Ocorrência e caracterização do complexo de espécies causadoras da mancha bacteriana do tomateiro no Alto Vale do Rio do Peixe, SC

Occurrence and characterization of the species complex causing tomato bacterial spot in "Alto Vale do Rio do Peixe", SC, Brazil

COMUNICAÇÃO SHORT COMMUNICATION

Josineide R. Costa^I; Edivânio R. Araújo^II; Walter F. Becker^III; Marisa A.S.V. Ferreira^II; Alice Maria Quezado-Duval^IV

^IFaculdade Anhanguera de Brasília/JK, 71950-550, Brasília, DF, Brasil

^IIUniversidade de Brasília, Departamento de Fitopatologia, 70910-900, Brasília, DF, Brasil

^IIIEmpresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina, Estação Experimental de Caçador, 89500-000 Caçador, SC, Brasil

^IVEmbrapa Hortaliças, 70359-970, Brasília, DF, Brasil

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi identificar isolados de Xanthomonas causadores da mancha bacteriana do tomateiro para consumo in natura, provenientes da região do Alto Vale do Rio do Peixe, SC, Brasil, bem como caracterizá-los quanto à sensibilidade in vitro ao cobre. As espécies foram determinadas por similaridades de perfis genômicos gerados por BOX-PCR e a sensibilidade ao cobre foi estabelecida utilizando-se o meio CYE suplementado com sulfato de cobre nas concentrações de 50, 100 e 200 µg/mL. Do total de 44 isolados, 80% foram identificados como X. gardneri, 11% como X. perforans e 9% como X. vesicatoria. De acordo com a reação ao cobre, os isolados foram agrupados em quatro classes (S, sensíveis; MS, moderadamente sensíveis; MI, moderadamente insensíveis; I, insensíveis). Quanto à sensibilidade ao cobre, 98% de todos os isolados foram sensíveis a 200 µg/mL, sugerindo que aparentemente, a dosagem recomendada de produtos à base de cobre em campo, 10 vezes maior que a dosagem limítrofe utilizada nos testes in vitro, ainda é eficiente para as diferentes espécies da bactéria.

Palavras-chave:Xanthomonas euvesicatoria, X. gardneri, X. perforans, X. vesicatoria, BOX-PCR, cobre, controle químico.

ABSTRACT

The aim of this study was to identify at the species level Xanthomonas strains causing tomato bacterial spot in the region of "Alto Vale do Rio do Peixe", state of Santa Catarina, Brazil, as well as to determine their in vitro sensitivity to copper. Species were determined by similarity analysis of genomic profiles generated by BOX-PCR and sensitivity to copper was established using the CYE medium supplemented with copper sulfate at concentrations of 50, 100 and 200 µg/mL. Of the 44 isolates, 80% were identified as X. gardneri, 11% as X. perforans and 9% as X. vesicatoria. According to the response to copper, the isolates were divided into four classes (S, sensitive; MS, moderately sensitive; MI, moderately insensitive; I, insensitive). Regarding the sensitivity to copper, 98% of all isolates were sensitive at 200 µg/mL, suggesting that the recommended dosage of copper-based products registered for the crop may still provide effective control of the different bacterial species.

Key words:Xanthomonas euvesicatoria, X. gardneri, X. perforans, X. vesicatoria, BOX-PCR, chemical control, copper.

Em Santa Catarina, o pólo produtor de tomate (Solanum lycopersicum L.) se concentra na região do Alto Vale do Rio do Peixe (AVRP). Os municípios de Caçador, Lebon Régis, Rio das Antas e Macieira, que compõem essa região, são responsáveis por 49,14% da área cultivada no Estado. Segundo levantamento realizado pela Epagri/Cepa (2011), Santa Catarina é atualmente o sétimo maior produtor nacional. Toda a produção do Estado destina-se ao consumo in natura (Camargo & Camargo Filho, 2008).

O município de Caçador possui a maior área cultivada (1.000 ha). A produtividade de suas lavouras é de 85.000 kg/ha, o que torna sua produção equivalente a 45,5% da safra estadual (Epagri/Cepa, 2011). O desenvolvimento da cultura do tomate neste município se deve à condição climática vigente e gera renda para mais de 560 famílias de agricultores. Em função da altitude média (em torno de 1000 m), o verão se caracteriza como ameno. Assim, é possível colher tomate em janeiro, fevereiro e março, meses em que as regiões produtoras tradicionais dessa hortaliça enfrentam problemas advindos do calor excessivo do verão. Com isso, a maior parte do tomate comercializado no Brasil nesses meses é oriunda de Caçador (Kreuz et al., 2004).

A mancha bacteriana tem como agentes causais um complexo de espécies pertencentes ao gênero Xanthomonas, a saber, X. euvesicatoria, X. vesicatoria, X. perforans e X. gardneri (Jones et al., 2004). Na região amostrada no presente estudo, a doença é endêmica e prevalente, ocorrendo com maior intensidade nos anos chuvosos (Marcuzzo et al., 2009). Apesar dos danos severos frequentemente observados nas lavouras, não foram encontrados relatos quantificando as perdas decorrentes da doença para o segmento de tomate para consumo in natura no Brasil. Sabe-se, no entanto, que em condições experimentais de campo, a doença pode causar perdas de até 52% na produção de tomate rasteiro (Quezado-Soares et al., 1998).

A diferenciação das espécies que formam o complexo da mancha bacteriana pode ser realizada através de ensaios bioquímicos (atividade amilolítica), patogenicidade em tomate e pimentão, mas com maior eficiência e rapidez por meio de técnicas moleculares, rep-PCR ou PCR com iniciadores específicos (Louws et al., 1995; Bouzar et al., 1999; Cuppels et al., 2006; Koenraadt et al., 2009; Pereira et al., 2011). A técnica de rep-PCR com o iniciador BOX apresenta vantagens por ser rápida, de fácil execução e altamente discriminatória para espécies de Xanthomonas. Segundo Rademaker et al. (2000), métodos que geram fingerprintings, como rep-PCR, apresentam elevada correlação com a homologia DNA-DNA, reafirmando a especificidade e eficiência dessa técnica na identificação de espécies bacterianas.

Apesar de amplamente empregados em lavouras de tomate no Brasil, fungicidas cúpricos registrados para uso agrícola nem sempre resultam em controle eficiente das bacterioses que afetam a cultura. O aparecimento de estirpes resistentes aos princípios ativos pode ser uma das causas dessa baixa eficiência (Quezado-Duval et al., 2003). Na região do AVRP, o controle químico da mancha bacteriana é efetuado por meio de produtos cúpricos e associações destes com mancozebe, já na primeira semana do transplante, com frequência semanal, o que representa 32% das aplicações de agrotóxicos no ciclo da cultura (Becker et al., 2011).

Este trabalho objetivou identificar, em nível específico, os isolados de Xanthomonas causadores da mancha bacteriana do tomateiro provenientes da região de Caçador-SC, bem como avaliar a sensibilidade in vitro desses isolados ao cobre.

Para constatar a ocorrência relativa de espécies do gênero Xanthomonas, coletou-se folhas com sintomas de mancha bacteriana em lavouras de tomate de mesa na região de Caçador em quatro propriedades, compreendendo nove diferentes campos de produção. Os isolados que apresentaram colônias características do gênero foram transferidos para o meio Nutriente Ágar (NA) e incubados por 48 horas a 28ºC, procedendo-se então à preservação dos mesmos em tampão fosfato (K₂HPO₄, KH₂PO_4, pH 7,0), segundo Schaad et al. (2001).

Suspensões bacterianas para os diferentes testes foram preparadas em sulfato de magnésio (10 mM/L), na concentração aproximada de 5 × 10⁸ UFC/mL ajustada em espectrofotômetro (OD₆₀₀ = 0,3). Realizaram-se testes de hipersensibilidade em plantas de fumo, avaliando as reações às 24 e 36 horas após a inoculação. Os isolados também foram inoculados em plantas de tomate da variedade suscetível Yuba (CNPH 851) para verificação de patogenicidade.

O DNA genômico foi extraído utilizando-se o método CTAB de Wilson (1999) com modificações. Para as reações de BOX-PCR utilizou-se iniciador BOX 1AR (5' CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G 3') correspondente à sequência repetitiva BOX (Versalovic et al., 1991). A reação foi composta de: Tampão 1X; 1,5 mM de MgCl₂; 0,2 mM de cada um dos dNTPs; 2 µM do iniciador; 1,26 U de Taq DNA polimerase; aproximadamente 50 ng de DNA; e água milliQ para um volume final de 12 µL. As amostras foram amplificadas em termociclador My Cycler^TM (BIO RAD). O programa utilizado para amplificação foi 95°C por 7 min., seguido de 30 ciclos de: 94°C por 1 min. para a desnaturação, 53°C por 1 min. para anelamento e 65°C por 8 min. para a extensão. A extensão final foi realizada a 65°C por 15 min. Os produtos de PCR foram analisados em gel de agarose (1,5%) em tampão TBE 0,5X, por eletroforese conduzida a 100 V durante 3 horas. Para cada isolado, cada reação foi repetida pelo menos duas vezes.

O dendrograma foi gerado pelo programa GelCompar II versão 5.10 (Applied Maths, EUA), utilizando-se o coeficiente de Dice e o método de agrupamento UPGMA (unweighted pair-group method using arithmetic averages).

Para os testes de sensibilidade in vitro ao cobre, ajustou-se a concentração da suspensão bacteriana em espectrofotômetro para aproximadamente 5 × 10⁸ UFC/mL. Em seguida, depositaram-se alíquotas de 10 µL em triplicatas, em placas contendo meio CYE (casitone-yeast extract) (Zevenhuizen et al., 1979), contendo 1,7 g/L de casitona; 0,35 g/L de extrato de levedura; 2,0 g/L de glicerol e 15 g/L de ágar, suplementado com sulfato de cobre (CuSO₄.5H₂O, Merck) nas concentrações de 50, 100 e 200 ppm (µg/mL). Estas concentrações correspondem a 0,2; 0,4 e 0,8 mM de CuSO₄, respectivamente. Alíquotas de todos os isolados avaliados foram depositadas em meio CYE sem suplementação de cobre como controle comparativo para determinação do crescimento confluente. As placas foram incubadas por 72 horas a 28°C, para posterior avaliação de reação de sensibilidade dos isolados. Foram atribuídas classes para as diferentes reações dos isolados ao cobre. Isolados sensíveis (S) foram aqueles que não cresceram na concentração de 50 µg/mL de sulfato de cobre; moderadamente sensíveis (MS) cresceram a 50 µg/mL, mas não a 100 µg/mL; moderadamente insensíveis (MI) cresceram a 100 µg/mL, mas não a 200 µg/mL; e isolados insensíveis (I) cresceram a 200 µg/mL de sulfato de cobre.

Colônias bacterianas características em meio NA, confirmação de reações de hipersensibilidade em fumo e reprodução de sintomas típicos de mancha bacteriana em tomate, caracterizaram os isolados como pertencentes ao gênero Xanthomonas.

Oitenta por cento dos isolados foram identificados, segundo perfil genômico gerado por BOX-PCR, como X. gardneri, formando um clado com similaridade entre 59,5 e 82,4% com o isolado de referência IBSBF 2373 da espécie (Figura 1). Assim, constatou-se a predominância desta espécie na região. Epidemias ocasionadas por X. gardneri já foram relatadas no país em campos de tomate indústria no estado de Goiás (Quezado-Duval et al., 2004). Em estudo realizado por Pereira et al. (2011), abrangendo algumas regiões produtoras de tomate para mesa, isolados provenientes da região sul do país, em sua totalidade, foram identificados como X. gardneri.

Cinco isolados (11%) apresentaram perfis semelhantes (40,7% de similaridade) aos isolados de referência IBSBF 2370 (X. perforans) e IBSBF 2363 (X. euvesicatoria), que são espécies geneticamente próximas (Hamza et al., 2010). Estes isolados foram identificados como X. perforans. Três amplificaram um fragmento de 654 pb contendo o gene avrXv3, característico de X. perforans e os outros dois foram confirmados com iniciadores específicos para essa espécie. Todos os isolados do presente estudo também tiveram confirmação de suas espécies com seus respectivos iniciadores específicos (Koenraadt et al., 2009), ainda em fase de validação na Embrapa Hortaliças em parceria com a Universidade de Brasília (dados não publicados).

Os demais isolados (9%) foram identificados como X. vesicatoria, com similaridade de 49,1 a 67,4% com o isolado de referência da espécie (IBSBF 2364). Já foi relatada alta diversidade dentro do grupo B de Xanthomonas causador da mancha bacteriana, aqui tratado como X. vesicatoria, a partir de perfis gerados por rep-PCR (Louws et al., 1995). Nenhum isolado foi identificado como X. euvesicatoria. Não foi observada nenhuma relação entre variedade de tomate e prevalência de espécies.

É interessante salientar a presença de mais de uma espécie ocorrendo concomitantemente no mesmo campo (Tabela 1), fato ainda não observado nos levantamentos realizados no país, considerando a presença de um complexo de espécies associadas à mancha bacteriana do tomateiro.

Com relação aos testes in vitro, 89% dos isolados agruparam-se na classe MI, ou seja, cresceram a 100 µg/mL, mas não a 200 µg/mL de sulfato de cobre. Analisando as respostas por espécies, constatou-se que, dos isolados caracterizados como X. gardneri, 86% foram classificados como MI, 11% como MS e 3% como S. Já para os isolados identificados como X. perforans, 40% foram S e 60% MI. Apesar do reduzido número de isolados, nota-se que X. perforans apresenta maior sensibilidade às menores concentrações de cobre. Os isolados de X. vesicatoria agruparam-se da seguinte maneira: 75% MI e 25% I (Figura 2). Apenas um isolado (CNPH 2010-41), caracterizado quanto ao perfil BOX-PCR como X. vesicatoria, apresentou insensibilidade ao sulfato de cobre na maior concentração (200 µg/mL). Os demais isolados foram sensíveis a esta concentração. Estes resultados corroboram os trabalhos realizados por Quezado-Duval et al. (2003), em que a totalidade dos isolados avaliados foram sensíveis à concentração de 200 µg/mL. Esta dosagem de aplicação de produtos cúpricos no controle da mancha bacteriana é 10 vezes menor que a recomendada em campo segundo Andrei (2005), indicando que esta concentração ainda é eficiente no manejo da doença. Porém, a constatação da alta incidência de isolados moderadamente insensíveis (100 µg/mL), pode ser considerada um alerta para o uso mais racional do princípio ativo, de maneira a preservar a eficiência dessa importante ferramenta de controle ao longo do tempo.

A partir da análise dos perfis genômicos gerados por BOX-PCR, observou-se diversidade interespecífica dos isolados associados à mancha bacteriana do tomateiro, distinguindo claramente a espécie X. gardneri das demais, apesar da similaridade dentro desse grupo não ter sido muito elevada. No levantamento anterior feito em lavouras de tomate indústria, no período de 1995 a 2000, a diversidade de X. gardneri e de X. perforans foi, por sua vez, considerada baixa. Esse fato sugere que essas espécies, aparentemente de introdução mais recente (Quezado-Duval et al., 2004, 2005), estejam se adaptando às condições de cultivo do tomateiro no país.

AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq, pelo suporte financeiro (CNPq Processo 578775/2008-5) e pela bolsa concedida à primeira autora.

Recebido 16 Junho 2011

Aceito 12 Março 2012

Autor para correspondência: Alice Maria Quezado-Duval, e-mail: [e-mail]

TPP 339

Editor de Seção: Bernardo A. Halfeld-Vieira

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Ocorrência e caracterização do complexo de espécies causadoras da mancha bacteriana do tomateiro no Alto Vale do Rio do Peixe, SC

Occurrence and characterization of the species complex causing tomato bacterial spot in "Alto Vale do Rio do Peixe", SC, Brazil

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  18 Maio 2012
• Data do Fascículo
  Abr 2012

Histórico

• Recebido
  16 Jun 2011
• Aceito
  12 Mar 2012