2.1 Reagentes

Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico. Para o preparo das soluções, utilizou-se água deionizada, obtida a partir de um sistema de destilação em um destilador de vidro (MA078/5, Marconi, SP) e, posteriormente, eluída em um deionizador (CS1800 Evolution, Permution, PR). Soluções de trabalho para Mg e Na foram preparadas por diluições feitas a partir de uma solução estoque para AAS contendo 1.000 mg L^-1 (Fluka, Buchs, Suíça). Para Zn e Fe, as soluções de trabalho foram obtidas de forma semelhante, a partir de soluções estoque que foram preparadas a uma concentração de 1.000 mg L^-1 de Tritisol® (Merck, Darmstadt, Alemanha), em água deionizada. Para Ni, Mn, Ca e K, foi utilizada a solução padrão multielementar para ICP n.º 6, 100 mg L^-1 (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA). Na etapa de preparo das amostras, foram utilizados HNO₃ 65% v/v (Synth, Diadema, Brasil), bidestilado abaixo do seu ponto de ebulição, em um destilador de quartzo MA-075 (Marconi, Piracicaba, Brasil), e H₂O₂ 30% v/v (Merck, Darmstadt, Germany). Toda a vidraria e os materiais de laboratório foram descontaminados por imersão em HNO₃ 10% v/v por, pelo menos, 24 h, sendo posteriormente lavados com água deionizada e secos à temperatura ambiente antes de seu uso.

2.2 Amostras

As amostras avaliadas foram cervejas de marcas comerciais e cervejas artesanais produzidas no Brasil. Um total de 23 amostras de cerveja dos tipos porter, lager, pale ale e weiss foi adquirido em mercado local (Pelotas-RS, Brasil), sendo seu conteúdo homogeneizado e desgaseificado em banho ultrassônico [40 (H) S Elmasonic, Elma, Singen, Alemanha] por 15 min antes dos experimentos ou armazenado a -18 °C. Para o desenvolvimento do método, foi utilizada uma cerveja tipo porter (amostra 1). Além desta, outras três amostras de cerveja dos tipos lager (amostra 2), pale ale (amostra 3) e weiss (amostra 4) foram utilizadas para verificar a exatidão do método, através de ensaios de adição e recuperação. Para o estudo comparativo entre as técnicas monoelementar (F AAS e F AES) e multielementar (MIP OES), novos lotes das mesmas amostras foram adquiridos, numerando-os de 5 a 8. Após a verificação da exatidão, o método foi aplicado na determinação de Ca, Fe, K, Mg, Mn, Na, Ni e Zn em outras 15 amostras de cerveja, por MIP OES (amostras 9 a 23).

2.3 Preparo da amostra

O preparo das amostras foi realizado através de decomposição ácida em bloco digestor convencional (modelo MA-4025, Marconi, Brasil), utilizando-se tubos digestores acoplados a um sistema de refluxo com recirculação de água a 15 °C, proveniente de um banho termostatizado (modelo Q-214M2, Quimis, São Paulo, SP, Brasil). Em cada tubo reacional, foi introduzido um dedo frio, o que permite o uso de temperaturas superiores ao ponto de ebulição dos ácidos no bloco digestor. Embora o meio reacional não alcance a mesma temperatura aplicada no bloco digestor, outros fenômenos, como transferência de calor e turbulência, promovem uma decomposição mais rápida e eficiente.

O procedimento de digestão foi otimizado através de um planejamento estatístico e foi aplicado para todas as amostras, conforme segue: 10,0 mL da amostra desgaseificada e 5,0 mL de HNO₃ foram adicionados no tubo digestor com auxílio de micropipetas, seguido de uma etapa de aquecimento com o bloco digestor a 160 °C, por 75 min. Posteriormente a um breve resfriamento, foram adicionados 2,0 mL de H₂O₂ e novamente aquecido por mais 18 min, para a completa mineralização, obtendo-se, por fim, uma solução resultante que foi quantitativamente transferida e avolumada a 25,0 mL com água deionizada.

Para o desenvolvimento deste procedimento, foi empregado um delineamento composto central rotacional (DCCR), 2³ com 3 pontos centrais e 6 pontos axiais, considerando-se as seguintes variáveis independentes: volume de amostra (de 2,5 a 10 mL), temperatura do bloco digestor (de 120 a 160 °C) e tempo de decomposição (de 30 a 120 min). Os ensaios foram realizados em triplicata e de forma aleatória, de acordo com a ordem das análises arranjadas pelo software Statistica 10.0 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, EUA), com nível de significância de 95%; consideraram-se, como variáveis dependentes, os sinais analíticos para os elementos Zn, Mg e Na. Os volumes de amostra foram normalizados para 1,0 mL, a fim de evitar interferências dos resultados. Para verificação da exatidão do método, foram realizados ensaios de recuperação com três valores de concentração, intermediários à curva de calibração, para cada elemento investigado, os quais foram adicionados à amostra, previamente à decomposição.

Após o desenvolvimento do método, o mesmo foi aplicado a 15 amostras de cervejas artesanais (amostras 9 a 23) para a determinação de Ca, Fe, K, Mn, Na, Ni e Zn, por MIP OES.

2.4 Determinações por F AAS/AES e MIP OES

As determinações monoelementares de Fe, Mg, Na e Zn foram realizadas em um espectrômetro de absorção atômica por chama Perkin Elmer AAnalyst 200 (Shelton, CT, EUA), equipado com lâmpada de deutério, para correção do sinal de fundo, e lâmpadas de cátodo oco Perkin Elmer (Shelton, CT, EUA), para cada analito. Os parâmetros instrumentais foram utilizados conforme as recomendações do fabricante. Foi utilizada a chama de ar/acetileno, com a pureza do gás oxidante de 99,7% (Linde, São Paulo, Brasil), numa vazão de ar de 10,0 L min^-1, acetileno de 2,37 L min^-1 para Na e 2,75 L min^-1 para Zn, Mg e Fe.

As determinações multielementares de Ca, Fe, K, Mg, Mn, Na, Ni e Zn foram realizadas utilizando-se um espectrômetro de emissão atômica com plasma induzido por micro-ondas MIP 4200 da Agilent Tecnologies (Melbourne, Austrália), equipado com um nebulizador e uma câmara de nebulização ciclônica de vidro dupla passagem. Nitrogênio foi extraído do ar utilizando-se um gerador de nitrogênio 4107 (Agilent Technologies, Melbourne, Austrália). O alinhamento da tocha e a calibração do comprimento de onda de cada elemento foram realizados utilizando-se uma solução de calibração em meio de HNO₃ semelhante às amostras, sendo otimizados automaticamente pelo instrumento com o MP Expert Software (versão 1.5.1.0, Agilent Technologies, Melbourne, Austrália). As condições operacionais para cada elemento analisado, como comprimento de onda, posição de observação no plasma e fluxo do nebulizador, respectivamente, foram: Ca 393,366 nm, posição 10, 0,6 L min^-1; Fe 371,933 nm, posição zero, 0,75 L min^-1; K 766,491 nm, posição 10, 1,0 L min^-1; Mg 285,213 nm, posição 10, 0,7 L min^-1; Mn 403,076 nm, posição zero, 0,9 L min^-1; Na 588,995 nm, posição zero, 1,0 L min^-1; Ni 352,454 nm, posição zero, 0,7 L min^-1; Zn 213,875 nm, posição zero, 0,55 L min^-1.

2.5 Parâmetros de mérito

Os parâmetros de mérito avaliados incluem linearidade, precisão, limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ). As curvas de calibração foram preparadas no mesmo meio ácido utilizado no preparo das amostras. Análise de variância (ANOVA) e teste t pareado no nível de 90% de significância foram utilizados para comparação entre os métodos utilizados.

3.1 Preparo de amostra

A determinação elementar através de técnicas espectrométricas pode estar acompanhada de algumas limitações, como efeitos de matriz e particularidades dos equipamentos, o que necessita de um preparo de amostra eficiente, previamente às determinações. Um exemplo disso é o MIP OES, que usa um plasma de nitrogênio, menor se comparado ao plasma induzido de argônio. Esse plasma de menor energia reflete em limitações ao teor de acidez (máximo de 5% v/v) e sólido dissolvido (3% m/v), de acordo com o fabricante do equipamento. Assim, a etapa de preparo das amostras é fundamental para a eficiência das determinações, para diminuir interferências no equipamento, como depósitos na tocha, não permitindo, por exemplo, o uso de amostragem direta ou a matriz na forma de uma suspensão. O mesmo acontece com o F AAS/AES, que, ao ser utilizado com amostras sem prévia decomposição, causa incrustação de partículas no nebulizador ou queimador. Em amostras de cerveja, embora sejam amostras na forma líquida, nem mesmo um processo de centrifugação elimina esse problema, relatado por diferentes autores, originando sinais de absorção/emissão flutuantes e não reprodutíveis, além de oscilações na chama (^{BELLIDO-MILLA et al., 2000}; ^{HERGENREDER, 1991}; ^{MATUSIEWICZ; KOPRAS, 1997}; ^{BORRIELLO; SCIAUDONE, 1980}).

Os resultados obtidos a partir do DCCR para Na, Mg e Zn, pelas técnicas de F AAS/AES, estão apresentados na Tabela 1, os quais permitem avaliar os parâmetros estatisticamente significativos no preparo da amostra, utilizando-se decomposição ácida com o sistema de refluxo. O Diagrama de Pareto, para cada analito, é apresentado na Figura 1. Entre todas as variáveis investigadas e de acordo com o Diagrama de Pareto, para Zn (Figura 1A), apenas a temperatura foi estatisticamente significativa; para Mg (Figura 1B), apenas o volume da amostra, e para Na (Figura 1C), nenhuma das variáveis se mostrou significativa. Os modelos gerados estão adequados para a descrição dos resultados e as superfícies de respostas são apresentadas na Figura 2.

Figura 1 Diagrama de Pareto a 95% de confiança para Zn (A), Mg (B) e Na (C). 

Figura 2 Gráficos de superfície de respostas: (A) relação entre volume (mL) × temperatura (°C) para Zn; (B) relação entre temperatura (°C) × volume (mL) para Mg. 

Alguns autores relatam o uso de maiores volumes de amostra, variando de 10 a 50 mL na abertura das amostras, para determinação dos minerais e contaminantes em cerveja (^{POHL; PRUSISZ, 2007}; ^{BELLIDO-MILLA et al., 2000}; ^{ALCÁZAR et al., 2002}). Neste estudo, para Zn (Figura 2A), os valores de volume estudados não apresentaram diferença estatisticamente significativa, enquanto que, para Mg (Figura 2B), os valores inferiores ao ponto central foram os que originaram resultados satisfatórios. Entretanto, quando volumes abaixo do ponto central foram utilizados, não era possível realizar a determinação de elementos em baixa concentração. Ao utilizar o maior volume (10 mL), foi possível realizar a determinação dos elementos minoritários nas amostras, bem como o Mg, que se apresenta em maior concentração. Portanto, foi escolhido o maior volume de amostra estudado (10 mL), pois este mostrou ser mais eficiente para todos os analitos, com melhores LDs e LQs.

O uso da temperatura um pouco acima do ponto de ebulição do ácido nítrico para decomposição da amostra é relatado na literatura, em muitos estudos (^{LOPEZ et al., 1998}; ^{MENA et al., 1996}; ^{HUSÁKOVÁ et al., 2007}). Na Figura 2A, observa-se que, para o Zn, as temperaturas abaixo de 130 °C e acima de 150 °C geram resultados satisfatórios. Assim, foi escolhido o maior valor de temperatura (160 °C), para permitir, com melhor eficiência, o rompimento de ligações entre os elementos e peptídeos na cerveja, que atuam na formação da espuma (^{PALMER, 2006}). Além dos benefícios já comentados anteriormente, como uma melhor eficiência na transferência de calor e aumento na turbulência do meio reacional, maior valor de temperatura torna o processo mais eficiente, em um tempo menor para o preparo das amostras de cerveja.

Para períodos mais longos de decomposição, foi observada a formação de material em suspensão, o que pode causar entupimento do sistema de nebulização dos equipamentos. Para evitar este problema durante as medições instrumentais, foi escolhido um tempo intermediário (93 minutos).

Durante a decomposição da amostra, foi utilizado o volume de 5 mL de HNO_3, o qual, em testes preliminares, mostrou-se necessário para a completa decomposição da matriz, para não ocorrerem depósitos na tocha e inviabilizar as determinações. Por tratar-se de uma amostra líquida em meio aquoso, altas diluições do ácido poderiam eliminar o seu poder oxidante.

Após a análise do DCCR, as seguintes condições de decomposição da amostra, para determinação multielementar em cerveja, foram aplicadas: 10,0 mL de amostra, 5,0 mL de HNO₃, 160 °C para a temperatura do bloco digestor e 93 min de aquecimento, sendo que 18 min desse tempo foram aplicados após a adição de 2,0 mL de H₂O₂. A precisão e a exatidão do método foram avaliadas pelos ensaios de recuperação. Além da cerveja porter (amostra 3), utilizada no desenvolvimento do método, os ensaios de recuperação foram realizados também em cerveja pale ale, lager e weiss, cujos resultados estão apresentados nas Tabelas 2 e 3. Para isso, diferentes técnicas analíticas foram utilizadas: F AES para Na, F AAS para Fe, Mg e Zn e MIP OES para Ca, K, Mn e Ni. Os valores obtidos pelo teste de recuperação variaram entre 80 e 120%, para todos os analitos, apresentando uma média de recuperação de 101, 99 e 101, para F AAS, F AES e MIP OES, respectivamente. Esses dados mostram que o método de preparo de amostra pode ser aplicado com segurança nas diferentes técnicas de espectrometria atômica, pois este forneceu resultados exatos e precisos, com um RSD médio de 3,2%.

No estudo comparativo entre as determinações mono e multielementares, para a determinação de Na, Fe, Mg e Zn (Tabela 4), o teste T pareado, considerando-se nível de confiança de 90%, mostrou que não há diferenças significativas entre as técnicas utilizadas na determinação dos analitos.

3.2 Resultados analíticos

As figuras de mérito para Ca, Fe, K, Mg, Mn, Na, Ni e Zn são apresentadas na Tabela 5. Os limites de quantificação (LQ) e detecção (LD) obtidos para o método proposto ficaram abaixo dos valores estipulados pela ANVISA, para determinação de Zn e Ni, que são de 1 e 0,1 mg L^-1, respectivamente (^{BRASIL, 1965}). Para os demais analitos estudados, não existem limites máximos na legislação brasileira. Além disso, observa-se que a determinação dos elementos por MIP OES é mais sensível frente à técnica monoelementar, apresentando melhores coeficientes angulares das curvas de calibração (aumento de sensibilidade), o qual, aliado a uma melhora na precisão das determinações (menor desvio padrão), forneceu baixos valores de LDs e LQs. Entretanto, no F AAS para o Mg e Zn, os valores de LD's e LQ's apresentaram-se menores do que no MIP OES, evidenciando também sua boa sensibilidade. Os valores de R² foram de 0,999 para quase todos os analitos, com exceção do Fe, que foi de 0,996.

A Tabela 6 apresenta os resultados da aplicação do método proposto na determinação multielementar de Ca, Fe, K, Mg, Mn, Na, Ni e Zn (mg L^-1) por MIP OES, nas amostras de cervejas de diferentes tipos e fabricantes. A identificação das amostras é apresentada de maneira numérica e aleatória, em razão da disponibilidade de obtenção no mercado, já que grande parte das amostras são cervejas especiais; assim, conforme a obtenção e a chegada ao laboratório, as amostras foram recebendo a numeração sequencial para realização das determinações. Os valores encontrados assemelham-se aos da literatura (^{MATSUSHIGE; OLIVEIRA, 1993}; ^{LEWIS; BAMFORTH, 2006}). O potássio foi o elemento estudado que apresentou os maiores teores em todas as amostras. Sua origem na cerveja, assim como outros íons, é proveniente do malte, o que está de acordo com outros estudos realizados, influenciando na qualidade final da bebida (^{LEWIS; BAMFORTH, 2006}; ^{BELLIDO-MILLA et al., 2000}; ^{ALCÁZAR et al., 2002}; ^{MARCANO et al., 2010}). Para alguns elementos, como Mn, Mg e K, a cerveja pilsen apresentou os menores valores. Possivelmente, por ser uma cerveja de menor turbidez e sabores mais suaves, pode levar em sua formulação menor quantidade de matéria-prima, como o lúpulo e o malte (^{KEUKELEIRE, 2000}), o que acarreta menores teores de alguns elementos. As cervejas dos estilos weiss (de trigo) e escuras são cervejas de maior turbidez e coloração mais intensa do que as de outros estilos (^{MOURA-NUNES et al., 2016}). Como a etapa de clarificação remove componentes da cerveja, é esperado que as amostras com maior turbidez apresentassem maiores teores de metais que as demais cervejas, o que não aconteceu.

O níquel foi um elemento encontrado em todas as cervejas, em um teor médio de 0,1 mg L^-1. Por ser um micronutriente essencial para as plantas (^{WYRZYKOWSKA et al., 2001}), sua origem na cerveja pode estar relacionada ao lúpulo ou à cevada. O Zn apresenta baixos teores na cerveja (em torno de 1 mg L^-1) e embora seja um elemento importante para a fermentação pelas leveduras, altos teores poderiam influenciar negativamente na formação da espuma, assim como outros elementos, como o Fe (^{POHL, 2008}; ^{PALMER, 2006}). O Fe, Mn e Ni estão diretamente relacionados à estabilidade oxidativa da cerveja, atuando como pró-oxidantes e na formação de flavours indesejáveis, o que evidencia sua importância no monitoramento e na escolha da matéria-prima, já que os cereais utilizados na produção são fonte desses elementos para a cerveja (^{ZUFALL; TYRELL, 2008}). De acordo com ^{Krüger e Anger (1990)}, os valores encontrados para Fe e Mn, nas amostras, estão abaixo de valores representativos para desencadear reações oxidativas prejudiciais às características sensoriais da cerveja. As diferenças encontradas nos valores dos analitos, neste estudo, podem estar relacionadas a diferentes características das cervejas, como flavour, espuma e formação de aroma entre os diferentes estilos ou até mesmo entre diferentes marcas com o mesmo estilo.

Das amostras avaliadas, apenas duas cervejas apresentaram concentração de Ni acima do limite estabelecido pela legislação brasileira (> 0,1 mg L^-1), e 10 amostras, acima do limite para Zn (> 1 mg L^-1) (35); dentre estas, por exemplo, as amostras 18 e 20, ambas cervejas escuras, apresentaram elevados teores de Ni e Zn. Verifica-se mais uma vez a importância de um método preciso e com baixos limites de detecção e quantificação para determinação desses elementos, garantindo a qualidade e a segurança dos produtos destinados ao consumo humano.

ANOVA e teste t pareado foram utilizados para determinar diferenças estatisticamente significativas entre médias das amostras. Entre a maioria das amostras de cervejas, houve diferenças estatísticas a um p < 0,05, na maioria dos elementos. Isso pode ocorrer devido a diferentes matérias-primas empregadas na fabricação, assim como a sua origem. Outro fator que contribui para essa diferença entre os valores das cervejas é a armazenagem passível de contaminações. De maneira geral, não existe uma padronização na fabricação das cervejas artesanais, assim como ocorre nas grandes indústrias. Assim, se fazem necessárias determinações constantes para evitar variações dos minerais e evitar possíveis contaminações.