Ocorrência de Borrelia spp. em cultura de células embrionárias do carrapato Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) no Estado do Mato Grosso do Sul, Brasil

Occurrence of Borrelia spp. in culture of embryonic cells of the tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) in the State of the Mato Grosso do Sul, Brazil

NOTA DE PESQUISA

Ocorrência de Borrelia spp. em cultura de células embrionárias do carrapato Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) no Estado do Mato Grosso do Sul, Brasil

Occurrence of Borrelia spp. in culture of embryonic cells of the tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) in the State of the Mato Grosso do Sul, Brazil

Jania de Rezende^I; Raul H. Kessler^II; Cleber O. Soares^II; Odair P. Martins^III

^ICurso de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Km 7 da BR 465, Seropédica RJ 23890-000, Brasil. Bolsista do (CNPq). E-mail: [e-mail]

^IIPesquisador da Embrapa, Centro Nacional de Pesquisa Gado de Corte (CNPGC), BR 262, Km 4, Caixa Postal 154, Campo Grande, MS 79002-970

^IIIUniversidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS), Av. Felinto Miller, s/n, Cidade Universitária, Campo Grande, MS 79070-900

RESUMO

O presente trabalho teve como objetivo reportar a ocorrência de Borrelia spp. em culturas de células embrionárias de Boophilus microplus infectados naturalmente. Sete dias após o início de uma nova cultura primária de células embrionárias do carrapato B. microplus, incubadas a 31ºC, notou-se que as células começaram a degenerar. Ao exame em microscópio de contraste de fase detectou-se a presença de microrganismos alongado e com grande mobilidade. Lâminas de microscópio confeccionadas com amostras do sobrenadante da cultura, hemolinfa e massa de ovos, coradas pelo May Grünwald-Giemsa, permitiram a visualização de espiroquetas. O exame morfológico do microrganismo e sua visualização em B. microplus sugere ser Borrelia spp.

Palavras-chave:Borrelia spp., carrapato, cultivo celular, hemolinfa.

ABSTRACT

The aim of the present work was to report the occurrence of Borrelia spp. in embryonic cell cultures from naturally infected Boophilus microplus. Seven days after the beginning of a primary culture of embryonic cells of B. microplus at 31ºC was noted that the cells start suffering degeneration. Under examination at phase contrast microscope, the presence of prolongated microorganisms with great mobility was detected. Microscopic slides of the culture supernatant, hemolymph and egg mass, were stained by May Grünwald-Giemsa, allowing the visualization of the spirochetes. The morphologic examination of the microorganism and its visualization in. B. microplus, suggest to be Borrelia spp.

Key words:Borrelia spp., Tick, cell culture, hemolymph.

Borrelia spp Swellengrebel, 1907 são bactérias do grupo das espiroquetas, agentes etiológico da doença de Lyme, transmitidas para humanos, animais domésticos e silvestres, por artrópodes hematófagos. A primeira observação de espiroquetas no sangue de ruminantes foi registrada por ArnoldTheiler em 1902, na África do Sul, denominado B. theileri Laveran (1903 ). É transmitida por carrapatos ixodídeos, principalmente B. microplus (SMITH; ROGERS, 1998). Outras duas espécies de Borrelia que infecta ruminante são B. coriaceae que causa o aborto epizoótico bovino, e têm como vetor Ornithodorus coriaceus e a B. burgdorferi responsável pela borreliose de Lyme, que também acomete o homem, seus vetores são Ixodes spp. e Amblyomma americanum Soares et al. (2000).

Poucas espécies de Borrelia têm sido cultivadas in vitro em meio liquido, porém baixos níveis de crescimento são obtidos (KRIEG et al., 1984).

O Estado de Mato Grosso do Sul (MS), com um rebanho estimado de 25 milhões de cabeças, tem na bovinocultura, uma das principais atividades econômicas. Ademais, não é conhecida a importância epidemiológica da infecção por Borrelia spp. em bovinos no nosso meio. O objetivo deste trabalho foi reportar a ocorrência de Borrelia spp. em culturas de células embrionárias de B. microplus infectadas naturalmente.

Cultura primária de células embrionária do carrapato B. microplus, segundo metodologia Yunker (1987), eram mantidas no laboratório de hemoparasitologia da Embrapa Gado de Corte - MS, provenientes de uma colônia de B. microplus, livre de hemoparasitos. Com sete dias de cultivo, as células embrionárias apresentaram-se degeneração celular. Ao exame em microscópio de contraste de fase detectou-se a presença de microrganismos alongados e com grande mobilidade. A cultura de células era mantida em meio Leibovitz's (L-15) com glutamina, suplementado com 10% de caldo triptose fosfato, 20% de soro fetal bovino, 0,1% fração V de albumina bovina e antibiótico gentamicina 50.000ug/ml, e pH 6.8, incubada em estufa tipo BOD, a 31ºC. O meio de cultura extraído semanalmente do cultivo, foi centrifugado a 572g por 8 minutos. O sobrenadante foi descartado e uma gota do sedimento transferida, para uma lâmina de microscópio, cobrindo-se com lamínula. O material foi examinado a fresco em microscópio óptico de contraste de fase com objetiva de 100X e ocular de 10X. Uma gota foi distribuída sobre lâmina, fixada com álcool metílico, e corada com MayGrünwald/Giemsa, sendo observada com objetiva 100X de imersão e ocular de 10x. Teleóginas caídas dos bezerros estábulados (três animais de raça holandesa), após a conclusão do ciclo parasitário foram, inicialmente, lavadas com água. Na capela de fluxo laminar vertical as teleóginas foram superficialmente esterilizadas segundo metodologia de Yunker (1987). Após, colocadas em placas de Petri e incubadas em estufa a 28 ºC e 80% de umidade relativa. Procederam-se os exames de hemolinfa e da massa ovígera de um grupo de 30 teleóginas. Gotas de hemolinfa, de cada teleógina, foram colhidas diariamente no período de um a 12 dias pós-repleção. Grupos de cinco ovos foram macerados, sendo removidas as cascas. As lâminas foram fixadas com álcool metílico e corado com May-Grünwald/Giemsa. Dos animais doadores de carrapato, realizou-se esfregaço de sangue, fixando com metanol e corado com May-Grünwald/Giemsa.

O exame de hemolinfa resultou positivo para a espiroqueta Borrelia spp. em seis teleóginas no 10º dia pós-repleção ( Figura 1A ). O exame dos ovos das teleóginas foi positivo do primeiro ao sexto dia após postura (Figura 1B). Nas preparações do sobrenadante do meio de cultura das células embrionárias de B. microplus, tanto nas preparações coradas e a fresco, foram encontradas espiroquetas (Figura 1C e 1D). Não identificou-se espiroqueta nos esfregaços de sangue dos bezerros doadores dos carrapatos. As culturas de células embrionárias de B. microplus foram observadas em microscópio de contraste de fase invertido, visualizando degeneração celular.

 

Somente na observação em contraste de fase, a espiroqueta mostrou-se alongada com muita mobilidade, embora sem espiras. Contudo o grupo das Borrelia spp. são mais pleomórficos do que Leptospira spp. e Treponema spp. (SMITH; ROGERS, 1998). Estas bactérias distinguem-se morfologicamente dos demais gêneros da família Spirochaetaceae por serem maiores, possuírem maior número de flagelos periplasmáticos e menor número de espiras (QUINN et al., 1994). Até o presente, não há registros de encontro de Borrelia spp. em cultivo de células de carrapatos infectado naturalmente. Ademais nenhum relato deste gênero no Estado de MS.

No Brasil são poucos relatos de achados de espiroquetas do gênero Borrelia spp. embora seja grande a distribuição geográfica tanto de hospedeiros vertebrados como invertebrados para este gênero. Embora, Martins et al. (1996), observaram B. theileri em exames de hemolinfa de uma fêmea de B. microplus. Fizeram identificação desta espiroqueta como B. theileri, que foi seguida dos achados de alguns autores e levando em consideração o carrapato vetor e as características morfológicas do organismo espiralado. A espiroquetose dos ruminantes é cosmopolita, ocorrendo em todas as regiões onde existem seus potenciais transmissores (VIVAS et al., 1996). A Replicação de B. theileri em carrapato B. microplus mostra ser maior, do que em sangue de bovinos (SMITH; ROGERS, 1998). Borrelia theileri é importante por infectar hospedeiros vertebrado e invertebrado podendo interferir na interpretação de dados experimentais e de diagnóstico sorológico, sendo provavelmente endêmico em populações de uma ou mais espécies de carrapato e seus hospedeiros do mundo todo (SMITH et al., 1978).

Crescimento de B. burgdorferi inoculadas em células de linhagem de Rhipicephalus sanguineus foi relatado por Kurtti et al. (1993). Ainda, Kurtti et al. (1993), relatam que o cultivo de tecidos de carrapatos pode contribuir para esclarecimento dos mecanismos de aderência celular, migração dentro do hospedeiro, mecanismos de transmissão e a interação da espiroqueta com células do hospedeiro. Ademais, espiroqueta não parece ser altamente específica, embora têm sido observadas diferenças em suas afinidades por células embrionárias de diferentes espécies de carrapatos (KURTTI et al. ,1993).

Com base na visualização da espiroqueta no carrapato vetor, sugere-se que o microrganismo encontrado pertence ao gênero Borrelia. É necessária uma caracterização morfogenética, para identificação da espécie. Foi possível também observar transmissão transovariana desta espiroqueta. Desta forma, as células embrionárias de B. microplus têm potencial para serem utilizadas como substrato para o cultivo de Borrelia spp.

Agradecimentos:-Ao Centro Nacional de Pesquisa Gado de Corte (CNPGC), ao Ronaldo Luiz da Silva, técnico do Laboratório de Ectoparasitologia da Sanidade Animal (CNPGC) pelo auxilio na manutenção de colônias de carrapato.

Recebido em 9 de janeiro de 2007.

Aceito para publicação em 18 de dezembro de 2007.

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• KRIEG, N.R.; HOLT, J.G. The espirochetes. In: KRIEG, N.R.; HOLT, J.G. In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 8 ed. London: Williams and Wilkins, 1984. v. 1, p. 38-70.
• MARTINS, J. R.; CORREA, B. L.; CERESER, V. H.; SMITH, R. D. Borrelia theileri: observação em carrapatos do gênero Boophilus microplus no município de Guaíba, RS, Brasil. Ciência Rural, v. 26, n. 3. p.447-450, 1996.
• QUINN, P.J.; CARTER, M.E.; MARKEY, B.K.; CARTER, G.R. Clinical Veterinary Microbiology London: Wolfe Publishing, 1994. p.292-303.
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• SMITH, R. D.; ROGERS, A.B. Borrelia theileri: A review. Journal of Spirochetal and Tick-borne Diseases, v. 5, n. 4, p. 63-68, 1998.
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• YUNKER, C.E. Arboviruses in arthropod cells in vitro Boca Raton: CRC Press, 1987. 35-51p.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  05 Mar 2012
• Data do Fascículo
  Mar 2008

Histórico

• Recebido
  09 Jan 2007
• Aceito
  18 Dez 2007