Variabilidade do gene da proteína capsidial de três espécies virais que infectam videiras no Brasil

Coat protein gene variability of three viral species infecting grapevines in Brazil

ARTIGO RESEARCH ARTICLE

Variabilidade do gene da proteína capsidial de três espécies virais que infectam videiras no Brasil

Coat protein gene variability of three viral species infecting grapevines in Brazil

Paula Radaelli^I; Thor V.M. Fajardo^II; Osmar Nickel^II; Marcelo Eiras^III; Gilvan Pio-Ribeiro^I

^IDepartamento de Agronomia Universidade Federal Rural de Pernambuco, 52171-900, Recife, PE, Brasil

^IIEmbrapa Uva e Vinho, 95700-000, Bento Gonçalves, RS, Brasil

^IIIInstituto Biológico, Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Vegetal, 04014-002, São Paulo, SP, Brasil

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi avaliar a variabilidade de três vírus (Rupestris stem pitting-associated virus - RSPaV, Grapevine leafroll-associated virus 2 - GLRaV-2 e Grapevine fanleaf virus - GFLV) que infectam videiras no Brasil, através da caracterização molecular do gene da proteína capsidial (CP). Foram amplificados fragmentos que compreendem os genes completos da CP de nove isolados de RSPaV (780 pb), seis de GLRaV-2 (597 pb) e três de GFLV (1515 pb) por RT-PCR, utilizando-se oligonucleotídeos específicos para cada espécie viral. Os DNAs amplificados foram clonados e sequenciados. Os isolados de RSPaV foram reunidos em quatro grupos pela análise filogenética das sequências obtidas com valores de identidade de nucleotídeos (nt) que variaram de 81 a 99%. Para GLRaV-2, dois grupos foram definidos a partir das sequências de nt, com valores de identidade que variaram de 88 a 99% e, para GFLV, foram definidos dois grupos, com valores de identidade de nt que variaram de 89 a 98%. Os diferentes isolados das três espécies virais estudadas também foram detectados utilizando-se hibridização com sondas não-radioativas, marcadas com digoxigenina, possibilitando identificar de forma inequívoca as amostras infectadas, independentemente dos isolados virais empregados para síntese das sondas.

Palavras-chave: RSPaV, GLRaV-2, GFLV, RT-PCR, Vitis spp., sonda não-radioativa.

ABSTRACT

The purpose of this study was to evaluate the variability of three viruses (Rupestris stem pitting-associated virus - RSPaV, Grapevine leafroll-associated virus 2 - GLRaV-2 and Grapevine fanleaf virus - GFLV) infecting grapevines in Brazil, through molecular characterization of the coat protein (CP) gene. DNA fragments were amplified comprising the complete CP genes of nine isolates of RSPaV (780 bp), six of GLRaV-2 (597 bp) and three of GFLV (1515 bp) by RT-PCR, using specific primers for each viral species. The amplified DNA fragments were cloned and sequenced. RSPaV isolates were clustered into four groups by phylogenetic analysis of the nucleotide (nt) sequences of the CP gene, showing identity values ranging from 81 to 99%. For GLRaV-2, two groups were defined from nt sequences, with identity values ranging from 88 to 99% and for GFLV, two groups were defined with identity values ranging from 89 to 98%. The isolates of each viral species studied here were detected by non-radioactive probes labeled with digoxigenin, allowing unambiguous identification of infected samples, independent of the isolate used as template for probe synthesis.

Keywords: RSPaV, GLRaV-2, GFLV, RT-PCR, Vitis spp., non-radioactive probes.

INTRODUÇÃO

No Brasil, dentre as doenças virais da videira (Vitis spp.), as caneluras do tronco, o enrolamento da folha e a degenerescência apresentam-se como aquelas de maior relevância, seja pela expressiva incidência ou pelos danos que causam (Fajardo et al., 2003). "Rupestris stem pitting - RSP", doença conhecida por "caneluras do tronco de Rupestris", faz parte do complexo viral do "lenho rugoso da videira", e caracteriza-se por induzir alterações no lenho das videiras, com reflexos negativos na qualidade dos frutos e na produção (Martelli, 1993; Credi, 1997). O Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV), família Flexiviridae, gênero Foveavirus, agente causal das caneluras do tronco de Rupestris, possui partículas alongadas e flexuosas com cerca de 800 x 12 nm, CP de 28 kDa e genoma de RNA de fita simples e senso positivo com 8726 nucleotídeos (nt), organizado em cinco ORFs. A ORF5 (nt 7770 a 8549) codifica o gene CP (Meng et al., 1998; Zhang et al., 1998; Fauquet et al., 2005).

Infecções mistas com outros vírus são comumente detectadas em videira, o que dificulta a definição das propriedades biológicas das diferentes variantes deste vírus (Meng et al. 1999, Meng et al., 2005b). Recentemente, Nakaune et al. (2008) enfatizaram a diversidade viral associada ao lenho rugoso, destacando a importância de estudos de variabilidade genética por meio de análises de sequência de isolados de RSPaV.

O enrolamento da folha da videira (agente causal: Grapevine leafroll-associated virus, GLRaV) é mundialmente uma das mais importantes doenças virais da cultura, causando, em V. vinifera L., declínio, enrolamento e alteração de cor das folhas, com reduções da produção e da qualidade das bagas. Podem estar envolvidas no complexo viral causador desta doença até nove espécies (GLRaV-1 a -9), destacando-se, pela incidência e danos que ocasionam, as espécies GLRaV-1 e GLRaV-3 (família Closteroviridae, gênero Ampelovirus) e GLRaV-2, a única espécie do complexo classificada na família Closteroviridae, gênero Closterovirus (Fajardo et al., 2003; Fauquet et al., 2005). O GLRaV-2 também se destaca pelos sintomas específicos que pode induzir, pois está associado aos sintomas de incompatibilidade da enxertia e de declínio em vinhedos jovens (Abou Ghanem-Sabanadzovic et al., 2000; Martelli et al., 2002; Bertazzon & Angelini, 2004; Meng et al., 2005a). O GLRaV-2 possui partículas alongadas e flexuosas, genoma de RNA de fita simples e senso positivo com 16.494 nt e oito ORFs. A ORF6 codifica a CP (22 kDa) (Abou-Ghanem et al., 1998; Meng et al., 2005a; Beuve et al., 2007).

Embora diversos isolados de GLRaV-2 e algumas variantes biológicas deste vírus tenham sido identificadas em diferentes genótipos de videira, ainda há carência de trabalhos de caracterização molecular mais abrangentes, o que limita a definição de oligonucleotídeos mais apropriados ao diagnóstico (Beuve et al., 2007). Os dois primeiros isolados sequenciados de GLRaV-2, das cultivares Pinot Noir e Semillon, foram obtidos nos EUA e exibiram grande variabilidade molecular em relação ao isolado "H4" deste vírus (Meng et al., 2005a).

A degenerescência da videira, causada pelo Grapevine fanleaf virus (GFLV), ocorre em praticamente todos os países vitícolas causando danos consideráveis (Pearson & Goheen, 1988). No Brasil, a incidência desta doença é restrita, se comparada às duas viroses anteriormente mencionadas (Kuniyuki et al., 1994). O GFLV, família Comoviridae, gênero Nepovirus, possui partículas isométricas de 30 nm de diâmetro, o genoma viral é composto por dois RNAs de fita simples e senso positivo, que são encapsulados em partículas distintas. A CP, de 54 kDa, é codificada pelo RNA 2.

A transmissão dessas três espécies virais ocorre através da enxertia utilizando-se gemas infectadas, enquanto a dispersão das viroses se dá por meio de material propagativo infectado. Apenas o GFLV apresenta transmissão por vetores (nematóides) (Pearson & Goheen, 1988).

A alta variabilidade genética de espécies virais dificulta a obtenção de ferramentas moleculares universais de detecção e identificação. Já se demonstrou que a indexação por RT-PCR de videiras infectadas com determinado isolado viral, utilizando-se oligonucleotídeos específicos para outro isolado, pode resultar em falso-negativo (Bertazzon & Angelini, 2004). Tais resultados servem para ressaltar a importância do estudo da variabilidade viral visando-se à implementação de técnicas mais sensíveis e precisas para a detecção, a exemplo do uso da hibridização molecular (sondas) e da RT-PCR. O objetivo deste trabalho foi estudar a variabilidade dessas três espécies virais (RSPaV, GLRaV-2 e GFLV) no Brasil, por meio da caracterização molecular do gene CP.

MATERIAL E MÉTODOS

Isolados virais

Os nove isolados virais de RSPaV foram obtidos de diferentes videiras mantidas em casa de vegetação na Embrapa Uva e Vinho (Bento Gonçalves, RS), sendo que os isolados CF195 e CF195-2 são provenientes da mesma planta. Os seis isolados de GLRaV-2 e dois de GFLV (RUP e IAC) foram obtidos de plantas cedidas pelo Dr. Hugo Kuniyuki (IAC-Campinas, SP). O terceiro isolado de GFLV (RS) foi obtido de material mantido em videiras em casa de vegetação na Embrapa Uva e Vinho. A relação de todos os isolados utilizados neste trabalho encontra-se na Tabela 1. É possível que as plantas-fonte dos isolados estudados estivessem infectadas com outras espécies virais que infectam a videira, porém isto não foi analisado.

Extração de RNA total

A extração de RNA total, a partir de 100 mg de fragmentos de lenho ou de nervuras e pecíolos de folhas maduras de videiras infectadas com RSPaV ou GLRaV-2 e folhas de brotações novas para GFLV, foi realizada utilizando-se o kit "RNeasy Plant Mini" (Qiagen), triturando-se o tecido vegetal em nitrogênio líquido e seguindo as instruções do fabricante, ou pelo método de adsorção em sílica (Rott & Jelkmann, 2001).

Síntese do cDNA e RT-PCR

Procedeu-se à síntese do cDNA viral e às reações de PCR conforme descrito por Fajardo et al. (2000). Os oligonucleotídeos empregados na RT-PCR encontram-se descritos na Tabela 2. Para o isolado 420A de RSPaV foram utilizados os oligonucleotídeos RSP52/RSP53 e para os demais isolados os oligonucleotídeos RSPaV-V1/RSPaV-C1. Para as amplificações do gene CP completo do GFLV foram utilizados dois pares de oligonucleotídeos com sobreposição parcial de sequências de nt nos fragmentos amplificados (Tabela 2). As reações de PCR foram submetidas a 35 ciclos de amplificação, consistindo de desnaturação (94ºC/50 s), pareamento (50ºC/50 s) e extensão (72ºC/1 min). Os produtos das amplificações foram analisados em géis de agarose 1,2%, preparados em tampão TBE, pH 8,0. Os fragmentos de DNA de tamanho esperado foram eluídos utilizando-se o kit "Perfectprep Gel Cleanup" (Eppendorf), de acordo com as especificações do fabricante.

Clonagem, seleção de clones recombinantes e análise das sequências

Os fragmentos de DNA foram ligados aos vetores pGEM-T Easy (Promega) para RSPaV e GFLV e pCR 2.1 (Invitrogen) para GLRaV-2, de acordo com as instruções dos respectivos fabricantes. As reações de ligação foram utilizadas na transformação, por choque térmico, de células competentes de Escherichia coli DH5α ou TOP10. O DNA plasmidial das colônias bacterianas transformadas foi extraído utilizando-se o kit "Flexi Prep" (Amersham Biosciences) e a confirmação da presença dos fragmentos correspondentes aos genes das CPs virais, nos plasmídeos recombinantes, foi realizada por digestão com a enzima de restrição EcoRI. O sequenciamento automático de nt resultou na obtenção das sequências completas dos genes CP dos isolados virais estudados.

As sequências de nt foram alinhadas com o auxílio do programa Clustal X 1.8. As comparações com outras sequências (nt e aminoácidos deduzidos) do GenBank foram obtidas utilizando-se o programa BLASTn do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Os alinhamentos múltiplos e as inferências filogenéticas foram realizados para as sequências completas de nt do gene CP de cada vírus (RSPaV, GLRaV-2 e GFLV) utilizando o programa Mega 4.1 (Tamura et al., 2007). Foram incluídas nas análises as sequências do gene CP de isolados estrangeiros depositadas no banco de dados GenBank e que apresentaram maiores identidades de nucleotídeos com os isolados estudados, as sequências do gene CP do isolado tipo de cada espécie viral e, para os grupos externos das árvores, foram utilizadas as espécies tipo de cada gênero: Apple stem pitting virus (ASPV, Foveavirus), Beet yellows virus (BYV, Closterovirus) e Tobacco ringspot virus (TRSV, Nepovirus). As árvores foram obtidas por meio de análise de máxima parcimônia e "bootstrap"com 2000 replicações.

Sondas não-radioativas

Na síntese das sondas utilizou-se o kit "DIG DNA Labeling" (Roche), seguindo-se as recomendações do fabricante, e usando-se como molde o gene CP de cada vírus, obtido pela digestão dos plasmídeos recombinantes com EcoRI ou pela amplificação dos genes CP, presentes nestes plasmídeos. Para RSPaV foram produzidas sondas a partir da marcação dos genes CP dos isolados CF210, MG e MH; para GLRaV-2 utilizaram-se sondas marcadas dos isolados M/C e L/I; e para GFLV foi marcado o gene CP do isolado RS. Como controle positivo foi usado DNA correspondente ao gene CP dos vírus detectados e, como controle negativo, RNA total extraído de videiras comprovadamente sadias.

Para a hibridização "dot-blot", os RNAs totais (10-40 µL) foram aplicados em membrana de náilon (Roche) com auxílio do aparelho "Bio-dot" (BioRad) e fixados à membrana durante 2 h a 80ºC. A pré-hibridização foi conduzida a 68ºC por 2 h em solução padrão contendo SDS 0,02%, reagente bloqueador 1% (Roche), SSC 5X (SSC 1X = citrato de sódio 0,03 M pH 7,0, NaCl 0,3 M) e N-lauroylsarcosina 0,1%. Em seguida procedeu-se às hibridizações a 68ºC por 15 h com as respectivas sondas para a detecção de cada vírus, previamente desnaturadas (15 min a 95ºC) e diluídas em solução de pré-hibridização. Seguiram-se as lavagens com SSC 2X contendo SDS 0,1% (2x por 5 min/temperatura ambiente), SSC 0,1X com SDS 0,1% (2x por 15 min/68ºC) e com tampão maléico (ácido maléico 0,1 M, NaCl 0,15M, pH 7,5) contendo Tween-20 a 0,3% (1x por 10 min/temperatura ambiente). As membranas foram bloqueadas por uma hora a temperatura ambiente em tampão maléico com reagente bloqueador a 1% (Roche). À solução bloqueadora foi acrescido anticorpo anti-digoxigenina conjugado à fosfatase alcalina (Roche), incubando-se por 30 min a temperatura ambiente. Duas lavagens foram realizadas com tampão maléico acrescido de Tween-20 a 0,3% por 15 min e uma lavagem com tampão Tris-HCl 0,1M pH 9,5, NaCl 0,1M por 5 min. A revelação foi realizada com a adição de substrato quimioluminescente CDP-Star (Roche) sobre a membrana e posterior exposição da mesma a um filme de raio X por 20 min.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

RSPaV

Nas reações de RT-PCR foram utilizados os oligonucleotídeos RSPaV-V1/RSPaV-C1, desenhados com base no acesso NC_001948 de RSPaV (GenBank), ou RSP52/RSP53, possibilitando a amplificação do gene CP completo do RSPaV, com 780 pb (nt 7771 ao 8550 do acesso NC_001948) e 259 aminoácidos deduzidos (aad) a partir de todos os nove isolados. Através da análise da identidade de nt desses isolados de RSPaV, pôde-se verificar a formação de quatro agrupamentos distintos, à semelhança de outros trabalhos (Lima et al. 2006; Meng et al., 2006; Nolasco et al., 2006; Nakaune et al. 2008). Os isolados CF208, CF210, MG, MH, 420A e CF195-2 do grupo I (Figura 1A) apresentam identidade de nt, entre si, de 97 a 99% (Tabela 3). Os grupos II, III e IV contém, respectivamente, os isolados CF207, PN e CF195 (Figura 1A). O grupo I apresentou identidade de nt de cerca de 95-96%, 92-93% e 81%, respectivamente, com os grupos II, III e IV. Por sua vez, o grupo II apresentou 92% de identidade com o grupo III e 84% com o grupo IV. Por último, o grupo III mostrou, aproximadamente, 81% de identidade de nt com o grupo IV (Tabela 3).

 

Nolasco et al. (2006), em Portugal, ao analisar isolados de RSPaV obtiveram quatro grupos (1, 2a, 2b e 3), com base na sequência do gene CP, concluindo que os isolados estudados apresentaram grande variabilidade. A menor identidade de nt encontrada foi de 81%. Meng et al. (2006), nos Estados Unidos, através da análise de parte do gene CP de 24 isolados de RSPaV, dividiram tais isolados em quatro grupos (I, II, III e IV). A análise filogenética do gene CP de 65 isolados japoneses de RSPaV por Nakaune et al. (2008) também permitiu a obtenção de quatro grupos (1, 2a, 2b e 3), demonstrando que este vírus apresenta expressiva variabilidade. Os isolados pertencentes ao grupo 3 apresentaram maior divergência, com identidade na sequência de nt de 87,4% quando comparados a outros isolados. Destaca-se que os agrupamentos definidos nestes trabalhos não são baseados em critérios únicos e pré-definidos, como nomenclatura e porcentagem de identidade. No presente trabalho verificou-se a existência de significativa variabilidade entre os isolados de RSPaV estudados (Tabela 3), confirmando resultados semelhantes dos trabalhos anteriormente mencionados.

Em relação aos valores de identidade de aad dos isolados de RSPaV estudados, também foram definidos quatro agrupamentos, formados pelos mesmos isolados da definição baseada na identidade de nt. O grupo I apresentou identidade de aad, entre seus membros de 94 a 99%, e de cerca de 95-98%, 92-94% e 89-91%, respectivamente, com os grupos II, III e IV. Por sua vez, o grupo II apresentou cerca de 93% de identidade com os grupos III e IV e, por último, o grupo III apresentou 88% de identidade com o grupo IV (Tabela 3).

Observou-se elevada porcentagem de identidade nas sequências de nt e de aad entre todos os isolados de RSPaV deste estudo e isolados de RSPaV depositados em banco de dados, inclusive em relação àqueles mais divergentes (Figura 1A). Os isolados estudados do grupo I apresentaram maiores identidades de sequência de aad (96,9% a 99,2%) com os isolados B10-3, E156 e dois isolados provenientes dos EUA (RSPaV-EUA1, RSPaV-EUA2). Os isolados CF207 (grupo II), PN (grupo III) e CF195 (grupo IV) apresentaram maiores identidades de aad com os isolados VER84SH (98,8%), M31-35 (95,3%) e PGD2 (98%), respectivamente.

GLRaV-2

Amplificou-se, para os seis isolados, um fragmento de DNA que compreende o gene CP completo do GLRaV-2, com 597 nt e 198 aad, situados entre os nt 14579 e 15175 do acesso NC_007448. Pela análise das sequências de nt obtidas, pôde-se verificar a formação de dois agrupamentos, grupo I compreendendo os isolados L/I, SE e IT com identidade de nt de 98-99% entre seus membros, e o grupo II, formado pelos isolados M/C, MH e RI (Figura 1B) com identidade de nt entre seus membros de 98%. A identidade de nt entre os isolados dos dois grupos é de 87-89% (Tabela 3). Em relação às sequências de aad dos isolados de GLRaV-2 também foram definidos dois agrupamentos (I e II), formados pelos mesmos isolados mencionados acima, que apresentaram cerca de 97-99% e 90-95% de identidade de sequência de aad, respectivamente, dentre e entre os membros dos grupos (Tabela 3).

Observou-se elevada porcentagem de identidade de sequências de nt e de aad entre os seis isolados de GLRaV-2 estudados e isolados depositados em banco de dados (Figura 1B). Os membros do grupo II de GLRaV-2 apresentaram identidades de sequência de aad que variam de 94 a 96% com um isolado italiano (H4). Abou Ghanem-Sabanadzovic et al. (2000) descreveram que o isolado H4 é uma variante biológica do GLRaV-2, distinto de outros isolados transmitidos mecanicamente do mesmo vírus, devido a diferenças nas reações em hospedeiras herbáceas e diferença na sequência do gene CP. Ao contrário de outro isolado de GLRaV-2, Semillon (Sem), o isolado H4 induz lesões locais necróticas em Nicotiana clevelandii, além de infecção sistêmica e, em N. occidentalis, induz sintomas mais severos. O isolado H4 diferiu em aproximadamente 12% na sequência de nt do gene CP em relação aos isolados Sem e Pinot Noir (PN) (Abou Ghanem-Sabanadzovic et al., 2000). Já os isolados estudados do grupo I apresentaram maiores identidades de nt e de aad (97,9% a 99,4%) com os isolados Pinot Noir, GLRaV2-Italia, SL10 e Shandong (Figura 1B).

Meng et al. (2005a) mostraram que um isolado americano ("94/979") apresentou 99% de identidade de nt com os isolados PN e Sem, sugerindo que esses três isolados são idênticos e formariam um grupo. O segundo isolado ("93/955") caracterizado por estes autores diferiu em 7,4% de nt quando comparado ao isolado "PN" e 11,1% com o isolado "H4" e formaria assim outro grupo, conforme corroborado pelos resultados apresentados na Figura 1B.

GFLV

Foram amplificados dois fragmentos de DNA para cada um dos três isolados, com sobreposição entre eles de 20 nt, resultando na sequência completa do gene CP (1515 nt e 504 aad). O gene CP está situado na extremidade 3' do RNA 2, entre os nt 2048 e 3559 do acesso NC_003623. Na análise das sequências de nt e de aad observou-se a formação de dois agrupamentos (Tabela 3, Figura 1C). O grupo I é formado pelos isolados RS e RUP, que apresentam, entre si, cerca de 98 e 99% de identidade de nt e de aad, respectivamente, e o grupo II é composto pelo isolado IAC. A identidade de nt e aad verificada entre os membros dos dois grupos foi de 89-90% e de 94-95%, respectivamente (Tabela 3). Observou-se alta porcentagem de identidade de sequências de nt e de aad entre os isolados de GFLV estudados e isolados depositados em banco de dados (Figura 1C). Destaca-se que os dois isolados do grupo I (RS e RUP) apresentaram maiores valores de identidade de aad (cerca de 96%) com os isolados italiano (SG1) e francês (F13).

Pourrahim et al. (2007) conduziram estudo de variabilidade de cinco isolados iranianos de GFLV, que apresentaram, entre si, 98,7 a 100% de identidade de nt. Entretanto, na comparação com outros isolados, a identidade variou de 83,7 a 87,5% (este último valor resultante da comparação com o isolado italiano SG1), agrupando-se os isolados iranianos separadamente de isolados de outras origens geográficas. Pompe-Novak et al. (2007) estudaram a diversidade genética presente no RNA2 de nove isolados de GFLV da Eslovênia. As sequências destes isolados e de outros sete (seis franceses e um alemão) resultaram na definição de três grupos, com valores de identidade de 87-91% de nt e 93-96% de sequência de aad. Neste trabalho, os isolados Vo154 (Eslovênia), A6e e F13 (França) apresentaram maiores identidades de aad (cerca de 96%) com o isolado IAC (grupo II).

A detecção por RT-PCR de diferentes isolados virais com a utilização de apenas um par de oligonucleotídeos por espécie viral (dois, no caso do GFLV, para cobrir a amplificação de todo o gene CP e outra exceção para o isolado 420A), provavelmente foi possível em função da condição pouco restritiva (baixa temperatura de pareamento) nas reações de amplificação. A definição da variabilidade existente entre isolados locais de três espécies virais permite a definição de "ferramentas" (ex. sequências de oligonucleotídeos, regiões do genoma viral mais ou menos conservadas) para a posterior implementação de métodos diagnósticos mais precisos e sensíveis.

Hibridização molecular com sondas não-radioativas

Nos testes de hibridização "dot-blot" foram utilizadas sondas homólogas e heterólogas (entre isolados diferentes), visando-se à detecção das três espécies virais estudadas. Foi possível detectar todos os isolados virais caracterizados, com evidente contraste das reações entre amostras infectadas e sadias (Figura 2). As sondas para RSPaV, sintetizadas pela marcação dos isolados CF210, MG e MH (todos do grupo I), resultaram na hibridização de todos os nove isolados de RSPaV (Figura 2A). Isto comprova a eficiência da hibridização, conduzida em condição de baixa estringência, permitindo a detecção mesmo daqueles isolados de RSPaV que apresentaram baixa porcentagem de identidade (cerca de 81% de identidade de nt com os demais), a exemplo do isolado CF195 (Tabela 3, Figura 2A).

Para GLRaV-2, as sondas marcadas a partir dos isolados L/I (grupo I) e M/C (grupo II) permitiram a detecção de todos os seis isolados de GLRaV-2 caracterizados (Figura 2B), independente dos valores de identidade verificados entre os isolados ou do grupo no qual o isolado foi enquadrado (Figura 1B). Por último, resultado semelhante foi verificado em relação ao GFLV. A sonda foi obtida pela marcação do isolado RS (grupo I) e permitiu a detecção dos três isolados caracterizados, incluindo o isolado IAC (grupo II) (Figura 2C).

Percebe-se pelos resultados obtidos que a hibridização com sonda não-radioativa pode viabilizar a detecção de diferentes isolados virais em videira de modo eficiente e sensível, tanto em reações homólogas como heterólogas, constituindo-se também em um método de diagnóstico aplicável para um número maior de amostras. Essa versatilidade e sensibilidade das sondas não-radioativas também foi demonstrada por Moreira et al. (2005) para a detecção do Grapevine virus A (GVA) e do Grapevine virus B (GVB) em videiras.

AGRADECIMENTOS

Ao Dr. Hugo Kuniyuki, Instituto Agronômico de Campinas - IAC, pelo envio das amostras infectadas com GLRaV-2 e dos isolados de GFLV caracterizados e a Marcos Fernando Vanni (Embrapa Uva e Vinho) pelo apoio laboratorial. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq pela concessão da bolsa de estudos à primeira autora.

Recebido 23 Abril 2009

Aceito 25 Setembro 2009

Autor para correspondência: Thor V.M. Fajardo, e-mail: [e-mail]

Editor de Seção: F. Murilo Zerbini

Parte da Tese de Doutorado da primeira autora. Universidade Federal Rural de Pernambuco. Recife PE. 2009.

• Abou-Ghanem N, Sabanadzovic S, Minafra A, Saldarelli P, Martelli GP (1998) Some properties of Grapevine leafroll-associated virus 2 and molecular organization of the 3' region of the viral genome. Journal of Plant Pathology 80:37-46.
• Abou Ghanem-Sabanadzovic N, Sabanadzovic S, Castellano MA, Boscia D, Martelli GP (2000) Properties of a new isolate of Grapevine leafroll-associated virus 2. Vitis 39:119-121.
• Bertazzon N, Angelini E (2004) Advances in the detection of Grapevine leafroll-associated virus 2 variants. Journal of Plant Pathology 86:283-290.
• Beuve M, Sempé L, Lemaire O (2007) A sensitive one-step real-time RT-PCR method for detecting Grapevine leafroll-associated virus 2 variants in grapevine. Journal of Virological Methods 141:117-124.
• Brandt S, Ibl M, Himmler G (1995) Coat protein gene sequence of an Austrian isolate of Grapevine fanleaf virus Archives of Virology 140:157-164.
• Credi R (1997) Characterization of grapevine rugose wood disease sources from Italy. Plant Disease 82:1288-1292.
• Fajardo TVM, Kuhn GB, Eiras M, Nickel O (2000) Caracterização parcial de um isolado do Grapevine fanleaf virus Fitopatologia Brasileira 25:505-511.
• Fajardo TVM, Kuhn GB, Nickel O (2003) Doenças virais. In: Fajardo TVM (Ed.) Uva para processamento: fitossanidade - Frutas do Brasil 35. Brasília. Embrapa Informação Tecnológica. pp. 45-62.
• Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U, Ball AL (Eds.) (2005) Virus Taxonomy. Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. London. Elsevier Academic Press.
• Kuniyuki H, Vega J, Martins FP, Costa AS (1994) Mosaico da videira Traviú, uma doença causada pelo vírus da folha em leque em São Paulo. Fitopatologia Brasileira 19:224-230.
• Lima MF, Alkowni R, Uyemoto JK, Golino D, Osman F, Rowhani A (2006) Molecular analysis of a California strain of Rupestris stem pitting-associated virus isolated from declining Syrah grapevines. Archives of Virology 151:1889-1894.
• Martelli GP (1993) Rugose wood complex. In: Martelli GP (Ed.) Graft-transmissible disease of grapevines - Handbook for detection and diagnosis. Rome. FAO. pp. 45-53.
• Martelli GP, Agranovsky AA, Bar-Joseph M, Boscia D, Candresse T, Coutts RHA, Dolja VV, Falk BW, Gonsalves D, Jelkmann W, Karasev AV, Minafra A, Namba S, Vetten HJ, Wisler GC, Yoshikawa N (2002) The family Closteroviridae revised. Archives of Virology 147:2039-2044.
• Meng B, Pang SZ, Forsline PL, McFerson JR, Gonsalves D (1998) Nucleotide sequence and genome structure of Grapevine rupestris stem pitting associated virus-1 reveal similarities to Apple stem pitting virus Journal of General Virology 79:2059-2069.
• Meng B, Johnson R, Peressini S, Forsline PL, Gonsalves D (1999) Rupestris stem pitting associated virus-1 is consistently detected in grapevines that are infected with rupestris stem pitting. European Journal of Plant Pathology 105:191-199.
• Meng B, Lin C, Goszczynski DE, Gonsalves D (2005a) Genome sequences and structures of two biologically distinct strains of Grapevine leafroll-associated virus 2 and sequence analysis. Virus Genes 31:31-41.
• Meng B, Lin C, Wang W, Goszczynski D, Gonsalves D (2005b) Complete genome sequences of two new variants of Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and comparative analyses. Journal of General Virology 86:1555-1560.
• Meng B, Rebelo AR, Fisher H (2006) Genetic diversity analyses of Grapevine rupestris stem pitting-associated virus reveal distinct population structures in scion versus rootstock varieties. Journal of General Virology 87:1725-1733.
• Moreira AE, Gaspar OJ, Kuniyuki H (2005) Detecção do Grapevine virus A e Grapevine virus B por hibridização "dot-blot" com sondas moleculares não radioativas. Fitopatologia Brasileira 30:538-542.
• Nakaune R, Inoue K, Nasu H, Kakogawa K, Nitta H, Imada J, Nakano M (2008) Detection of viruses associated with rugose wood in Japanese grapevines and analysis of genomic variability of Rupestris stem pitting-associated virus Journal of General Plant Pathology 74:156-163.
• Nolasco G, Santos C, Petrovic N, Santos MT, Cortez I, Fonseca F, Boben J, Nazaré Pereira AM, Sequeira O (2006) Rupestris stem pitting-associated virus isolates are composed by mixtures of genomic variants which share a highly conserved coat protein. Archives of Virology 151:83-96.
• Pearson RC, Goheen AC (Eds.) (1988) Compendium of grape diseases. St. Paul MN. APS Press.
• Pompe-Novak M, Gutierrez-Aguirre I, Vojvoda J, Bias M, Tomazic I, Vigne E, Fuchs M, Ravnikar M, Petrovic N (2007) Genetic variability within RNA2 of Grapevine fanleaf virus European Journal of Plant Pathology 117:307-312.
• Pourrahim R, Farzadfar SH, Golnaraghi AR, Ahoonmanesh A (2007) Partial molecular characterization of some Grapevine fanleaf virus isolates from North-East of Iran. Journal of Phytopathology 155:754-757.
• Rott ME, Jelkmann W (2001) Characterization and detection of several filamentous viruses of cherry: Adaptation of an alternative cloning method (DOP-PCR) and modification of an RNA extraction protocol. European Journal of Plant Pathology 107:411-420.
• Rowhani A, Chay C, Golino DA, Falk BW (1993) Development of a polymerase chain reaction technique for the detection of Grapevine fanleaf virus in grapevine tissue. Phytopathology 83:749-753.
• Rowhani A, Zhang YP, Chin J, Minafra A, Golino, DA, Uyemoto JK (2000) Grapevine rupestris stem pitting associated virus: population diversity, titer in the host and possible transmission vector. Extended Abstracts, 13^th Meeting of the International Council for the Study of Virus and Virus-like Diseases of the Grapevine: Adelaide, Australia, pp. 37-38.
• Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24:1596-1599.
• Vigne E, Komar V, Fuchs M (2004) Field safety assessment of recombination in transgenic grapevines expressing the coat protein gene of Grapevine fanleaf virus Transgenic Research 13:165-179.
• Zhang YP, Uyemoto JK, Golino DA, Rowhani A (1998) Nucleotide sequence and RT-PCR detection of a virus associated with Grapevine rupestris stem-pitting disease. Phytopathology 88:1231-1237.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  05 Jan 2010
• Data do Fascículo
  Out 2009

Histórico

• Aceito
  25 Set 2009
• Recebido
  23 Abr 2009