Detecção de Erwinia psidii via enriquecimento em extrato de folhas de goiabeira e imunodifusão radial dupla

Detection of Erwinia psidii through enrichment in guava leaf extract and double radial immunodiffusion

Resumos

Uma das principais doenças que afetam a produção de goiaba no Brasil é a seca-dos-ponteiros, causada pela bactéria Erwinia psidii, cuja disseminação é favorecida por mudas contaminadas. O desenvolvimento de métodos diagnósticos mais eficazes poderia reduzir a disseminação da bactéria no país. Considerando a necessidade de se disponibilizar um método eficiente e simples para a detecção de E. psidii em material de propagação, foi objetivo desse trabalho produzir antissoros policlonais específicos contra a bactéria e desenvolver um método de detecção utilizando o enriquecimento da população bacteriana em extrato de folhas de goiabeira seguido de imunodifusão radial dupla. Um antissoro foi produzido contra a estirpe tipo da bactéria IBSBF 435 (ICMP 8426, NCPPB 3555), avaliado quanto à eficiência e especificidade e utilizado na determinação dos limiares de detecção da mesma. O antissoro As15-1 reagiu positivamente com todos as estirpes testadas de E. psidii, não reagindo com estirpes de outros gêneros e espécies de bactérias fitopatogênicas e apresentou reação cruzada com dois isolados não patogênicos da flora da goiabeira. O crescimento da população bacteriana no extrato de folhas foi observado após 12 h de incubação a partir de populações iniciais de 10³, 10(5) e 10(7) ufc/mL, até 60 h. A partir de 12 h, já foi possível detectar E. psidii por enriquecimento e imunodifusão radial nas amostras com populações iniciais de 10(7) ufc/mL e a partir de 36 h, detectou-se a bactéria mesmo em amostras com populações iniciais de 10³ ufc/mL. Considerando a possibilidade de falsos positivos, é recomendável associar outros métodos diagnósticos ao método aqui proposto.

Psidium guajava; bacteriose da goiabeira; sorologia; diagnóstico

One of the most important diseases affecting guava production in Brazil is bacterial blight, caused by the bacterium Erwinia psidii. Pathogen dissemination often occurs through contaminated propagating plant material. The development of more effective diagnostic methods may reduce pathogen dissemination in the country. Considering the need for a reliable and simple method for detecting the pathogen in plant material, the objectives of this study were to produce E. psdii-specific polyclonal antibodies and to develop a detection method using bacterial population enrichment on guava leaf extracts followed by double radial immunodiffusion. The antiserum was produced against the E. psidii type strain IBSBF 435 (ICMP 8426, NCPPB 3555) and its efficiency, specificity and sensitivity threshold were determined. The antiserum As15-1 was tested with strains of several plant-pathogenic bacteria and reacted positively with all strains of E. psidii, although cross reactions were detected with two non-pathogenic isolates from guava flora. Bacterial multiplication on leaf extracts was observed 12 h after incubation from initial populations of 10³, 10(5) and 10(7) ufc/mL, up to 60 h. After 12 h it was already possible to detect E. psidii in samples with starting populations of 10(7) cfu/mL. After 36 h, the enrichment technique allowed the detection of E. psidii using double radial immunodiffusion in samples with populations as low as 10³ cfu/mL. Considering the possibility of false positives it is desirable to associate other diagnostic methods with the method proposed in this study.

Psidium guajava; guava die-back; serology; diagnostic methods

RESEARCH ARTICLE ARTIGO

Detecção de Erwinia psidii via enriquecimento em extrato de folhas de goiabeira e imunodifusão radial dupla

Detection of Erwinia psidii through enrichment in guava leaf extract and double radial immunodiffusion

Ana Cristina O. Teixeira^I; Marisa A.S.V. Ferreira^I; Abi S.A. Marques^II

^IDepartamento de Fitopatologia, Universidade de Brasília, 70.910-900, Brasília, DF, Brasil

^IILaboratório de Quarentena Vegetal, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 70.770-970, Brasília, DF, Brasil

RESUMO

Uma das principais doenças que afetam a produção de goiaba no Brasil é a seca-dos-ponteiros, causada pela bactéria Erwinia psidii, cuja disseminação é favorecida por mudas contaminadas. O desenvolvimento de métodos diagnósticos mais eficazes poderia reduzir a disseminação da bactéria no país. Considerando a necessidade de se disponibilizar um método eficiente e simples para a detecção de E. psidii em material de propagação, foi objetivo desse trabalho produzir antissoros policlonais específicos contra a bactéria e desenvolver um método de detecção utilizando o enriquecimento da população bacteriana em extrato de folhas de goiabeira seguido de imunodifusão radial dupla. Um antissoro foi produzido contra a estirpe tipo da bactéria IBSBF 435 (ICMP 8426, NCPPB 3555), avaliado quanto à eficiência e especificidade e utilizado na determinação dos limiares de detecção da mesma. O antissoro As15-1 reagiu positivamente com todos as estirpes testadas de E. psidii, não reagindo com estirpes de outros gêneros e espécies de bactérias fitopatogênicas e apresentou reação cruzada com dois isolados não patogênicos da flora da goiabeira. O crescimento da população bacteriana no extrato de folhas foi observado após 12 h de incubação a partir de populações iniciais de 10³, 10⁵ e 10⁷ ufc/mL, até 60 h. A partir de 12 h, já foi possível detectar E. psidii por enriquecimento e imunodifusão radial nas amostras com populações iniciais de 10⁷ ufc/mL e a partir de 36 h, detectou-se a bactéria mesmo em amostras com populações iniciais de 10³ ufc/mL. Considerando a possibilidade de falsos positivos, é recomendável associar outros métodos diagnósticos ao método aqui proposto.

Palavras-chave:Psidium guajava, bacteriose da goiabeira, sorologia, diagnóstico.

ABSTRACT

One of the most important diseases affecting guava production in Brazil is bacterial blight, caused by the bacterium Erwinia psidii. Pathogen dissemination often occurs through contaminated propagating plant material. The development of more effective diagnostic methods may reduce pathogen dissemination in the country. Considering the need for a reliable and simple method for detecting the pathogen in plant material, the objectives of this study were to produce E. psdii-specific polyclonal antibodies and to develop a detection method using bacterial population enrichment on guava leaf extracts followed by double radial immunodiffusion. The antiserum was produced against the E. psidii type strain IBSBF 435 (ICMP 8426, NCPPB 3555) and its efficiency, specificity and sensitivity threshold were determined. The antiserum As15-1 was tested with strains of several plant-pathogenic bacteria and reacted positively with all strains of E. psidii, although cross reactions were detected with two non-pathogenic isolates from guava flora. Bacterial multiplication on leaf extracts was observed 12 h after incubation from initial populations of 10³, 10⁵ and 10⁷ ufc/mL, up to 60 h. After 12 h it was already possible to detect E. psidii in samples with starting populations of 10⁷ cfu/mL. After 36 h, the enrichment technique allowed the detection of E. psidii using double radial immunodiffusion in samples with populations as low as 10³ cfu/mL. Considering the possibility of false positives it is desirable to associate other diagnostic methods with the method proposed in this study.

Keywords:Psidium guajava, guava die-back, serology, diagnostic methods.

INTRODUÇÃO

Uma das principais doenças que afetam a produção de goiaba (Psidium guajava L.) no Brasil é a bacteriose causada por Erwinia psidii Rodrigues Neto et al. 1987, conhecida por seca-dos-ponteiros. Esta doença foi relatada, primeiramente, no Estado de São Paulo (Rodrigues Neto et al., 1987) e estudos posteriores sugerem que foi introduzida em outros estados através de mudas contaminadas assintomáticas (Oliveira et al., 2000; Uesugi et al., 2001; Romeiro et al., 2002). A certificação de mudas de goiabeira é baseada na análise subjetiva das plantas quanto ao aparecimento de sintomas. Entretanto, a análise visual não garante a aquisição de mudas livres do patógeno. Mesmo aparentemente sadias, mudas contaminadas apresentarão sintomas, aproximadamente, dois anos após sua instalação no pomar, tempo necessário para o início da frutificação (Gonzaga Neto et al., 2001).

Um dos fatores que favorece a diagnose preventiva, melhorando a sensibilidade na detecção de fitobactérias é o enriquecimento, o qual consiste em promover a multiplicação das células bacterianas presentes numa amostra por incubação em meios de cultura. Schaad et al. (1995) desenvolveram o método denominado Bio-PCR (reação da polimerase em cadeia) para detecção de Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola (Burk.) Gardan et al. 1992, em que as amostras foram cultivadas em meio de cultura antes da PCR. Cano & Estrella (1997) confirmaram a confiabilidade e o poder de detecção desse método, identificando o patógeno em uma semente contaminada misturada a um lote de aproximadamente 4.000 sementes sadias. O mesmo princípio foi aplicado para outras fitobactérias como P. syringae Van Hall 1902, P. savastanoi pv. savastanoi (ex Smith 1908) Gardan et al. 1992 e Acidovorax avenae subsp. citrulli (Schaad et al. 1978) Willems et al. 1992, assim como no estudo de bactérias não fitopatogênicas (Bultreys & Gheysen, 1999; Penyalver et al., 2000; Ghosh et al., 2004).

Os métodos sorológicos permitem a identificação rápida, simples e precisa de microrganismos, e têm como princípio a união de macromoléculas (anticorpo) ao mesmo tipo de indutor de sua produção (antígeno) (Tortora et al., 2003). Diversas técnicas sorológicas são usadas na detecção e identificação de bactérias fitopatogênicas (Singh et al., 2000; Lee et al., 2001; Sahin et al., 2003; Yorinori, et al., 2003; Carneiro Jr. et al., 2004), destacando-se ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), imunofluorescência (IF) e imunodifusão radial dupla (ID).

Apesar da simplicidade e rapidez, imunoensaios apresentam algumas desvantagens como: (a) não distinguem entre células viáveis e não viáveis e por isso não identificam o real perigo de disseminação de determinado patógeno; (b) os limiares de detecção são elevados e (c) amostras contendo alta concentração de contaminantes saprofíticos podem sofrer interferências devido à competição desses com o patógeno alvo (Saettler et al., 1989).

O método de ID (Ouchterlony, 1958) é realizado em gel de agar ou agarose, onde pode ser observada uma linha de precipitação entre os orifícios, caso haja especificidade entre antígeno e anticorpo. Este método foi utilizado para a detecção de fitobactérias, como P. syringae pv. tabaci (Wolf & Foster 1917) Young et al. 1978 (Alvarez & Marques, 2004; Spitali et al., 2007). Estudos preliminares para a detecção de E. psidii através de ID, em mudas assintomáticas de goiabeira, foram realizados por Ribeiro et al. (2005).

Considerando a necessidade de se estabelecer um método eficiente e simples para a detecção de E. psidii, o presente trabalho teve como objetivo produzir um antissoro específico contra esse patógeno e desenvolver um método de detecção por imunodifusão radial dupla, aumentando a sua sensibilidade pelo enriquecimento em meio natural obtido pela maceração de folhas de goiabeira.

MATERIAL E MÉTODOS

Quarenta e sete estirpes de E. psidii foram utilizadas, sendo 16 provenientes da Coleção de Culturas de Fitobactérias do Instituto Biológico de São Paulo (IBSBF); 26 da coleção de trabalho da Unidade de Bacteriologia, Laboratório de Quarentena Vegetal (LQV) da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia e cinco da coleção do Laboratório de Fitopatologia, Departamento de Fitopatologia da Universidade de Brasília (Tabela 1).

Produção e avaliação de antissoro policlonal anti-Erwinia psidii

Um antissoro policlonal foi produzido contra a estirpe tipo de E. psidii, IBSBF 435 (ICMP 8426, NCPPB 3555) e avaliado quanto à sua eficiência e especificidade. Para a produção do antissoro, a bactéria foi cultivada em meio sólido 523 de Kado & Heskett (1970), por 48 h a 28 °C. Dessa cultura, foi preparada a suspensão-antígeno a ± 10⁸ ufc/mL, cuja concentração foi ajustada pela medida da transmitância. Foi injetado 1,0 mL da suspensão bacteriana acima descrita, fixada com formol a 0,5%, emulsificada com 1,0 mL de adjuvante de Freund (15% de Mamide monoleate e 85% de óleo de parafina) em coelhos de três meses, da raça Nova Zelândia. Foram realizadas quatro aplicações intramusculares na coxa posterior do coelho, a intervalos de sete dias entre aplicações. Para a primeira aplicação utilizou-se o adjuvante completo, que contém BCG (vacina, linhagem avirulenta do bacilo da tuberculose), com o intuito de estimular uma resposta mais rápida do sistema imunológico do animal e, para as aplicações seguintes, o adjuvante incompleto, sem BCG.

A sangria na veia marginal da orelha do coelho foi realizada para avaliação do título do antissoro, sete dias após a última injeção, de acordo com protocolo de Ausubel et al. (1999). O antissoro foi diluído em solução salina tampão fosfato (PBS), nas proporções de 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 e 1:64, e avaliado pelo método de imunodifusão radial dupla. Sobre uma lâmina de microscopia, foi preparada camada de agarose a 1% em PBS com azida sódica (1%), com 2 mm de espessura, aproximadamente. Após solidificação foram feitos furos radiais com o auxílio de uma roseta de aço inox. No furo central foram colocados 20 µL da suspensão bacteriana da estirpe tipo a uma concentração maior que 10⁸ ufc/mL e nos furos periféricos foram colocados 20 µL do antissoro produzido (designado As15), na ordem crescente das diluições. As lâminas foram mantidas em câmara úmida por 24 h para se verificar a formação de bandas de precipitação pela reação antígeno-anticorpo.

Após a obtenção do título satisfatório do antissoro, o sangue foi coletado em frasco de vidro (± 40 mL), mantido por uma hora a temperatura ambiente e aquecido a 37ºC por 30 min, após o coágulo ter sido descolado das paredes laterais do frasco. Em seguida, foi mantido sob refrigeração (4ºC) por 12-18 h. Após esse período, o soro foi aspirado e centrifugado a 6.000 g por 15 min, descartando-se o coágulo. O sobrenadante foi colocado em um frasco esterilizado, adicionando-se azida sódica para uma concentração final de 0,025%. Ao antissoro foi acrescentada glicerina na proporção 1:1 e estocado sob refrigeração (4ºC). O material dessa última coleta foi designado As15-1, não sendo misturado ao da primeira coleta (titulação).

A especificidade do antissoro foi determinada frente a 47 estirpes de E. psidii (Tabela 1) e 10 estirpes de outros gêneros e espécies de bactérias fitopatogênicas: Acidovorax avenae subsp. avenae (Emb.A 226-1), A. avenae subsp. citrulli (Aac 1-12), Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (CBCEN 10), Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Emb.A 243-1), Erwinia sp. (Emb.A 12-5, isolada de milho), Pseudomonas syringae pv. tabaci (Emb.C 478), P. syringae pv. tomato (CNPH 45), Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Emb.A 62-6), X. axonopodis pv. sesami (Emb.C 333-1) e X. campestris pv. campestris (Emb.C 481-1). Além disso, testou-se também o antissoro frente a 10 isolados bacterianos saprofíticos da flora natural da goiabeira, obtidos de folhas, pedúnculos de frutos mumificados ou da extremidade dos brotos de goiabeira. Embora não tenham sido identificados, esses isolados não se mostraram patogênicos à goiabeira. Para os ensaios com ID, utilizou-se o método descrito acima, mas posicionando-se o antissoro no orifício central e as suspensões bacterianas nos orifícios periféricos. A estirpe tipo (IBSBF 435) foi regularmente usada como controle positivo e PBS como controle negativo.

Determinação dos limiares de detecção de Erwinia psidii

O enriquecimento bacteriano foi conduzido em extrato de folhas de goiabeira da cv. Paluma. Folhas jovens (1 g), obtidas de mudas sadias mantidas em casa de vegetação, foram acondicionadas em sacos plásticos esterilizados, recebendo 3,5 mL das suspensões bacterianas em diferentes concentrações. As folhas foram levemente esmagadas com pistilo de cerâmica, com o intuito de permitir que a suspensão bacteriana entrasse em contato com o extrato das mesmas. As temperaturas de incubação foram 29 a 31ºC durante o dia e 26 a 27°C durante a noite. Foram realizadas quatro repetições, para cada tratamento, os quais corresponderam às concentrações de inóculo de ± 10⁷, 10⁵ e 10³ ufc/mL. Utilizou-se 250 µL da mistura suspensão bacteriana-extrato de folhas para a diluição seriada e o plaqueamento em meio sólido 523. A estimativa da evolução populacional de E. psidii no extrato das folhas de goiabeira foi realizada durante 60 h, a intervalos de 12 h. Nos mesmos intervalos, o limiar de detecção por imunodifusão radial dupla foi determinado, conforme descrito anteriormente, utilizando-se 20 µL da mistura suspensão-extrato.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Um antissoro policlonal específico para E. psidii foi produzido, usando-se como antígeno a estirpe tipo (IBSBF 435). O título obtido, de 1:16 da concentração original, foi satisfatório para o método de imunodifusão radial dupla (Figura 1A).

Submetido ao teste de especificidade, o antissoro, identificado como As15-1, apresentou reação antígeno-antissoro positiva para a estirpe tipo, assim como para as demais estirpes de E. psidii, previamente identificadas e usadas como referência (Tabela 1). Não houve reação com as estirpes de fitobactérias de outros gêneros, espécies ou patovares testados (Figura 1B). Entretanto, houve reação cruzada com dois isolados saprofíticos da flora bacteriana da goiabeira, indicando a presença de epítopos em comum. As reações cruzadas são freqüentes com antissoros policlonais (Trigalet et al., 1978) e, embora possam produzir resultados falso-positivos, não invalidam o diagnóstico, sobretudo quando mais de uma técnica é usada para um diagnóstico conclusivo.

A ID é um método simples e rápido, mas pouco sensível para uso rotineiro em detecção de fitobactérias, pois é necessária uma concentração elevada da bactéria alvo para que a reação seja visível. Estudos preliminares, utilizando enriquecimento aliado à sorologia para detecção, foram realizados por Ribeiro et al. (2005), quando se verificou que a multiplicação de E. psidii em folhas de goiabeira esmagadas possibilitava sua detecção através de ID. Contudo, a população final detectável não foi quantificada.

As populações bacterianas e os resultados da ID a cada intervalo de 12 h (Tabela 2) e a curva do crescimento bacteriano no extrato das folhas durante 60 h (Figura 2) são apresentadas. Nenhum dos tratamentos apresentou reação sorológica positiva no T0 (tempo zero). A partir de 12 h, já foi possível detectar E. psidii nas amostras com populações iniciais de 10⁷ ufc/mL. Neste tratamento foi observado crescimento bacteriano em todas as repetições, as quais atingiram concentração de 10⁸ ufc/mL, com 25% de resultado positivo para ID. Para os demais tratamentos, após 12 h de incubação, houve crescimento bacteriano, mas não houve detecção por ID. Entretanto, a partir de 36 h, detectou-se a bactéria mesmo nas amostras com populações iniciais de 10³ ufc/mL.

De acordo com os resultados obtidos, se a contaminação de materiais de propagação a serem examinados correspondesse a uma população inicial de E. psidii de 10⁷ ufc/g de tecido, seria possível a detecção da bactéria em 25% das amostras dentro de 12 h e após 36 h seria possível concluir o diagnóstico. Se a contaminação dos materiais fosse de 10⁵ ufc/g de tecido, a detecção da bactéria se daria após 24 h de incubação em 25% dos casos. Com um nível de contaminação de 10³ ufc/g de tecido, as primeiras reações positivas em ID ocorreriam após 36 h.

A concentração da suspensão bacteriana reativa com o anticorpo anti-E. psidii esteve sempre em torno de 10⁸ ufc/g de tecido (75% das reações positivas). Observa-se, entretanto, que em algumas repetições, as suspensões apresentando igual concentração não apresentaram reação positiva em ID, o que evidencia a possível ocorrência de falsos negativos. Por outro lado, houve reação positiva de uma suspensão a 10⁵ ufc/mL após 60 h. Como as técnicas moleculares e sorológicas podem detectar tanto células viáveis quanto não viáveis (Saettler et al., 1989, Theodoro & Maringoni, 2002) é possível que, nesse caso, um certo número de células tivesse perdido a viabilidade.

As divergências observadas para a reação de ID, com suspensões de mesma concentração, podem ser explicadas pela inibição da reação por substâncias presentes no extrato das folhas. O esmagamento de tecidos pode provocar a liberação de substâncias que possuam atividade antimicrobiana, sendo que em folhas de goiabeira há relato de uma atividade moderada contra bactérias gram- negativas (Nair & Chanda, 2007). É possível que, depois de 48 h, houvesse no extrato de folhas, maior concentração de substâncias derivadas da degradação das mesmas, como o quinino, que poderia interferir na reação antígeno-anticorpo.

Pode-se concluir que, independente do nível de contaminação, E. psidii pode ser detectada em material vegetativo de goiabeira no intervalo de 36 a 60 h por ID após enriquecimento, período em que a maioria das populações, foi reativa com o antissoro policlonal produzido contra a bactéria. Entretanto, a possibilidade de falsos positivos deve ser considerada, tendo em vista as reações cruzadas observadas com dois isolados bacterianos da flora da goiabeira. Assim, é recomendável a utilização de mais de um método para confirmação dos resultados. Por outro lado, ao final das 60 h de análise, a porcentagem de detecção por ID permaneceu em torno de 75% em dois dos tratamentos. Nesses casos, acredita-se que um período maior de incubação poderia resultar na detecção da bactéria em 100% das amostras, reduzindo significativamente a ocorrência de falsos negativos.

A disponibilização de um método simples e rápido, que possa ser usado em laboratórios pouco equipados, é vantajosa. O método de enriquecimento bacteriano em extrato de folhas de goiabeira aliado à imunodifusão radial dupla, reúne rapidez e baixo custo. Com o aumento da população pelo enriquecimento, a baixa sensibilidade da ID é contornada, podendo ser utilizada na análise de mudas, caso sejam portadoras de E. psidii em baixas concentrações (10³ ufc/mL). Apesar desse aporte na redução do limiar de detecção da ID, o processo pode ser melhorado pela purificação do antissoro e os falsos negativos podem ser reduzidos pelo uso concomitante de outros métodos para diagnose, além de modificações no preparo do extrato de folhas, visando reduzir a ação de possíveis inibidores.

Os resultados obtidos no presente estudo poderão ser utilizados por técnicos da Defesa Vegetal para a certificação de viveiros. Isto contribuiria, certamente, para a redução da disseminação da bactéria para novos pomares, outros estados ou regiões produtores de goiaba no Brasil, como a região Nordeste que, até o momento, encontra-se livre da doença. Da mesma forma, o desenvolvimento de outras ferramentas, tais como as moleculares, contribuirão para maior eficiência da diagnose precoce da seca-dos-ponteiros.

AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq pelo apoio financeiro e concessão da bolsa de Mestrado à primeira autora; a Joanice P.S. Damasceno e Alexandre P. Mendes, do Laboratório de Quarentena Vegetal da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia por sua valiosa colaboração na execução dos experimentos; ao Dr. Júlio Rodrigues Neto, curador da Coleção de Culturas de Fitobactérias do Instituto Biológico de São Paulo (IBSBF) e ao Professor Carlos H. Uesugi, do Departamento de Fitopatologia da UnB, pela cessão das estirpes; ao Paulo Augusto C. Marinho e Wesley R. Souza, pela edição das imagens.

Recebido 18 Agosto 2007

Aceito 14 Maio 2008

Autor para correspondência: Marisa A.S.V. Ferreira, e-mail: [e-mail]

Parte da Dissertação de Mestrado da primeira autora. Universidade de Brasília. Brasília DF. 2006.

TPP 7089

Editor Associado: Valmir Duarte

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  23 Jul 2008
• Data do Fascículo
  Jun 2008

Histórico

• Recebido
  18 Ago 2007
• Aceito
  14 Maio 2008