Aspectos histopatológicos da interação Phytophthora palmivora com a pupunheira

Histopathology of the interaction Phytophthora palmivora and pejibaye palm

COMUNICAÇÃO SHORT COMMUNICATION

Aspectos histopatológicos da interação Phytophthora palmivora com a pupunheira

Histopathology of the interaction Phytophthora palmivora and pejibaye palm

Aline Brito Vaz^I; Edna Dora Martins Newman Luz^II; Stela Dalva Vieira Midlej Silva^II; Marival Lopes Oliveira^II

^IDepartamento de Ciências Agrárias e Ambientais – DCAA, Universidade Estadual de Santa Cruz - UESC, 45650-000, Ilhéus, BA, Brasil

^IISeção de Fitopatologia, Comissão Executiva da Lavoura Cacaueira – CEPLAC, 45650-000, Ilhéus, BA, Brasil

RESUMO

Visando estudar a interação Phytophthora palmivora x pupunheira (Bactris gasipaes Kunt.), foram efetuados cortes histológicos nos locais onde plântulas, com seis meses de idade, foram inoculadas na base do estipe, para serem examinados ao microscópio eletrônico de varredura (MEV). Os métodos de inoculação utilizados foram: i. Inoculação com gotas (5µL) de uma suspensão de 1 x 10⁶ zoósporos/mL; ii. Irrigação com 5 mL da suspensão de 1 x 10⁶ zoósporos/mL; e iii. Inoculação com discos de micélio de 0,7 cm de diâmetro. Os cortes foram realizados 6 e 12 horas após a inoculação seguindo-se as etapas de fixação, desidratação e metalização para a preparação do material para MEV. Zoósporos encistados e esporângios aderidos à epiderme das plantas foram observados 6 e 12 horas após a inoculação, com a fase de pré-infecção ocorrendo anteriormente a este período. Independentemente do método de inoculação utilizado foi observada a colonização dos tecidos do hospedeiro em todas as plantas inoculadas.

Palavras-chave: Bactris gasipaes, metodologia de inoculação, microscopia eletrônica de varredura.

ABSTRACT

Aiming to study the interaction Phytophthora palmivora and pejibaye palm (Bactris gasipaes Kunt.) with the aid of scanning electron microscope (SEM), sections were made of the stem base of pejibaye plants in the sites where six-month-old pejibaye seedlings were inoculated. The inoculation methods used were: i. inoculation with 5 µL drops of zoospore suspension (1x10⁶ zoopores/mL); ii. irrigation around the stem base of seedlings, with 5 mL of a suspension of 1 x 10⁶ zoospores/mL; and iii. inoculation with a 7-mm-diameter disk of mycelium. Tissue sections were made 6 and 12 hours after inoculation, following the conventional process of fixation, dehydration and metallization steps for SEM. Encysted zoospores and sporangia attached to host epidermis were seen 6 and 12 hours after inoculation, with the pre-infection phase occurring before that stage. Independently of the inoculation method employed, host tissue colonization could be observed in all inoculated plants.

Key words:Bactris gasipaes, inoculation methods, scanning electron microscopy.

O cultivo da pupunheira (Bactris gasipaes Kunt.) encontra-se em expansão no Sul da Bahia onde as condições edafoclimáticas são muito favoráveis à cultura (Bovi, 2001). A agroindústria do palmito constitui-se excelente alternativa para a região, desde que seja adotado um manejo adequado ao seu cultivo (Rocha, 2003). O monocultivo e a expansão da área cultivada trouxeram, entretanto, conseqüências para a sua exploração na região à medida que começaram a surgir problemas fitossanitários, entre os quais, a doença conhecida como podridão do estipe, causada por Phytophthora palmivora (Butler) Butler (Santos & Luz, 2007).

Os sintomas da doença são muito drásticos tanto em mudas enviveiradas como em plantas adultas. São caracterizados pela clorose inicial com posterior secamento das folhas e apodrecimento dos tecidos internos da base do estipe, que adquirem a coloração pardo-escura, culminando posteriormente com a morte da planta (Pizzinato et al., 2002).

O patógeno pertencente ao Reino Straminipila, Filo Oomycota, sendo favorecido por temperaturas entre 25 e 30 °C e alta umidade, condições estas favoráveis à ocorrência de epidemias em qualquer dos seus hospedeiros (Erwin & Ribeiro, 1996; Oliveira & Luz, 2005). Os fatores ambientais são, portanto, de importância primordial para que ocorram surtos epidêmicos da doença (Hanada, 2006).

O micélio de P. palmivora é asseptado, os zoosporângios são papilados, ovóides e decíduos, e os clamidósporos são terminais e intercalares, sendo uma espécie tipicamente heterotálica. Os zoósporos constituem-se nas principais unidades infectivas do patógeno. A formação dos zoosporângios é favorecida por condições de solo ligeiramente mais secas, todavia, a produção e liberação dos zoósporos são favorecidas por solos saturados (Ko, 1994).

Embora o patógeno afete diversas culturas de relevância econômica como o cacaueiro (Theobroma cacao L.), coqueiro (Cocos nucifera L.), pimenta-do-reino (Piper nigrum L.), entre outras (Dianese, 2006), não foram encontrados relatos na literatura quanto ao seu processo de patogênese sobre a pupunheira. A elucidação de alguns aspectos deste processo e das alterações tissulares decorrentes da infecção é muito importante. O presente trabalho teve como objetivo estudar alguns aspectos relacionados à patogênese, envolvendo penetração e colonização dos tecidos de plântulas de pupunheira artificialmente inoculadas com P. palmivora.

Plântulas, com seis meses de idade, cultivadas em casa-de-vegetação em sacos de polietileno contendo uma mistura solo + PLANTIMAX (1:1), foram inoculadas com o isolado 870 de P. palmivora cultivado em meio de cenoura-agar (CA), por 8 dias, sob luz contínua. Antes da inoculação foram feitos ferimentos leves no estipe, e em seguida as plantas foram inoculadas através dos seguintes métodos: i) Inoculação com gotas (5µL) de uma suspensão de 1 x 10⁶ zoósporos/mL; ii) Irrigação do solo, em torno do coleto, com 5 mL de uma suspensão de 1 x 10⁶ zoósporos/mL; e iii) Inoculação com disco de micélio de 0,7 cm de diâmetro. Foram mantidas plantas testemunhas para cada um dos métodos, utilizando água no lugar da suspensão de zoósporos e um disco de meio de cultura, no lugar do disco de micélio.

Seis e 12h após as inoculações foram retirados fragmentos, com bisturi, dos pontos de inoculação, os quais foram colocados em uma placa de vidro onde gotas de gluteraldeído foram adicionadas para que fossem efetuados os cortes histológicos. Amostras constituídas de cinco cortes com, aproximadamente, um milímetro de espessura, foram mantidas por 4 horas em frascos contendo uma solução de gluteraldeído 2,5% em tampão cacodilato 0,1 M, pH 7,2.

Após este período, as amostras foram lavadas por seis vezes consecutivas, durante 10 minutos, em tampão cacodilato e pós-fixadas em tetróxido de ósmio (OsO₄) a 1%, e em seguida mantidas em tampão cacodilato 0,1 M, por 4 horas. As amostras foram lavadas, novamente, por seis vezes, durante 10 minutos, com o mesmo tampão, procedendo-se então a desidratação sequencial em uma série alcoólica a 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 95%, em intervalos de 10 minutos, e por três vezes seguidas, em álcool 100%, a cada 20 minutos.

As amostras foram em seguida submetidas à desidratação em soluções álcool/acetona, 3:1, 1:1 e 1:3, em intervalos de 10 minutos, e por duas vezes consecutivas, em acetona (P.A.), por 15 minutos. Posteriormente foram submetidas ao processo de ponto crítico, por 40 minutos, utilizando-se o equipamento Critical Point Dryer, modelo CPD 030, Bal-tec, e montadas em "Stubs", com fita dupla face de carbono. Ao final, procedeu-se a metalização utilizando-se o equipamento Sputter, modelo SCD 050, Bal-tec, que consistiu na deposição, durante 80 segundos, de uma fina camada de ouro, de aproximadamente 20 nm de espessura. As preparações foram então examinadas ao microscópio eletrônico de varredura no Centro de Microscopia Eletrônica da Fundação Osvaldo Cruz, Salvador, BA.

Exames feitos em amostras coletadas 6 horas após a inoculação mostraram que o processo de infecção já havia ocorrido e que a colonização do hospedeiro encontrava-se em andamento. Independentemente do método de inoculação utilizado, foram encontrados zoósporos encistados e germinados, tanto nos cortes realizados as 6 como as 12 horas após a inoculação (Figura 1 A-G), além de esporângios, que só foram visualizados nos cortes obtidos após 12 horas da inoculação (Figura 2 A-C).

Infecção foi observada nas plântulas inoculadas pelos três métodos avaliados, como também o encistamento e a germinação dos zoósporos de P. palmivora através da emissão de tubos germinativos, muito embora não tenham sido feitas medições do seu comprimento (Figura 1). Observou-se também, a penetração direta nas células da epiderme após a formação de apressórios (Figura 1C e D), embora não tenham sido notadas alterações nos tecidos das plantas, 6 e 12 horas após a inoculação, apesar de estruturas semelhantes a haustórios estarem presentes no interior das células do xilema, demonstrando assim a rápida colonização do mesofilo pelo patógeno (Figuras 1F e 2D).

Os eventos da fase de pré-penetração (germinação e emissão de apressório) não foram observados em plântulas de pupunheira inoculadas pelos três métodos durante os períodos de avaliação utilizados (6 e 12 horas após a inoculação) neste trabalho, sendo provável que esta fase tenha ocorrido logo após a inoculação. Em folhas do cacaueiro foi observado que a penetração de P. palmivora, tanto de forma direta quanto pelos estômatos com a formação de apressório, ocorre três horas após a germinação (Luz & Silva, 2001). Se, este fosse também o comportamento do patógeno em pupunheira, as primeiras observações teriam que ter sido feitas duas e quatro horas após a inoculação para que se pudesse evidenciar a fase de pré-penetração.

Colonização dos tecidos do hospedeiro foi observada tanto às 6 quanto às 12 horas após a inoculação, sendo constatada a presença de zoósporos que já haviam penetrado tanto pelos estômatos ou ferimentos quanto, diretamente, através da epiderme. Santos et al. (1999), trabalhando no patossistema P. infestans x batata, também observaram todas estas etapas do processo de infecção. Matsuoka (1988), por sua vez, observou a formação de apressórios durante o processo de infecção no patossistema P. capsici x pimentão, notando o desenvolvimento do micélio entre as células e a formação de estrutura semelhante a haustórios. De acordo com alguns autores (Matsuoka, 1988; Hwang et al., 1989; Brites 1991), com o avanço da infecção, o patógeno passa a colonizar, intracelularmente, atingindo todos os tecidos do hospedeiro, inclusive os do sistema vascular. A despeito de não ter sido observada, a emissão do tubo germinativo, pela análise ao MEV, foi possível verificar a penetração do patógeno nas células da epiderme do estipe das plântulas de pupunheira.

Embora os cortes para as análises ao MEV tivessem sido efetuados próximos aos locais de ferimentos, ainda assim, foram observados zoósporos encistados ou aderidos à epiderme das plantas (Figura 1C-D). A penetração das espécies de Phytophthora nos tecidos do hospedeiro pode ocorrer através dos estômatos, de ferimentos provocados pela queda de tricomonas, ou ainda diretamente pela epiderme, sem que tenha sido constatada uma via preferencial de penetração (Brites, 1991). No patossistema pupunheira x P. palmivora, algumas observações sugerem a ocorrência da penetração direta do patógeno pelas células da epiderme da planta (Figura 1D). Fato semelhante foi constatado também por Santos et al. (1999), que observaram que na face adaxial de folíolos maduros de seringueira, onde não existem estômatos, a penetração de P. capsici ocorreu diretamente pelas células da epiderme, ao contrário da face abaxial, onde a preferência foi pelos estômatos. Os autores atribuem este fato à espessura acentuada da cutícula nas células epidérmicas, inviabilizando assim tal via de penetração.

Tanto para 6 quanto 12 horas após a inoculação foi observada a colonização do patógeno no interior das células do hospedeiro com a presença principalmente de zoósporos (Figura 1), e de haustórios no interior do xilema (Figuras 1G e 2D). Segundo Matsuoka (1988), haustórios de Phytophthora não apresentam a forma típica dos de Uredinales ou Erysiphales, e aqueles produzidos por P. palmivora em cacaueiro apresentam formas variadas. Os haustórios observados em pupunha apresentavam tanto a forma quanto o tamanho variáveis (Figura 2D). A formação de haustórios por espécies de Phytophthora tem início poucas horas após a infecção nos seus hospedeiros (Coffey & Wilson, 1983; Matsuoka, 1988). Avrova et al (2008) observaram estas estruturas 3 horas após a infecção de folhas de batateira (Solanum tuberosum) por P. infestans. Na interação Phytophthora sojae e raízes de Glycine máxima, haustórios em deferentes estágios de maturação foram observados 10 horas após a inoculação (Enkerli et al., 1997)

Embora neste trabalho só tenham sido feitas análises histopatológicas 6 e 12 horas após a inoculação, ficou evidenciado que a penetração do patógeno pode ocorrer tanto de forma direta quanto indireta pelos estômatos, não sendo essencial a existência de ferimentos para que haja a penetração. Tais resultados enfatizam a necessidade de que trabalhos complementares sejam realizados com intuito de melhor esclarecer o processo de patogênese neste patossistema.

AGRADECIMENTOS

A primeira e a segunda autoras agradecem ao conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq pela concessão das bolsas de mestrado e de Produtividade, respectivamente; à Comissão Executiva da Lavoura Cacaueira (CEPLAC) onde o trabalho foi realizado; a Ana Rosa Niella, Dilze Maria Argolo e Ademilde Cerqueira, pela colaboração e apoio; à Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC); à Sra. Valéria Fernandes; e à Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) pela estrutura física disponibilizada para observações ao MEV, e em especial a Dra. Adriana Rangel.

Recebido 30 Setembro 2010

Aceito 1 Julho 2011

Autor para correspondência: Aline Brito Vaz, e-mail: [e-mail]

TPP 185

Editor de Seção: Francisco F. Laranjeira

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  21 Nov 2011
• Data do Fascículo
  Ago 2011

Histórico

• Aceito
  01 Jul 2011
• Recebido
  30 Set 2010