Interferência de ulvana no desenvolvimento e melanização de apressórios de Colletotrichum gloeosporioides

Interference of ulvan on apressoria development and melanization of Colletotrichum gloeosporioides

SHORT COMMUNICATION COMUNICAÇÃO

Interferência de ulvana no desenvolvimento e melanização de apressórios de Colletotrichum gloeosporioides

Interference of ulvan on apressoria development and melanization of Colletotrichum gloeosporioides

Amanda E. Gonçalves; Marciel J. Stadnik

Departamento de Fitotecnia, Universidade Federal de Santa Catarina, 88034-001, Florianópolis, SC, Brasil

RESUMO

O polissacarídeo algal ulvana induz resistência em macieira à mancha foliar de Glomerella. Porém, modificações no processo pré-infeccioso de Colletotrichum gloeosporioides vêm sendo relatadas em plantas previamente tratadas com ulvana. Assim, este trabalho objetivou verificar se o polissacarídeo interfere diretamente no desenvolvimento de estruturas pré-infectivas. Para tanto, depositou-se gotas de 10 µL de suspensão de 2x10⁵ conídios.mL^-1 em segmentos de papel celofane, assentados sobre lâminas de vidro. A suspensão conidial foi preparada com solução aquosa contendo ou não ulvana (10 mg.mL^-1). As amostras foram incubadas a 25ºC e 100% de humidade relativa. A cada duas horas, 100 conídios por gota foram examinados microscopicamente (200x), por um período de 16h. As taxas de germinação de conídios, formação e melanização de apressórios foram quantificadas. A germinação dos conídios não foi afetada. Ulvana estimulou o alongamento do tubo germinativo, mas retardou a diferenciação do primeiro apressório (séssil). O polissacarídeo acelerou a formação do segundo apressório, mas inibiu a sua melanização.

Palavras-chave:Ulva fasciata, apressório, germinação, macieira, melanina, polissacarídeo.

ABSTRACT

The algal polysaccharide ulvan induces resistance in apple to Glomerella leaf spot. However, changes in the pre-infectious process of Colletotrichum gloeosporioides have been reported in apple plants previously treated with ulvan. Thus, this study aimed to verify if the polysaccharide interferes directly in the development of pre-infective structures. For this, 10 µL drops of spore suspension (2x10⁵ conidia.m L^-1) were distributed on cellophane paper segments settled on glass slides. The conidial suspension was prepared with aqueous solution with (10 mg.mL^-1) or without ulvan. Samples were incubated at 25ºC and 100% relative humidity. At every two hours of incubation and over a period of 16 hours, 100 conidia per drop were microscopically (200x) examined. The rates of conidia germination, apressoria formation and melanization were quantified. Germination of conidia was not affected. Ulvan stimulated the elongation of the germ tube but retarded the differentiation of the first apressorium (sessile). The polysaccharide accelerated the formation of second apressorium, but inhibited its melanization.

Key words:Ulva fasciata, apple tree, apressorium, germination, melanin, polysaccharide.

A Mancha Foliar da Glomerella (MFG), causada por C. gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. 1884 é considerada a principal doença de verão da cultura da macieira. Em condições ótimas de temperatura (24ºC) e alta umidade relativa (UR), o fungo pode reduzir drasticamente o potencial produtivo das plantas no ano subsequente (Katsurayama & Boneti, 2009).

Tem-se buscado métodos alternativos de controle de doenças de plantas, como a aplicação de produtos que induzem a resistência a fitopatógenos. Ulvana é um polissacarídeo proveniente das paredes celulares da macroalga verde Ulva spp. Delile 1813 (Paulert et al., 2009) que possui este potencial (Cluzet et al., 2004; Jaulneau et al., 2010). Pelo tratamento preventivo com ulvana, tem-se relatado reduções na severidade da MFG de até 65% (Araújo et al., 2008). O controle da MFG vem sendo associado a uma maior atividade de peroxidases, mas não de glucanases, em macieiras tratadas preventivamente com ulvana e inoculadas com C. gloeosporiodes (Araújo & Stadnik, 2013).

Geralmente, indutores de resistência não apresentam ação antimicrobiana direta sobre patógenos e, portanto, não costumam afetar a germinação e formação de apressórios (Guzzo et al., 2001). Apressórios são essenciais ao processo infectivo de Colletotrichum, pois permitem ao fungo aderir-se e penetrar diretamente a cutícula e a parede das células epidermais do hospedeiro (Wharton & Uribeondo, 2004). O acúmulo de melanina também se relaciona a este processo, pois fungos fitopatogênicos que formam apressórios hialinos têm sua penetração impossibilitada (Jacobson, 2000).

Recentemente, Araújo (2010) observou redução no número de apressórios sobre folhas de macieiras tratadas com ulvana, em 24, 48 e 72 horas após sua inoculação com C. gloeosporioides. Deste modo, o presente trabalho objetivou avaliar o efeito direto desse polissacarídeo sobre formação e o desenvolvimento de estruturas pré-infectivas de C. gloeosporioides.

Foi utilizado nos ensaios o isolado MANE 147 de C. gloeosporioides (Araújo & Stadnik, 2013), proveniente de Urubici-SC. Mantiveram-se as culturas sob as mesmas condições e os conídios foram coletados conforme a metodologia descrita por Araújo & Stadnik (2011). A concentração de conídios foi ajustada para 2x10⁵ conídios.mL^-1.

Para a extração da ulvana, adotou-se a metodologia adaptada de Paulert et al. (2009). O segundo precipitado, utilizado em todos os experimentos, foi coletado em papel filtro (25µm) por filtração a vácuo, após 96h de permanência da solução de etanol a -20ºC. O material foi seco a 45ºC, até atingir peso constante, quando foi triturado em moinho analítico, separado em peneira metálica de 0,042 mm e armazenado a -20ºC.

A formação de apressórios foi observada sobre papel celofane, conforme metodologia modificada de Shisler et al. (1991) e Fudal et al. (2007). Para tanto, assentaram-se segmentos de papel celofane incolor (RMV-Realce^®) de 76x26 mm, sobre lâminas de microscopia. Sobre a superfície do celofane, depositou-se uma gota de 10 µL de suspensão conidial (2x10⁵ conídios.mL^-1), com ou sem ulvana (10 mg.mL^-1). O conjunto contendo a lâmina e o papel celofane foi incubado a 25ºC, 100% de UR e fotoperíodo de 12h.

O crescimento fúngico foi paralisado pela adição de 10 µL Azul de Amann (ácido lático, fenol cristalino, água destilada na proporção de 1:1:1 (v/p/v) e azul de algodão-0,2%). A geminação conidial, a formação de estruturas pré-infectivas e a melanização de apressórios foi monitorada em intervalos de duas horas, até 16h de incubação. Avaliações posteriores não foram realizadas devido ao intenso crescimento do tubo germinativo.

Para determinar a germinação conidial, avaliou-se microscopicamente (200x) 100 conídios por gota depositada sobre o celofane. Conídios germinados foram considerados aqueles que apresentavam apressório séssil ou um tubo germinativo maior que a largura do próprio conídio.

Os conídios germinados foram classificados em nove categorias, de acordo com o número e a característica das estruturas emitidas: A) Conídio germinado sem apressório (Ap); B) Conídio com somente um Ap séssil; C) Conídio com somente um Ap pedicelado; D) Conídio com um Ap séssil + um ou mais tubos germinativos (TGs); E) Conídio com um Ap pedicelado + um ou mais TGs; F) Um Ap séssil + um Ap pedicelado; G) Dois Aps sésseis; H) Dois Aps pedicelados; I) Conídio com três Aps. Definiu-se como apressório pedicelado aquele formado na extremidade de um tubo germinativo longo, ou seja, maior que 10 µm (Araújo, 2010). Os apressórios sésseis, portanto, foram os que se formavam na extremidade de tubos germinativos menores que 10 µm.

Avaliou-se microscopicamente a presença de melanina nos apressórios dos conídios germinados, a cada duas horas (6-16h), conforme a metodologia de Oh et al. (1998). Estas estruturas foram classificadas em apressórios melanizados (maturos) e apressórios hialinos (imaturos), dependendo da absorção do Azul de Amann.

Cada repetição consistiu na contagem de 100 conídios por gota. O experimento foi disposto em delineamento completamente casualisado, com três repetições por tratamento. Os dados foram submetidos ao teste t (P<0,05), utilizando-se o programa computacional STATISTICA 6.0. O ensaio foi repetido independentemente cinco vezes, obtendo-se resultados semelhantes. Neste trabalho são apresentados os resultados de um desses experimentos.

A germinação dos conídios iniciou com duas horas de incubação e atingiu 100% às 10h e 8h, na testemunha e ulvana, respectivamente. Ulvana não diferiu estatisticamente da testemunha, exceto às 8h, quando apresentou transientemente cerca de 5% a mais de conídios germinados.

Quanto à classificação dos conídios, a maioria pertenceu às categorias de A a F (Figura 1). As categorias G, H não foram encontradas e a categoria I teve frequência menor que 0,06%.

O número de conídios germinados sem apressório foi maior no tratamento com ulvana até as 10h. A máxima porcentagem de conídios germinados classificados na categoria A (sem apressórios) foi observada às 4h e 8h, com 27% e 70%, na testemunha e ulvana, respectivamente (Figura 1A).

A formação do apressório séssil na testemunha iniciou com 4h, atingindo no máximo 80%, às 8h. Em ulvana atingiu no máximo 25%, às 6h (Figura 1B). Apressórios pedicelados foram menos frequentes que os sésseis. A porcentagem de conídios classificados na categoria C (um apressório pedicelado) foi até 90% maior no tratamento com ulvana, entre 8 e 10h de incubação. A partir de 10h, ambos os tratamentos apresentaram comportamento semelhante (Figura 1C).

O segundo tubo germinativo iniciou seu crescimento a partir das 8h de incubação para o tratamento com ulvana e 10h para a testemunha. Após 12h, a testemunha superou o tratamento com ulvana para esta categoria (Figura 1D).

A partir de 8h e 10h de incubação, o número de conídios germinados com um apressório pedicelado e um ou mais tubos germinativos aumentou no tratamento com ulvana e testemunha, respectivamente (Figura 1E).

As frequências de conídios germinados com um apressório séssil e outro pedicelado aumentaram nos dois tratamentos até 12h, porém na ulvana foi até 74% maior (Figura 1F).

Os primeiros apressórios melanizados foram observados com 8 e 10h de incubação, representando aproximadamente 35 e 25% do total de apressórios formados durante este período, na testemunha e em ulvana, respectivamente. A porcentagem de conídios com somente um apressório melanizado aumentou gradativamente no decorrer das horas e o tratamento com ulvana (Figura 2B) exibiu valores até 74% inferiores à testemunha (Figura 2A). Às 14 e 16h, aproximadamente 70% dos apressórios eram melanizados na testemunha, enquanto na ulvana 20%.

Conídios com dois apressórios foram observados apenas a partir das 12h de incubação, sendo na maioria hialinos (Figura 3). Dentre estes, a proporção de conídios contendo dois apressórios hialinos no tratamento ulvana foi aproximadamente quatro vezes maior que na testemunha. A proporção de conídios com dois apressórios, sendo um deles melanizado, foi duas vezes maior no tratamento ulvana, às 16h. Nenhum conídio com dois apressórios melanizados foi observado até este momento.

O entendimento minucioso do processo de infecção por C. gloeosporioides é um dos passos para compreender os mecanismos de ação de compostos que controlam a MFG. Neste trabalho, foram encontradas evidências de que ulvana pode afetar diretamente a formação e o desenvolvimento de estruturas pré-infectivas de Colletotrichum.

O uso de membranas de celofane foi adequado para monitorar o desenvolvimento de estruturas pré-infectivas. Sua aplicação vem obtendo sucesso no estudo de apressórios de fungos, tais como Magnaporthe grisea (Kamakura et al., 1999; Clargeot et al., 2001; Fudal et al., 2007) e mesmo C. gloeosporioides/Glomerella cingulata da maçã (Shane & Sutton, 1981). Assim como para Shane & Sutton (1981), a germinação de conídios atingiu 100% com 10h de incubação, sobre celofane, mostrando que os conídios desse fungo germinam com facilidade sobre superfícies inertes. Nestas condições, o polissacarídeo não afetou a capacidade germinativa de C. gloeosporioides. Sobre superfície foliar de feijoeiro, Borsato et al. (2010) também não encontraram efeito da ulvana sobre a germinação de uredósporos (maior que 50%). Por outro lado, Paulert et al. (2009) relataram um acréscimo de 31% na taxa de germinação de C. lindemuthianum em lâminas escavadas, com a adição de ulvana. Vários fatores, como a presença de inibidores endógenos, matriz extracelular, presença de nutrientes, a idade e o estado nutricional do fungo (Shisler et al., 1991; Pereira et al., 1999) afetam a germinação de Colletrotrichum. Shisler et al. (1991) relatam que conídios com menor capacidade de germinar o fazem mais eficientemente sobre superfície de folhas, onde existe uma maior disponibilidade de nutrientes que sobre celofane.

Logo nas primeiras horas de incubação em celofane, os conídios foram estimulados à formação de apressórios, na sua maioria sésseis. Isto vai ao encontro das características descritas para esta espécie de Colletotrichum (Oh et al., 1998; Shisler et al., 1991).

O processo de emissão do tubo germinativo é energeticamente dispendioso, exaurindo rapidamente as reservas nutritivas dos conídios (Ferreira et al., 2006). Assim, na ausência de nutrientes, o fungo é rapidamente estimulado a formar apressórios numa tentativa de obtê-los de seu hospedeiro. A ulvana pode fornecer monossacarídeos (Paulert et al., 2009) que estimulam o crescimento do tubo germinativo. Isso explicaria a alta porcentagem de conídios germinados sem apressório, por volta das 8h de incubação. A diferenciação do tubo germinativo em apressório é estimulada pela ausência de nutrientes exógenos (Dean, 1997; Shisler et al., 1991, Pereira et al. 2009). Provavelmente por isso, a ulvana estimulou o crescimento do tubo germinativo e atrasou sua diferenciação em apressório. Também, Araújo (2010) observou um aumento de conídios germinados e menor formação de apressórios de C. gloeosporioides em folhas de macieira tratadas com o polissacarídeo.

A porcentagem de conídios germinados com dois apressórios foi cerca de duas vezes maior para os conídios tratados com ulvana, às 16h, indicando que o polissacarídeo pode estimular a formação do segundo apressório.

Este monitoramento talvez ajude a explicar as contradições presentes na literatura, onde nutrientes ora são relatados como inibidores da diferenciação do apressório (Shisler et al., 1991) e outras vezes, como estimuladores (Bonaldo & Pascholati, 2007; Slade et al., 1986). Assim, num momento inicial, a presença de nutrientes atrasou a formação do apressório. Posteriormente, quando esse suprimento de nutrientes tornou-se mais escasso, a diferenciação dos tubos em segundo apressório foi facilitada pela melhor condição nutricional do fungo.

Apressórios recém-formados são hialinos e, posteriormente, tornam-se melanizados, devido à maturação destas células especializadas de infecção (Nesher et al., 2008). Como a ulvana estimulou a formação do segundo apressório e retardou a melanização tanto deste, quanto do primeiro, isso explicaria sua interferência na distribuição de classes de apressórios ao longo do tempo (Figura 1) e no aumento paralelo de conídios germinados com dois apressórios.

A formação mais acelerada do segundo apressório foi associada ao atraso na melanização do primeiro apressório. O tubo germinativo iniciou a diferenciação em segundo apressório quando geralmente o primeiro ainda estava imaturo (hialino). Este atraso ou inibição da melanização do apressório pode ter sido devido a fatores nutricionais, estimulando o crescimento ativo do tubo germinativo e/ou inibição da síntese de melanina. Há compostos, como a carpropamida (Kurahashi et al.,1998), que podem inibir a síntese de melanina (Jacobson, 2000) sem afetar a germinação de conídios e o número de apressórios formados (Thieron et al., 1998). Contudo, de encontro a estes autores, a inibição da melanização observada foi somente parcial. Isso indica que o mais provável seja que a ulvana somente cause um atraso na melanização, devido às questões nutricionais.

Na tentativa de infectar o hospedeiro, C. gloeosporioides emite um único tubo germinativo, e caso não tenha sucesso na penetração, pode tentar formar um segundo tubo. Estudos em tecidos vegetais têm demonstrado que este segundo tubo germinativo geralmente falha na penetração, pois está nutricionalmente debilitado (O'Connell et al., 2000). Assim, é possível que o atraso na melanização do primeiro apressório reduza a sua capacidade de penetração (Kubo et al., 1991) e, consequentemente, estimule a formação do segundo apressório. Contudo, mais estudos são necessários para esclarecer se estas modificações contribuem para controle da MFG.

AGRADECIMENTOS

Marciel J. Stadnik agradece ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq pela bolsa de produtividade.

Recebido 27 Outubro 2011

Aceito 3 Setembro 2012

Autor para correspondência: Marciel J. Stadnik, e-mail: [e-mail]

TPP 435

Editor de Seção: Silvaldo Felipe da Silveira

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  05 Dez 2012
• Data do Fascículo
  Dez 2012

Histórico

• Recebido
  27 Out 2011
• Aceito
  03 Set 2012