrição e na tradução (SKALICKÝ et al., 2018). Assim, é provável que essas células responsivas aos reguladores de crescimento para a indução de calos sejam caracterizadas pela presença de receptores que se ligam ao hormônio e então iniciam a resposta celular, teoria que pode fundamentar a resposta obtida neste estudo quanto à capacidade responsiva aos estímulos da indução à calogênese.

A interação entre auxinas e citocninas pode ser sinergística, antagônica ou aditiva, evidenciando a complexidade presente na troca de sinais do metabolismo vegetal, que também é dependente da espécie e do tecido vegetal em questão (NORDSTRÖM et al., 2004). Os resultados obtidos mostram que, em C. pyramidale, a interação foi do tipo sinergística, evidenciada pelo efeito positivo da combinação dos reguladores de crescimento vegetais testados

Na maioria das plantas, o equilíbrio entre as concentrações de auxina/citocinina aplicados ao meio de cultura tende a favorecer, em geral, a formação de calos. Reis et al. (2017) combinaram o uso da auxina 2,4-D com a citocinina CIN (cinetina) em explantes foliares e internodais de Alternanthera brasiliana (L.) Kuntze e observaram a taxa máxima (100%) de formação de calos em explantes foliares durante 30 dias no tratamento, contendo 4,53 μM de 2,4-D combinado com 4,65 μM de CIN. Já, Santos et al. (2016) verificaram a maior porcentagem (100%) de indução de calos em folhas de Piper permucronatum Yunck. na combinação de 4,52 μM de 2,4-D e 4,44 μM de BAP.

É valido ressaltar que grande parte dos estudos de calogênese são delineados com a utilização da auxina 2,4-D, isso devido a sua característica “potente” na indução de calos (KHAN et al., 2018), já que atua no metabolismo do RNA (ácido ribonucleico), estimulando a transcrição de RNAs mensageiros capazes de decodificar para o crescimento e que podem induzir a proliferação celular desordenada (GEORGE et al., 2008).

Em meio de cultura contendo 0,34 mM de glutamina, a variável porcentagem ERFC apresentou comportamento quadrático ascendente (p ≤ 0,01) na ausência e na presença 2,5 µM de BAP, demonstrando pontos de máxima 87,80% e 107,85% nas concentrações estimadas de 6,7 e 6,1 µM de 2,4-D, respectivamente (Figura 1B). Na maior concentração de BAP testada (5,0 µM), não foi possível o ajuste de um modelo matemático significativo. Na maior concentração de glutamina testada (Figura 1C), a variável ERFC apresentou comportamento quadrático ascendente (p ≤ 0,01) para todas a concentrações de BAP testadas, assim, a solução da equação resultou nos seguintes pontos de máxima: 74,41% (0,0 µM de BAP), 95,66% (2,5 µM de BAP) e 116,65% (5,0 µM de BAP), os quais foram obtidos utilizando, respectivamente, as concentrações de 7,1 µM, 5,6 µM e 6,9 µM da auxina 2,4-D.

Além da adição da citocinina combinada com a auxina, o uso da glutamina também pode ter influenciado nos resultados, assim como relatado por Silva et al. (2020) em culturas calogênicas de Myracrodruon urundeuva. No entanto, diferentemente do observado nesse estudo, os autores Silva et al. (2020) revelaram a presença de formações globulares, indicando o potencial embriogênico dos calos em M. urundeuva. Utilizar a glutamina no meio de cultura, embora seja um tema pouco abordado na literatura, possui relação com a indução de embriões somáticos. Lino et al. (2008) avaliaram o efeito da glutamina na indução de embriões somáticos a partir de inflorescências masculinas em bananeiras triploides (Musa sp). Esses autores verificaram na bananeira ‘Maçã’ a formação de embriões somáticos de coloração esbranquiçada nas concentrações de 342,13; 684,27 e 1026,40 mM de glutamina com frequências de 60%, 50% e 40%, respectivamente. Por outro lado, Lopes et al. (2016) verificaram que a utilização apenas da glutamina não exerceu influência no desenvolvimento dos calos de Hilocereus undatus, não apresentando diferenças visíveis nem estatísticas, no entanto esses autores constataram que a suplementação do meio de cultura com 2,4-D e glutamina induziu a formação de calos.

Analisando a variável MFEC, em meio isento de glutamina, verificou-se comportamento quadrático ascendente (p ≤ 0,01) na presença da citocinina BAP (Figura 1D). A equação polinomial indica que os pontos de máxima estimados de 275,20 mg (2,5 µM de BAP) e 336,90 mg (5,0 µM de BAP) são atingidos com os valores calculados de 6,78 e 6,40 µM de 2,4-D, respectivamente. Na ausência de BAP, a variável apresenta comportamento linear crescente (p ≤ 0,05) (Figura 1D). A massa fresca dos calos em meio contendo 0,34 mM de glutamina demonstrou comportamento quadrático ascendente (p ≤ 0,05) na presença de 2,5 µM de BAP. Estima-se que o ponto de máxima de 253,17 mg seja obtido com o uso de 6,54 µM da auxina 2,4-D (Figura 1E).

Em Cenostigma pyramidale, a combinação de auxina, citocinina e glutamina foi importante para incremento da MFEC dos calos. Santos et al. (2014), em culturas de Cissus verticillata (L.) Nicolson & C. E. Jarvis, observaram que o incremento de massa fresca foi dependente da suplementação com auxina (2,4-D) e citocinina (BAP) para indução de calos em explantes foliares. Entretanto, além da utilização de reguladores de crescimento, existem outros fatores que influenciam no processo de calogênese e acúmulo de massa fresca, dentre eles o genótipo, tipo de explante e o ambiente de cultivo. Copeland (2017), por exemplo, testando diferentes concentrações de 2,4-D (4,5; 9,0; 13,5; 18,0; 22,5 μM) na indução de calos em diferentes acessos de Poincianella pyramidalis, verificou que a produção de massa fresca dos calos oriundos de explantes foliares variou entre os acessos utilizados, muito provavelmente pela variabilidade genética que influenciou na diferença entre as taxas de massa fresca, além do efeito da auxina, responsável pelo início da divisão celular e pelo controle dos processos de crescimento e alongamento celular (CAMPANONI; NICK, 2005).

Silva et al. (2020) avaliando o efeito da auxina 2,4-D, da citocinina CIN (cinetina) e da glutamina na calogênese de Myracrodruon urundeuva verificaram que, ao adicionar 2,5 μM de CIN, 2,5 μM de 2,4-D associados com 0,68 μM de glutamina no meio de cultura, foi alcançada a maior média (166,73 mg) de massa fresca a partir em explantes foliares da espécie. O aumento das concentrações (5,0 μM de CIN, 5,0 μM de 2,4-D e 1,37 μM) no meio de cultura foi suficiente para redução do conteúdo de massa fresca, resultando em 144,15 mg de biomassa.

Para as demais concentrações de BAP testadas, não foi possível o ajuste de um modelo matemático significativo. Analisando a maior concentração (0,68 mM) de glutamina testada em relação às concentrações de citocinina e auxina, observa-se ajuste de um modelo matemático significativo apenas na presença de 5,0 µM de BAP, em que a variável demonstra comportamento linear crescente (p ≤ 0,01) (Figura 1F).

Analisando a curva de crescimento dos calos, verificou-se padrão sigmoidal, com cinco fases distintas: lag, exponencial, linear, desaceleração e declínio (Figura 2).

Figura 2
Curva de crescimento de calos formados a partir de explantes foliolares de Cenostigma pyramidale inoculados em meio de cultura MS suplementado com 5,0 μM de BAP, 7,0 µM de 2,4-D e 0,684 mM de glutamina durante 77 dias de incubação exibindo distintas fases: I – lag; II – exponencial; III – linear; IV – desaceleração e V – declínio

A primeira fase da curva de crescimento, conhecida como fase lag, ocorreu até o 7º dia de cultivo (Figura 2) e representou um percentual de 88,99% de crescimento, o que pode ser considerado elevado quando comparado ao estudo de calogênese em Myracrodruon urundeuva Fr. All. no qual os autores verificaram que, neste mesmo intervalo de tempo, o crescimento foi de 33,86% (SILVA et al., 2020). Essa fase pode ser definida como o período em que as células do tecido vegetal iniciam a produção de energia e preparam-se para o início das divisões celulares, o que, segundo Stein et al. (2010), acontece em virtude do início da mobilização de metabólitos e síntese de proteínas. Em outros estudos é possível perceber as diferenças entre o comportamento de diferentes espécies quanto ao tempo em que a mesma fase ocorre, como relatado no trabalho de Santos, Souza e Paz (2017) que verificaram que a fase lag na curva de crescimento dos calos obtidos a partir de folhas de Capsicum annuum var. annuum cv. Iberaba Jalapeño ocorreu até o 12º dia de cultivo. Por outro lado, Stein et al. (2010) verificaram que essa mesma fase em culturas de Inga vera Willd. subsp. affinis (DC.) T.D. Penn. ocorreu até o 40º dia.

A fase exponencial (fase II) ocorreu entre o 7º e o 28º dia de cultivo, cuja taxa de crescimento foi de 93,62% (Figura 2). Neste intervalo verificou-se leve aumento na taxa de crescimento quando comparado à fase anterior. O início desta fase é marcado pelo aumento das divisões celulares, comportamento que, diferentemente da Cenostigma pyramidale, em explantes foliares de Piper permucronatum, expressou-se do 21º ao 49º dia de cultivo (SANTOS et al., 2016). Entretanto, em calos de aroeira-do-sertão, partindo de explantes foliares e considerando a sua característica lenhosa, a fase exponencial ocorreu exatamente do 7º ao 28º período de cultivo, comportamento similar ao da espécie em estudo (SILVA et al., 2020).

A fase linear foi observada entre o 28º e o 56º dia após inoculação, representando um percentual de crescimento de 51,07% (Figura 2). Nesse período os calos tendem a diminuir o processo de divisão celular e aumentar a área celular (FEITOSA et al., 2013). Para Hilocereus undatus, esse período foi observado entre 14 e 28 dias (LOPES et al., 2016); já, em Capsicum annuum var. annuum cv. Iberaba Jalapeño, o crescimento dos calos oriundos de folhas apresentou fase linear do 25º ao 31º dia de cultivo (SANTOS; SOUZA; PAZ, 2017).

A interpretação da curva de crescimento dos calos de catingueira revelou que do 56º ao 63º dia de cultivo iniciou-se a fase de desaceleração (Figura 2) com taxa de crescimento que chegou a 5,57%, período extremamente relevante ao estudo, que se caracteriza pela redução das divisões celulares, maior produção de metabólitos secundários e, principalmente, marca o momento que deve ser iniciado o processo de repicagem dos calos (PAN et al., 2020). O início do processo de repicagem deve ocorrer na fase de desaceleração devido à redução de nutrientes, produção de compostos tóxicos, secagem do ágar e redução do oxigênio no interior das células (SANTOS et al., 2016).

Por fim, a quinta e última fase identificada no presente estudo foi a fase de declínio, representada do 63º ao 77º dia de cultivo (Figura 2), com percentual de crescimento de 58,44%, valor que está intimamente ligado à definição desta fase. Segundo Santos et al. (2010), esta fase é o período em que ocorre perda de peso devido à morte celular. Oposto ao ocorrido neste estudo com a catingueira, Pan et al. (2020) estudando o padrão de crescimento de calos em Bletilla striata Rchb. f., verificaram que, logo após 39 dias de cultivo in vitro, os calos apresentavam um escurecimento óbvio, indicando que o crescimento entrou na fase de recessão, ou seja, foi caracterizada a fase de declínio.

Amostras de diferentes períodos da curva de crescimento foram submetidas a avaliações histomorfológicas, visando identificar possível potencial embriogênico. Inicialmente, a seção transversal do explante foliar, antes da inoculação, revela, em seu estado de origem, estruturas como epiderme unisseriada em ambas as faces, sendo hipoestomática, parênquima paliçádico também unisseriado, parênquima lacunoso com grandes espaços intercelulares, sistema vascular pouco desenvolvido, característico de folhas provenientes do cultivo in vitro, ainda sem nenhum tipo de alteração anatômica (Figura 3).

Figura 3
Detalhes anatômicos do corte transversal do explante foliar de Cenostigma pyramidale [Tul.] Gagnon & G.P.Lewis antes da inoculação para indução de calos

Após 7 dias de incubação, período que corresponde ao fim da fase lag e início da fase exponencial da curva de crescimento, foi possível observar uma grande evolução anatômica a partir do tecido foliar inicial, com modificação estrutural visualizada através do aumento do número de células a partir do parênquima lacunoso, com a presença de grupos de células aderidas e pouco organizadas (Figura 4). Na Figura 4, pode-se verificar a formação de calo com a presença de células com baixo potencial meristemático, por apresentarem-se altamente vacuolizadas (setas vermelhas), e a existência de células pequenas, isodiamétricas, pouco vacuolizadas, núcleo evidente e citoplasma denso (setas brancas), o que caracteriza células meristemáticas, podendo indicar que, aos 7 dias, o calo induzido possui características de culturas embriogênicas.

Figura 4
Aspectos histológicos, em corte transversal, dos calos ao 7º dia de crescimento que corresponde ao início da fase exponencial, oriundos de explantes foliolares de Cenostigma pyramidale [Tul.] Gagnon & G. P. Lewis em meio de cultura MS suplementado com 5,0 μM de BAP, 7,0 µM de 2,4-D e 0,684 mM de glutamina

No decorrer do desenvolvimento dos calos, mais especificamente durante a fase exponencial e até o fim da fase linear (do 21º ao 42º dia de incubação), verificou-se que os calos continuaram apresentando células com características meristemáticas, i.e., isodiamétricas, aderidas, pouco vacuolizadas, com citoplasma denso e núcleos proeminentes (regiões da figura 5 destacadas em vermelho), em meio a grupos de células altamente vacuolizadas, com características não meristemáticas. Essas características sugerem que as células do calo estão em divisão celular e, neste caso, podem evoluir com a formação de áreas meristemáticas periféricas (SILVEIRA et al., 2013) (Figura 5). Esse tipo de célula, a depender do estímulo, pode se tornar competente para se dividir e diferenciar em embriões somáticos.

Figura 5
Aspectos histológicos de calos ao 21º (A), 28º (B), 35º (C) e 42º (D) dia de incubação, oriundos de explantes foliolares de Cenostigma pyramidale [Tul.] Gagnon & G. P. Lewis em meio de cultura MS suplementado com 5,0 μM de BAP, 7,0 µM de 2,4-D e 0,684 mM de glutamina

A indução da embriogênese somática é o desencadeamento de um processo morfogenético influenciada por diversos fatores, entre os quais podem se destacar os diferentes genótipos e tipos de explante, estádios de desenvolvimento dos explantes, composição do meio de cultura, tipo e concentração do regulador de crescimento utilizado (CARNEROS et al., 2009).

A embriogênese somática indireta requer a determinação de células diferenciadas, a proliferação de calos e a indução de células embriogênicas, eventos que dependem da ação de reguladores de crescimento, não apenas para a retomada da atividade mitótica, mas também para a determinação do estádio embriogênico (MACIEL et al., 2010). As auxinas e citocininas têm papel fundamental na embriogênese somática de várias espécies de plantas. Neste estudo, os resultados supracitados quanto à identificação das principais alterações morfoanatômicas presentes nas células ao longo do desenvolvimento dos calos evidenciam efeito positivo da suplementação com reguladores de crescimento vegetal 2,4-D e BAP. Similarmente, em estudos com Sisal (Agave sisalana Perrine), também foi relatado que o uso do 2,4-D e BAP foi preponderante na indução de calos com potencial embriogênico (CARNEIRO et al., 2014).

Silveira et al. (2013) descrevem, em estudos com cana-de-açúcar (Saccharum officinarum), que para determinação de características que diferem os calos embriogênicos dos não-embriogênicos, o calo embriogênico apresenta células pequenas, isodiamétricas, com citoplasma denso, os quais originam estruturas globulares. Enquanto, os calos não-embriogênicos possuem células bastante desorganizadas, alongadas e altamente vacuoladas.

Assim, neste estudo com a catingueira, foi possível identificar evidências morfohistológicas que sugerem que os calos possuem potencial embriogênico, juntamente com células de calos sem nenhum potencial para desenvolvimento de embriões somáticos. No entanto, não foi possível identificar a presença de embriões somáticos em diferentes estádios de desenvolvimento, sugerindo que esses calos devem passar por um teste de maturação quando encontram-se na fase exponencial (7º - 28º dia), para ocorrer o estímulo para a diferenciação dos embriões somáticos. A maturação trata-se de uma etapa crucial para o processo de embriogênese somática, em que normalmente utilizam-se compostos químicos, como o ácido abscísico (ABA) (RAI et al., 2011) usado, por exemplo, em Picea spp. (HAZUBSKA-PRZYBYL et al., 2016), agentes osmóticos como PEG ou maltose (HERINGER et al., 2013) ou ainda carvão ativado, como em cana de açúcar (SILVEIRA et al., 2013).

A análise bioquímica dos calos após 77 dias de cultivo revelou a presença de AST, sacarose e AR, sendo que, este último, após o 21º dia pós-inoculação não foi detectado pelo método utilizado, provavelmente porque o que era produzido estava sendo prontamente consumido em função das demandas celulares. Os teores de açúcares solúveis totais e sacarose aumentaram até o 14º dia de cultivo, com queda a partir do 21º dia (Figura 6).

Figura 6
Conteúdo de carboidratos em calos de Cenostigma pyramidale [Tul.] Gagnon & G. P. Lewis obtidos a partir de explantes foliolares inoculados em meio de cultura MS suplementado com 5,0 μM de BAP, 7,0 µM de 2,4-D e 0,684 mM de glutamina, durante 77 dias de incubação

Verificou-se nos explantes no tempo inicial, ou seja, no dia “zero” (antes da inoculação) até o 21º dia de cultivo, uma redução nos teores de AR e um aumento nos teores de AST e sacarose (Figura 6). Esse período corresponde a fase lag e início da fase exponencial da curva de crescimento dos calos (Figura 6). O início da fase exponencial corresponde a uma fase de alta divisão celular resultando no aumento do crescimento dos calos, e, por consequência, é um período de alta demanda energética, sendo marcada neste estudo pela redução do conteúdo de AR, sugerindo o seu uso nesta fase. Além disso, é possível que os AR tenham sido convertidos pelas células em AST e sacarose. Após o 21º dia, verificou-se diminuição considerável dos teores de AST e sacarose (Figura 6).

Esse resultado é semelhante ao relatado por Santos et al. (2008) que, ao analisarem o conteúdo de AR de calos formados a partir de segmentos foliares e nodais de Coffea canephora 'Apoatã', verificaram que o teor máximo desses carboidratos ocorreu no dia da inoculação dos explantes (0 dia de cultivo, início da fase lag), a partir do qual apresentou redução, atingindo um teor mínimo no 84º dia, que foi o último de cultivo. O conteúdo de carboidratos presente nos explantes foliolares, que são utilizados durante a inoculação, originou-se da planta doadora, que em razão do cultivo heterotrófico absorveu a sacarose disponível no meio de cultura (SILVA et al., 2020).

Dessa forma, o aumento dos teores de AST e sacarose observado durante a fase lag e início da fase exponencial, pode ter ocorrido, certamente, em virtude da degradação do amido armazenado nos cloroplastos do explante foliar em sacarose, assim como também pode ter havido absorção de carboidratos do meio de cultura para serem utilizados no crescimento, visto que esta é uma fase de preparação para este objetivo. O amido é o principal carboidrato de reserva nas plantas, e condições de escuro dão início à degradação do amido dos cloroplastos para manter a exportação de sacarose (SMITH; ZEEMAN; SMITH, 2005). Os carboidratos, além de serem fontes de carbono, afetam o crescimento dos calos, particularmente a divisão e expansão celular, e podem também estar envolvidos com redes de sinalização de hormônios vegetais, na modulação de processos críticos, como o estabelecimento de embriões (EVELAND; JACKSON, 2012).

O início da fase exponencial é caracterizado pela intensa divisão celular visando a fase posterior, dessa forma, no 28º dia, final da fase exponencial, verificou-se redução no conteúdo de sacarose e consequentemente do AST, indicando que a sacarose foi possivelmente utilizada na síntese de proteínas e/ou açúcares estruturais, como a celulose (SILVA et al., 2020). Semelhante a isso, em calos de Byrsonima intermedia, os teores de AST apresentaram tendência geral de declínio, embora tenham expressado maior conteúdo nos explantes antes da inoculação (NOGUEIRA et al., 2007).

A partir do 35º dia, foi observada uma redução no conteúdo de AST e de sacarose (Figura 6). Esse comportamento tem relação direta com a fase linear, caracterizada por atividade mitótica menor que a exponencial. Todavia, trata-se de um período em que ainda há a necessidade de energia para os processos envolvidos no aumento da área celular que influenciam no acréscimo de peso dos calos nesta espécie. Os carboidratos fornecem esqueletos de carbono e energia para a biossíntese de compostos orgânicos envolvidos no metabolismo celular (SANTOS et al., 2010).

Nesse sentido, os resultados obtidos no período de transição da fase exponencial à fase linear ocorreram devido à necessidade de carboidratos como fonte de energia para o crescimento dos calos. Santos et al. (2010) estudando o comportamento dos carboidratos em calos de Jatropha curcas verificaram que os teores de AST se mantiveram baixos desde o dia da inoculação até os 77 dias de cultivo, sendo resultados contrários ao observado para C. pyramidale.

A partir do 28º dia até o final de cultivo em diante, o comportamento de acúmulo de carboidratos oscilou com tendência a declínio (Figura 6). Esse resultado pode ser devido, provavelmente, à disponibilidade de sacarose no meio de cultura e redução da demanda energética, afinal a etapa de intensa atividade celular já havia cessado, comportamento este que corrobora com as fases da curva de crescimento, pois em seguida inicia-se a fase de desaceleração e declínio (Figura 2). Diferentemente ao observado neste trabalho, calos de murici-pequeno (Byrsonima intermedia A. Juss.) durante 120 dias de cultivo apresentaram um pico de AST aos 70 dias, e os autores atribuíram tais resultados à absorção da glicose e frutose contidas em pequenas quantidades no meio de cultura e obtidas pela quebra da sacarose durante a autoclavagem (NOGUEIRA et al., 2007).

4 CONCLUSÕES

O tratamento com 5,0 de μM BAP, 7,0 µM de 2,4-D e 0,684 mM de glutamina possibilitou a indução de calos a partir de explantes foliolares. A curva de crescimento dos calos apresenta forma sigmoidal com cinco fases distintas (lag, exponencial, linear, desaceleração e declínio) durante 77 dias de cultivo. Verificou-se a presença de células com características similares àquelas consideradas meristemáticas nos calos a partir de 7 dias de indução, sugerindo um potencial embriogênico dos calos. Porém, não foi constatado desenvolvimento de embriões somáticos, sendo necessários estudos futuros associados com a maturação dos calos para sua diferenciação. O conteúdo de AR, sacarose e AST variou em função das fases de crescimento dos calos durante a indução, com redução de AR e aumento de AST e sacarose até o 21º dia de incubação, sendo que a partir deste dia não houve AR e o conteúdo de sacarose e AST reduziram até o 77º dia de incubação.

Como citar este artigo

• Carvalho Filho, R. S. L.; Silva, T. S.; Ribeiro, Y. R. S.; Santa-Catarina, C.; Santana, J. R. F. Caracterização histomorfológica e bioquímica de calos induzidos em Cenostigma pyramidale [Tul.] Gagnon & G.P. Lewis. Ciência Florestal, Santa Maria, v. 33, n. 1, e66334, p. 1-26, 2023. DOI 10.5902/1980509866334. Disponível em: https://doi.org/10.5902/1980509866334.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  26 Jun 2023
• Data do Fascículo
  2023

Histórico

• Recebido
  17 Jun 2021
• Aceito
  20 Jan 2023
• Publicado
  28 Mar 2023