Impacto do sexo e das condições ambientais nas respostas do peixe-zebra à dor

RESUMO

JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS:

O peixe-zebra adulto (Danio rerio) tem sido proposto como uma alternativa simples e de baixo custo ao uso de roedores em pesquisas laboratoriais de novos compostos com potencial antinociceptivo. Este estudo teve como objetivo avaliar se há influência do sexo do animal e do ambiente de teste no comportamento nociceptivo orofacial do peixe-zebra adulto.

MÉTODOS:

Inicialmente, cinamaldeído, mentol, capsaicina, solução salina ácida ou glutamato foi aplicada nos lábios do peixe-zebra adulto masculino ou feminino. Grupos naive foram incluídos como controle. A nocicepção orofacial foi quantificada em termos de atividade locomotora. Em outra série de experimentos, foi avaliado se o aparato, aclimatação, período de teste, temperatura da água e cor do campo aberto alterariam a resposta nociceptiva ao cinamaldeído.

RESULTADOS:

O comportamento nociceptivo não dependeu do sexo do animal, do equipamento de teste, do horário em que o teste foi realizado ou da cor do campo aberto. No entanto, a aclimatação promoveu comportamento nociceptivo em animais naive e não alterou promoveu comportamento nociceptivo em animais naive e não alterou a resposta nociceptiva ao cinamaldeído (p<0,01 vs naive aclimatado). O comportamento nociceptivo foi verificado apenas quando o teste foi executado a uma temperatura de 26ºC (p<0,01 vs naive).

CONCLUSÃO:

Os resultados sugerem a necessidade de controlar o ambiente e a temperatura da água como fonte de variação ambiental durante o teste de comportamento nociceptivo do peixe-zebra adulto.

Descritores:
Dor; Meio ambiente; Nocicepção; Peixe-Zebra

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVES:

Adult zebrafish (Danio rerio) has been proposed as a low-cost and simple alternative to the use of rodents in laboratory research on novel compounds with antinociceptive potential. This study aimed to assess whether there is an influence of animal sex and the test environment on the orofacial nociceptive behavior of the adult zebrafish.

METHODS:

First, cinnamaldehyde, menthol, capsaicin, acidic saline, or glutamate was applied into the lips of the adult male or female zebrafish. Naive groups were included as control. The orofacial nociception was quantified in terms of locomotor activity. In other series of experiments, it was evaluated whether the apparatus, acclimatization, period of test, temperature of the water and color of the open field would alter the nociceptive response to cinnamaldehyde.

RESULTS:

The nociceptive behavior did not depend on the sex of the animal, apparatus, time the test was performed or the color of the open field. However, acclimatization promoted nociceptive behavior in naive animals and did not alter the nociceptive response to cinnamaldehyde (p<0.01 vs acclimatized naive). The nociception behavior was presented only when the test was performed at a temperature of 26ºC (p<0.01 vs naive).

CONCLUSION:

The results suggest the need to control the environment and water temperature as an environmental source of variation during the nociceptive behavior test of the adult zebrafish.

Keywords:
Environment; Pain; Nociception; Zebrafish

INTRODUÇÃO

A dor é considerada um estado afetivo negativo associado a lesões em tecidos e é importante aliviar a dor para melhorar tanto a condição humana quanto o bem-estar animal^1,2. Embora modelos de roedores sejam amplamente utilizados na pesquisa da dor translacional^3,4, outros modelos experimentais ajudam a avaliar os mecanismos evolutivamente conservados subjacentes à nocicepção e seus fenótipos comportamentais associados^5,6.

Já foi demonstrado que o peixe-zebra adulto (Danio rerio) é uma alternativa viável aos modelos de laboratório mais tradicionais utilizados na busca de novos compostos com potencial antinociceptivo⁷ com as vantagens de ter uma homologia significativa para o genoma humano e um custo relativamente menor em comparação com os roedores^7,8.

Entretanto, tanto quanto se sabe, não há estudos que avaliem a relação entre o ambiente de teste e o comportamento nociceptivo do peixe-zebra, bem como se há ou não interferência do sexo do animal. Sabe-se, por exemplo, que a temperatura da água altera a resposta convulsiva do peixe-zebra ao pentilenotetrazol⁹. O estudo¹⁰ demonstrou que a atividade locomotora das larvas de peixe-zebra é sensível à hora do dia e às condições de luz.

De acordo com outro estudo¹¹ sobre o neurocomportamento do peixe-zebra, o sexo muitas vezes não é relatado e o uso de modelos de roedores tanto quanto de modelos novos (peixe-zebra) pode contribuir para a compreensão dos mecanismos que ligam o sexo ao cérebro e ao comportamento. Já foi demonstrado que a resposta nociceptiva corneana induzida pela solução salina hipertônica no peixe-zebra adulto é independente do sexo do animal¹². Os autores¹³ também relataram que não houve interferência do sexo na resposta nociceptiva ao ácido acético administrado nos lábios do peixe-zebra. Entretanto, tanto a solução salina hipertônica quanto o ácido acético promovem o comportamento nociceptivo por meio de mecanismos não específicos.

Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar se existe uma influência do sexo do animal e do ambiente de teste no comportamento orofacial nociceptivo do peixe-zebra adulto.

MÉTODOS

Peixe-zebra selvagem adulto (Danio rerio) de ambos os sexos, fenótipo de barbatana curta, com 60-90 dias, tamanho (3,5±0,5cm) e peso (0,3±0,2g), semelhantes obtido da Agroquímica: Comércio de Produtos Veterinários LTDA (Fortaleza, Ceará, Brasil). Grupos de 50 peixes foram aclimatados por 24h em um tanque de vidro 10-L (30x15x20cm) contendo água de torneira sem cloro (ProtecPlus^®) e bomba de ar com filtro submerso a 25°C e pH 7,0, em ritmo circadiano quase normal (14:10h de luz/escuro). Os peixes receberam ração ad libitum 24h antes das experiências.

AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DO SEXO NO COMPORTAMENTO OROFACIAL NOCICEPTIVO DO PEIXE-ZEBRA ADULTO

Comportamento nociceptivo orofacial induzido por cinamaldeído

A nocicepção orofacial foi induzida por cinamaldeído (TRPA1 - canal receptor de potencial transitório catiônico subfamília A membro 1 - agonista específico; 0,66 µg/mL; 5,0 µL) injetado nos lábios dos animais (macho e fêmea; n=8/grupo), 30 min após pré-tratamento com solução salina (20,0µL). Grupos naive (macho e fêmea, n=8/cada) foram incluídos como controle. Os animais foram então colocados em uma placa de Petri de vidro (10x15cm) dividida em quadrantes e a resposta nociceptiva foi quantificada em termos de atividade locomotora (número de linhas de cruzamento) realizada durante 0 - 5 min.

Comportamento nociceptivo orofacial induzido por mentol

A nocicepção orofacial foi induzida por mentol (TRPM8 - canal receptor de potencial transitório catiônico subfamília M membro 8 - agonista; 1,2mM; 5,0µL) injetado nos lábios dos animais (macho e fêmea; n=8/grupo) 30 min após pré-tratamento com solução salina (20,0µL). Grupos naive (macho e fêmea, n=8/cada) foram incluídos como controle. O comportamento nociceptivo foi quantificado em termos de atividade locomotora (número de linhas de cruzamento) realizada durante 0 - 10 min.

Comportamento nociceptivo orofacial induzido por capsaicina

A nocicepção orofacial foi induzida por capsaicina (TRPV1 - canal receptor de potencial transitório catiônico subfamília V membro 1 - agonista; 40,93µM; 5,0µL), dissolvida em etanol, PBS (tampão fosfato-salino) e água destilada (1:1:8) injetada nos lábios dos animais (macho e fêmea; n=8/grupo) 30 min após pré-tratamento com solução salina (20,0µL). Grupos naive (macho e fêmea, n=8/cada) foram incluídos como controle. O comportamento nociceptivo foi quantificado em termos de atividade locomotora (número de linhas de cruzamento) realizada durante 10 - 20 min.

Comportamento nociceptivo orofacial induzido por solução salina ácida

A nocicepção orofacial foi induzida por solução salina ácida (ASIC - canais iônicos sensíveis a ácidos - agonista; 0,1%; 5,0µL) injetado nos lábios dos animais (macho e fêmea; n=8/grupo) 30 min após pré-tratamento com solução salina (20,0µL). Grupos naive (macho e fêmea, n=8/cada) foram incluídos como controle O comportamento nociceptivo foi quantificado em termos de atividade locomotora (número de linhas de cruzamento) realizada durante 10 - 20 min.

Comportamento nociceptivo orofacial induzido por glutamato

A nocicepção orofacial foi induzida por glutamato (receptor NMDA - N-metil-D-aspartato - agonista; 12,5mM; 5,0µL) injetado nos lábios dos animais (macho e fêmea; n=8/grupo) 30 min após o pré-tratamento com solução salina (20,0µL). Grupos naive (macho e fêmea, n=8/cada) foram incluídos como controle. O comportamento nociceptivo foi quantificado em termos de atividade locomotora (número de linhas de cruzamento) realizada durante 0 - 10 min.

AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DO AMBIENTE DE TESTE NO COMPORTAMENTO OROFACIAL NOCICEPTIVO DO PEIXE-ZEBRA ADULTO

Comportamento nociceptivo orofacial induzido por cinamaldeído

A nocicepção orofacial foi induzida com cinamaldeído (já descrito) injetado nos lábios dos animais (n=8/grupo), 30min após o pré-tratamento salino (20,0µL). Grupos naive (n=8/cada) foram incluídos como controle. O comportamento nociceptivo foi analisado como já descrito durante zero - 5 min nas seguintes condições:

• Teste realizado em placa de Petri (10x15cm) ou béquer (250mL); neste teste, grupos (n=8/cada);

• Teste realizado em placa de Petri com animais aclimatados ou não 24h antes dos experimentos;

• Teste realizado em placa de Petri com horários diferentes do experimento (manhã ou tarde);

• Teste realizado em placa de Petri com diferentes temperaturas da água: 22, 26 ou 30º C;

• Teste realizado em placa de Petri com fundo claro ou escuro.

Todo o procedimento experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Estadual do Ceará (CEUA-UECE; #7210149/2016).

Análise estatística

Os valores estão expressos como média± erro padrão da média (E.P.M.). Os dados obtidos foram avaliados por meios da análise de variância unidirecional (ANOVA), seguida pelo teste de Tukey. Em todos os casos, as diferenças foram consideradas significativas se p<0,05. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Prism Software Inc., San Diego, CA, EUA).

RESULTADOS

Cinamaldeído- (p<0,01 - p<0,001 vs naive), mentol- (p<0,05 vs naive), capsaicina- (p<0,001 - <0,0001 vs naive), solução salina ácida (p<0,0001 vs naive) e glutamato- (p<0,001 - p<0,0001 vs naive) induziram comportamento nociceptivo no peixe-zebra adulto e este efeito não foi dependente do sexo (Figura 1).

Figura 1
Comportamento nociceptivo orofacial induzido pelo cinamaldeído (CIN - A), mentol (MNT - B), capsaicina (CAP - C), solução salina ácida (AS - D) ou glutamato (GLU - E) em peixe-zebra adulto macho (M) e fêmea (F).

Os resultados são expressos como valores médios ± erro padrão. ANOVA seguida de Tukey. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 e **** p<0,0001 vs o respectivo grupo estimulado.

Influência do ambiente de teste sobre o comportamento orofacial nociceptivo do peixe-zebra adulto

O cinamaldeído induziu comportamento orofacial nociceptivo quando os animais foram testados em placa de Petri (p<0,05 vs naive) e béquer (p<0,01 vs naive), como descrito na figura 2. Houve resposta nociceptiva quando o teste foi realizado pela manhã (p<0,01 vs naive) ou pela tarde (p<0,05 vs naive), como mostrado na figura 3B.

Figura 2
Comportamento nociceptivo induzido por cinamaldeído (CIN) em peixe-zebra adulto macho e fêmea para teste realizado na placa de Petri (A) ou béquer (B).

Os resultados são expressos como valores médios ± erro padrão. ANOVA seguida de Tukey. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 e **** p<0,0001 vs o respectivo grupo estimulado.

Figura 3
Avaliação da interferência da aclimatação (A) e período do teste (B) sobre o comportamento nociceptivo induzido pelo cinamaldeído (CIN) em peixe-zebra adulto macho e fêmea.

Os resultados são expressos como valores médios ± erro padrão. ANOVA seguida de Tukey. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 e **** p<0,0001 vs o respectivo grupo estimulado.

Se os animais foram aclimatados ou não 24h antes do teste interferiu na resposta nociceptiva, já que os animais naive aclimatados mostraram comportamento nociceptivo (p<0,05) como o apresentado pelos peixes tratados com cinamaldeído (p<0,01) em comparação com os animais naive não aclimatados (Figura 3A).

A temperatura da água na qual foi possível verificar o comportamento nociceptivo foi de 26º C (p<0,0001 vs naive - Figura 4A). Não houve diferença na resposta quando o teste foi realizado em placas Petri com fundo branco (p<0,001 vs naive) ou preto (p<0,01 vs naive) (Figura 4B).

Figura 4
Avaliação da interferência da temperatura da água (A) e da cor do campo aberto (B) no comportamento nociceptivo induzido pelo cinamaldeído (CIN) no peixe-zebra adulto macho e fêmea.

Os resultados são expressos como valores médios ± erro padrão. ANOVA seguida de Tukey. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 e **** p<0,0001 vs o respectivo grupo estimulado.

DISCUSSÃO

O uso do peixe-zebra adulto como modelo animal de nocicepção provou-se eficiente como ferramenta para o estudo de novos alvos farmacológicos^14-19. A diminuição da atividade locomotora é um dos parâmetros da nocicepção no peixe-zebra⁵ e foi utilizada neste caso. Para promover a precisão na tradução dos resultados da pesquisa utilizando o peixe-zebra, várias particularidades da biologia deste devem ser consideradas⁹. Aqui, foi avaliado o efeito do sexo e mudanças no ambiente de teste no comportamento nociceptivo orofacial do peixe-zebra adulto.

Há poucos fatores de confusão no comportamento nociceptivo do peixe-zebra adulto, já que a aclimatação 24h antes do teste e a temperatura da água foram os únicos parâmetros que alteraram a resposta dos animais. Assim, como no peixe-zebra adulto, a temperatura do ambiente de teste é um fator chave na variação da resposta nociceptiva dos roedores^20,21.

Tem sido relatado que existe uma diferença entre a atividade locomotora do peixe-zebra macho e fêmea^22,23. Como o parâmetro de nocicepção utilizado foi a atividade locomotora, foi investigado se haveria interferência do sexo do animal no comportamento nociceptivo.

A influência do sexo no comportamento nociceptivo em modelos animais tem sido amplamente demonstrada e parece que as fêmeas têm hiperresponsividade, embora não haja diferença entre os sexos em algumas espécies de roedores²⁴. Aqui, uma relação entre o sexo do animal e a resposta nociceptiva, como relatado anteriormente, não foi verificada^12,13,25.

Os testes comportamentais utilizando peixe-zebra são baseados em confrontar o animal com um novo ambiente, experimentando o conflito entre o desejo de explorar a área/objeto desconhecido, a curiosidade e a motivação para evitar perigos potenciais^8,25. O comportamento nociceptivo não foi alterado pelo tamanho do aparelho, tempo ou cor da placa de Petri na qual o teste foi realizado.

O estudo²⁶ comparou a atividade locomotora do peixe-zebra adulto em dois campos abertos de tamanhos diferentes e constatou que a atividade locomotora foi maior na arena maior. Esperava-se que os animais testados no béquer mostrassem maior atividade locomotora do que os animais testados na placa de Petri. Tanto os animais testados no béquer quanto os testados na placa de Petri apresentaram comportamento nociceptivo. Embora o comportamento nociceptivo tenha sido mais significativo no béquer, não houve diferença entre os comportamentos apresentados no béquer e na placa de Petri.

Vários estudos têm analisado se a atividade locomotora de embriões e larvas de peixe-zebra é alterada em diferentes momentos do dia. Os autores²⁷ demonstraram que a atividade dos embriões e larvas era mais variável durante esses períodos, enquanto que a atividade era mais alta e menos variável à tarde. O estudo¹⁰ relatou maior movimento das larvas pela manhã. Entretanto, outros estudos²⁸ concluíram que a hora do dia não alterou sua atividade. Embora o peixe-zebra adulto seja conhecido por ser mais ativo pela manhã²⁹, não foi encontrada diferença entre as respostas nociceptivas do peixe-zebra adulto testado pela manhã e à tarde.

A cor de outros equipamentos usados na pesquisa neurocomportamental, incluindo redes e béqueres de tratamento, raramente é relatada na literatura e pode desempenhar um papel³⁰. O peixe-zebra tem visão colorida³¹ e sua fisiologia visual é geralmente como a dos mamíferos³², tornando o peixe-zebra uma ferramenta útil para estudar o impacto das cores no comportamento³⁰. Cores diferentes podem afetar a percepção subjetiva da dor³³, mas aqui, usando o parâmetro de cor em campo aberto, não houve diferença na resposta nociceptiva do peixe-zebra quando testado em campo aberto branco ou preto.

Foi mostrado anteriormente que o peixe-zebra adulto rapidamente demonstra (dentro de 5 min) o aprendizado de habituação no teste de campo aberto³⁴. A aclimatação induziu o comportamento nociceptivo no peixe-zebra naive como animais recebendo cinamaldeído. Os peixes não aclimatados apresentaram alta atividade locomotora, sugerindo a existência de mecanismos adaptativos no peixe-zebra que inibem a nocicepção em situações de ameaça e a liberam em situações de novidade ou expectativa³⁵.

O efeito nociceptivo é observado na temperatura da água de 26º C, enquanto, quando os animais são testados na temperatura da água de 22º e 30º C, não houve comportamento nociceptivo. Este resultado corrobora as conclusões anteriores⁹, confirmando a necessidade de manter a temperatura da água como fator determinante para o manejo do peixe-zebra, já que as variações na temperatura ambiental afetam fortemente a biologia dos peixes influenciando não somente o crescimento, mas também a reprodução, a atividade espontânea e o metabolismo³⁶.

CONCLUSÃO

Em resumo, os resultados sugerem a necessidade de controlar o ambiente e a temperatura da água durante o teste de comportamento nociceptivo do peixe-zebra adulto.

• Fontes de fomento: CAPES/FUNCAP, CNPq e Fundação Edson Queiroz.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  26 Abr 2021
• Data do Fascículo
  Jan-Mar 2021

Histórico

• Recebido
  09 Nov 2020
• Aceito
  28 Dez 2020