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Óxido nítrico y sistema cardiovascular: activación celular, reactividad vascular y variante genética

Resúmenes

El óxido nítrico (NO), primariamente identificado como un factor relajante derivado del endotelio, es un radical libre actuante en la señalización de diferentes procesos biológicos. La identificación de las isoformas de las sintasas del NO (NOS) y la subsecuente caracterización de los mecanismos de activación celulares de las enzimas posibilitaron tanto la comprensión de parte de las interacciones fisiológicas como la comprensión de parte de los mecanismos de enfermedad, en la cual el NO está envuelto. La isoforma endotelial de la NOS (eNOS), expresada principalmente en el endotelio vascular, desempeña importante papel en la regulación de la reactividad vascular y en el desarrollo y en la progresión de la aterosclerosis. Esta revisión tiene el propósito de contextualizar al lector sobre la estructura de la eNOS y sus mecanismos de activación celular. Teniendo en vista los avances de la biología molecular, trataremos aun de los conocidos mecanismos de regulación de la expresión génica y del papel de variantes en el código genético de la eNOS asociados a fenotipos cardiovasculares. Aunque se reconozca la importancia del NO como molécula ateroprotectora, nuestra atención estará volcada a la revisión de literatura envolviendo NO y su participación en la modulación del fenotipo de vasodilatación muscular.

Óxido nítrico; óxido nítrico sintasa tipo III; polimorfismo genético


O óxido nítrico (NO), primariamente identificado como um fator relaxante derivado do endotélio, é um radical livre atuante na sinalização de diferentes processos biológicos. A identificação das isoformas das sintases do NO (NOS) e a subsequente caracterização dos mecanismos de ativação celulares das enzimas possibilitaram tanto a compreensão de parte das interações fisiológicas como a compreensão de parte dos mecanismos de doença, na qual o NO está envolvido. A isoforma endotelial da NOS (eNOS), expressa principalmente no endotélio vascular, desempenha importante papel na regulação da reatividade vascular e no desenvolvimento e na progressão da aterosclerose. Esta revisão tem o propósito de contextualizar o leitor sobre a estrutura da eNOS e seus mecanismos de ativação celular. Tendo em vista os avanços da biologia molecular, trataremos ainda dos conhecidos mecanismos de regulação da expressão gênica e do papel de variantes no código genético da eNOS associados a fenótipos cardiovasculares. Embora se reconheça a importância do NO como molécula ateroprotetora, nossa atenção estará voltada à revisão de literatura envolvendo NO e sua participação na modulação do fenótipo de vasodilatação muscular.

Óxido nítrico; óxido nítrico sintase tipo III; polimorfismo genético


Nitric oxide (NO), primarily identified as an endothelium-derived relaxing factor, is a free radical that signals different biological processes. The identification of NO synthase (NOS) isoforms and the subsequent characterization of the mechanisms of cell activation of the enzymes permitted the partial understanding of both the physiological interactions and of the mechanisms of the diseases in which NO is involved. Mainly expressed in the vascular endothelium, the endothelial NOS isoform (eNOS) plays an important role in the regulation of vascular reactivity and in the development and progression of atherosclerosis. The purpose of this review is to contextualize the reader about the eNOS structure and its mechanisms of cell activation. In view of the advances in molecular biology, we will also address the known mechanisms of gene expression regulation and the role of variants on the genetic code of eNOS associated with cardiovascular phenotypes. Although the importance of NO as an atheroprotective molecule is recognized, our focus will be the review of the literature on NO and its participation in the modulation of the muscle vasodilatation phenotype.

Nitric oxide; nitric oxide synthase type III; polymorphism; genetic


ARTÍCULO DE REVISIÓN

Óxido nítrico y sistema cardiovascular: activación celular, reactividad vascular y variante genética

Rodrigo Gonçalves DiasI,II; Carlos Eduardo NegrãoI; Marta Helena KriegerII

IInstituto do Coração - InCor (HCFMUSP), São Paulo, SP

IILabcardio - Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), Campinas, SP - Brasil

Correspondencia Correspondencia: Rodrigo Gonçalves Dias Unidade de Hipertensão - Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular Av. Dr. Enéas de Carvalho Aguiar, 44 (2º andar; Bloco II) - Cerqueira César 05403-000 - São Paulo, SP - Brasil E-mail: diasrg99@yahoo.com.br

RESUMEN

El óxido nítrico (NO), primariamente identificado como un factor relajante derivado del endotelio, es un radical libre actuante en la señalización de diferentes procesos biológicos. La identificación de las isoformas de las sintasas del NO (NOS) y la subsecuente caracterización de los mecanismos de activación celulares de las enzimas posibilitaron tanto la comprensión de parte de las interacciones fisiológicas como la comprensión de parte de los mecanismos de enfermedad, en la cual el NO está envuelto. La isoforma endotelial de la NOS (eNOS), expresada principalmente en el endotelio vascular, desempeña importante papel en la regulación de la reactividad vascular y en el desarrollo y en la progresión de la aterosclerosis. Esta revisión tiene el propósito de contextualizar al lector sobre la estructura de la eNOS y sus mecanismos de activación celular. Teniendo en vista los avances de la biología molecular, trataremos aun de los conocidos mecanismos de regulación de la expresión génica y del papel de variantes en el código genético de la eNOS asociados a fenotipos cardiovasculares. Aunque se reconozca la importancia del NO como molécula ateroprotectora, nuestra atención estará volcada a la revisión de literatura envolviendo NO y su participación en la modulación del fenotipo de vasodilatación muscular.

Palabras clave: Óxido nítrico, óxido nítrico sintasa tipo III, polimorfismo genético.

Introducción

La evidencia primaria de que el endotelio es un componente indispensable en la regulación del tono vascular surgió cuando análisis experimentales demostraron que, en la ausencia de esa monocapa de epitelio pavimentoso, la vasodilatación inducida por la acetilcolina no ocurría. En aquel momento, Furchgott y Zawadzki1 documentaron que, cuando era estimulado, el endotelio era capaz de liberar una sustancia vasoactiva que fue denominada factor relajante derivado del endotelio (EDRF, del inglés endothelium-derived relaxing factor). Pasados algunos años, el EDRF fue identificado por Ignarro et al2 como el óxido nítrico (NO), un compuesto caracterizado en 1977 por Ferid Murad que, cuando liberado por nitratos, causaba relajación en células musculares lisas. Ese contexto le valió a Robert F. Furchgott, Ferid Murad y Louis J. Ignarro el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1998 (fig. 1). Una serie de estudios fue responsable por la caracterización de que el endotelio libera otros EDRF como la prostaciclina (PGI2) y el factor hiperpolarizante derivado del endotelio (EDHF, del inglés endothelium-derived hyperpolarizing factor), además de factores constritores derivados del endotelio (EDCF, del inglés endothelium-derived contracting factors), como la endotelina (ET-1), productos de la vía de la ciclooxigenasa como el tromboxano A2 (TXA2) y especies reactivas de oxígeno como el anión superóxido (O2.-)3. Esos descubrimientos asociados a la caracterización del endotelio como un sensor biológico capaz de detectar cualquier estímulo mecánico, físico o químico - y responder a él - lo elevó al puesto de un tejido multifuncional que desempeña importante papel en la homeostasia de todos los sistemas fisiológicos.


Óxido nítrico y sistema cardiovascular

El NO, una molécula gaseosa actuante en la señalización de diferentes procesos biológicos, es un radical libre que presenta un electrón desemparejado en la última capa y una vida media de 4 a 8 segundos en medio acuoso oxigenado4,5. Descripto como un gas lábil, capaz de libre difusión en las membranas celulares, tal característica colabora con su alta actividad biológica6. El reconocimiento de que el endotelio vascular es un órgano activo y que su integridad favorece efectos benéficos, como acción antioxidante, antiinflamatoria, anticoagulante, profibrinolítica, inhibitoria de la adhesión y migración de leucocitos, inhibitoria de la proliferación y migración de las células musculares lisas, inhibitoria de la agregación y adhesión plaquetaria, vino a ampliar aun más las múltiples acciones del NO7. Así, ese escenario ateroproctetor es caracterizado por una armonía entre sustancias liberadas por el endotelio, en el cual el NO es citado como uno de los compuestos vasoactivos de mayor relevancia. Caracterizado como un desorden sistémico que antecede a la aterosclerosis y sus complicaciones, la disfunción endotelial en arterias coronarias ateroscleróticas fue inicialmente demostrada por Ludmer et al8 y, después, relacionada a la alteración en la biodisponibilidad del NO9.

En la actual literatura, hay concordancia de que la reducida actividad biológica de NO, causada tanto por la reducción en la síntesis como por el aumento de la degradación por el estrés oxidativo, ha sido identificada como el mecanismo de mayor relevancia en el proceso multifactorial en la disfunción endotelial y en la participación de las principales disfunciones cardiovasculares10. Así, la reducción en la biodisponibilidad del NO y la consecuente disfunción endotelial determinan, en el ambiente vascular, el desencadenamiento de eventos como alteraciones en el tono, disfunciones trombóticas, proliferación y migración de células musculares lisas (CML), y adhesión de leucocitos11. En la disfunción endotelial, ocurre también el aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO)12, y estas pueden reducir la disponibilidad de NO endotelial por diferentes vías: inactivación directa del NO por superóxido, con formación de peroxinitrito (ONOO-)13; reducción en la expresión y en la actividad de las sintasas del NO, por causa de los cambios en sus sustratos o cofactores, y en el aumento de los niveles de dimetilarginina asimétrica (ADMA)14; y, aun, desacoplamiento de la NOS endotelial causado por la oxidación aumentada de tetraidrobiopterina (BH4)15.

El entendimiento de la complejidad de la función endotelial y la dificultad de estudiar cada uno de sus componentes aisladamente vienen siendo superados. En ese contexto, modelos animales capaces de reproducir una disfunción endotelial fueron desarrollados, posibilitando, por ejemplo, el funcionamiento del sistema en condiciones de baja o aumentada biodisponibilidad de NO. Además de eso, estudios in vivo en humanos, a través de la infusión intraarterial de compuestos con potencial de modular la función endoteliodependiente o endotelioindependiente, posibilitaron la investigación de los mecanismos moduladores de la función vascular en las diferentes condiciones fisiológicas y enfermedades de mayor prevalencia.

Sintasas de óxido nítrico

La producción enzimática del NO a partir del aminoácido L-arginina es mediada por una familia de tres sintasas de óxido nítrico (NOS), codificadas por genes distintos16. Las isoformas comparten 50%-60% de homología en la secuencia de aminoácidos, en los dominios oxidasa y reductasa17. Esas isoformas exhiben características distintas que reflejan sus funciones específicas in vivo18.

La sintasa endotelial del óxido nítrico (eNOS o NOS III; 7q35-36) y la sintasa neuronal del óxido nítrico (nNOS o NOS I; 12q24.2) poseen mecanismo de activación constitutivo (cNOS). La isoforma inducida (iNOS o NOS II; 17cen-q12) se encuentra expresada en procesos celulares anormales como en la insuficiencia cardíaca19, inducidas por citoquinas y agentes inflamatorios, lo que resulta en alto flujo de NO20,21. La eNOS, encontrada principalmente en las células endoteliales en compartimientos denominados caveolas22, es esencial para la manutención del tono vascular basal. Ese tono es, en parte, mediado por la síntesis del NO, un compuesto vasoactivo participante en la regulación del flujo sanguíneo en los diversos lechos vasculares y, particularmente, en el flujo sanguíneo coronario23. La ubicación subcelular de la síntesis de NO ejerce gran influencia en su actividad biológica. En la década de 1990, la identificación inicial de la ubicación de la eNOS en la caveola, en la membrana plasmática de las células, proveyó la base estructural para el reconocimiento de la compartimentación en los mecanismos de señalización celular promovido por el NO. La subsecuente observación de que la eNOS interactúa directamente con las proteínas estructurales de la caveola, las caveolinas, proveyó la evidencia bioquímica de la interacción entre eNOS y caveola y su implicación con numerosas moléculas de señalizaciones concentradas en ese ambiente de la membrana celular24. Un gran número de evidencias reveló que las caveolas son capaces de reclutar numerosas moléculas de señalización y regular sus actividades en vez de servir como simple soporte para el intercambio y el transporte celulares25. Así, fue descripto que la eNOS se ubica dentro de la caveola y es mantenida en un estado menos activo por medio de su interacción con la caveolina-126.

Estructura de la eNOS

La eNOS funciona como un dímero, constituida de dos monómeros idénticos, que, a su vez, pueden ser divididos funcional y estructuralmente en dos dominios principales: un dominio C-terminal reductasa, homólogo al citocromo P450 y que contiene sitios de ligazón para NADPH, flavina mononucleótido (FMN) y flavina adenina dinucleótido (FAD), y un dominio N-terminal oxidasa, que abstrae un electrón del sustrato L-arginina y posee sitios de ligazón para el hierro heme, para el cofactor tetraidrobiopterina (BH4) y para la L-arginina20,21,27 (fig. 2). La reacción de catálisis de las NOS constitutivas envuelve dos niveles de oxidación: la hidroxilación de la L-arginina en NG-hidroxi-L-arginina, seguida de la oxidación de este intermediario con utilización de un electrón de la NADPH, formando L-citrulina y NO28. Esa reacción consume 1,5 mol de NADPH y 2 mols de oxígeno por mol de L-citrulina formada16,29,30. Cofactores como hierro heme, BH4 y L-arginina han sido particularmente estudiados, y la baja biodisponibilidad de estos induce al fenómeno de la eNOS disfuncional31-33. El hierro heme es esencial para la dimerización de las tres isoformas34, bajas concentraciones o ausencia de L-arginina catalizan la reducción del oxígeno en superóxido (O2.-)35, y niveles disminuidos de BH4 llevan a la producción simultánea de NO y O2.-, productos que reaccionan entre si formando peroxinitrito (ONOO-)36.


Regulación de la expresión génica y de la actividad de la eNOS

Una vez verificado que las células endoteliales contienen una concentración basal de la proteína eNOS, el gen de la eNOS fue considerado constitutivamente expresado. Es interesante que, estudios posteriores demostraron que concentraciones estables del mRNA son sujetas a un modesto nivel de regulación37. La región promotora del gen de la eNOS fue clonada, demostrando poseer un complejo mecanismo de regulación de la expresión génica. Semejante a la región promotora de genes constitutivamente expresados, la región promotora del gen de la eNOS no contiene la secuencia TATA Box. Mientras tanto, posee múltiples secuencias DNA cis-regulatorias, incluyendo CCAT box, sitios Sp1, GATA motifis, CACCC box, sitios AP-1 y AP-2, región de ligazón p53, elementos NF-1, además de secuencias responsivas a elementos esteroles y shear stress38. Las secuencias promotoras humana y bovina presentan 75% de homología, sugiriendo una alta conservación evolutiva de la regulación transcripcional del gen. Ubicados en la región promotora proximal, los dominios regulatorios positivos I y II (PRD I y PRD II) están envueltos en la regulación basal de la transcripción génica, presentando afinidad por los factores de transcripción Sp-1, Sp-3, Ets-1, Elf-1, YY1 y proteína MYC-associatedzinc finger39. Estudios in vitro demostraron que la responsividad del promotor de la eNOS al shear stress es dependiente de secuencias ubicadas entre -1.000 y -975, región relativa a la inicialización de la transcripción40,41. Además de eso, la ligazón de las subunidades p50 y p65 del NF-κβ al elemento responsivo GAGACC (-990; -984), ubicado anteriormente al sitio de inicialización de la transcripción, está envuelta en la activación del promotor por el shear stress42. Y aun, la transcripción en células endoteliales bovina sometidas a flujo laminar presentó aumento de 9 veces del mRNA. Ese efecto fue mediado por dos mecanismos distintos: 1. aumento transiente de la transcripción del gen y 2. subsecuente vida media prolongada del mRNA43.

El mecanismo de activación de la eNOS ha sido descripto como el más elaborado de las tres isoformas, reflejando la complejidad del control fisiológico de los diferentes lechos vasculares17,44.El mecanismo clásico de activación de las isoformas constitutivas es dependiente del calcio (Ca++), mientras que la iNOS es independiente de la elevación de las concentraciones intracelulares de Ca++, debido a alta afinidad de la ligazón de la enzima con la calmodulina31,39,44.

La complejidad de los mecanismos de regulación post transcripcionales de la eNOS ha sido considerada, tanto como consecuencia de la dimerización de las subunidades de la proteína como en función del papel de la proteína caveolina en la formación de la estructura caveolar45. La eNOS se ubica dentro de la caveola y es mantenida en un estado menos activo por su interacción con la caveolina-126. Los mecanismos de migración de la membrana celular para el complejo de Golgi y las fosforilaciones Akt, PKA y AMPK-quinasa dependientes son descriptos como responsables por la activación de esa isoforma de la EN LOS. Así, la interacción mantiene la eNOS inactiva, y la calmodulina actúa directamente, compitiendo con la caveolina, para promover la activación calcio-dependiente de la enzima15. La actividad de la eNOS es bien conocida en el ambiente vascular y es regulada por seis mecanismos después de su traducción: inclusión de lípidos, mecanismo calcio/calmodulina dependiente, interacciones directas proteína-proteína, diferentes fosforilaciones sitio dirigidas, glucosilación y disponibilidad de substratos y cofactores. Así, la eNOS puede interactuar con varias proteínas en sus estados "menos activos" o "más activos". Son requeridas etapas de N-meristolación y palmitación de la eNOS ligada a plamalema, que, en este estado, se encuentra asociada a caveolina-1 y a HSP 90. La proteína que hace interacción con la HSP70, denominada "CHIP", interactúa con ambas HSP70 y HSP90, y regula negativamente el tráfico de la eNOS para el complejo de Golgi, en contraste con la "NOSIP" y "NOSTRIN" que pueden regular negativamente la ubicación de la eNOS en la membrana plasmática. El principal mecanismo de activación de la eNOS se da por la fosforilación del aminoácido serina en la posición 117746 por la enzima Akt-quinasa (o proteína quinasa B), lo que aumenta la sensibilidad de la eNOS a las concentraciones basales de Ca++/calmodulina47. La activación tónica o fásica de la eNOS en respuesta al flujo sanguíneo es independiente de las alteraciones en la concentración del Ca++ y se constituye del shear-stress. Dimmeler et al48 demostraron que el intercambio del residuo de serina1177/1179 por el aminoácido alanina vuelve a la eNOS incapaz de responder a la fosforilación y activación por la enzima Akt, una vía dependiente de fosfatidilinositol-3 quinasa (PI-3K). Aunque la fosforilación del residuo de serina1177 desempeñe un papel preponderante en la activación enzimática de la eNOS, es sabido que su regulación también depende del estándar de fosforilación de otros sitios actualmente bien caracterizados49. La fosforilación del residuo de serina633, ubicado en el dominio de ligazón de la flavina mononucleótido (FMN), también aumenta la actividad de la eNOS y parece ser particularmente importante en la manutención de la síntesis de NO después de la activación por Ca++/calmodulina y fosforilación del residuo de serina1177. Fosforilado por la proteína quinasa C (PKC), el residuo de treonina495 interfiere con el dominio de ligazón de la calmodulina, regulando negativamente la síntesis del NO.

Recientes estudios han evaluado la capacidad de determinados fármacos en la reducción de la disfunción endotelial, como los antioxidantes y bloqueadores del sistema renina-angiotensina, por medio de los mecanismos de activación de la eNOS vía fosforilación del sitios específicos como el residuo de serina1177. Esa fosforilación puede ser afectada por la ubicación subcelular de la enzima, tales como caveola, uniones intercelulares, complejo de Golgi y compartimientos citosólicos, así como por quinasas proteicas y fosfatasas asociadas a esas estructuras. Recientemente, nuestro grupo50 demostró que el Telmisartan, bloqueador del receptor de angiotensina II, promueve reducción de la disfunción endotelial por medio de la activación de la eNOS vía fosforilación de sitios específicos, como el residuo de serina1177 y serina635.

Óxido nítrico, tono vascular y vasodilatación muscular

Después de la verificación de que el NO es sintetizado por las células endoteliales y que participa de la regulación hemodinámica cardiovascular, el interés comenzó a concentrarse en la cuantificación de su participación en la homeostasia de ese sistema. Estudios in vivo en individuos sanos demostraron que la administración intraarterial de NG-monometil-L-arginina (L-NMMA), un bloqueador inespecífico de la actividad de las NOS, reduce el flujo sanguíneo local entre 25% y 50%51. Aunque el tono vascular basal sea el producto de las fuerzas constrictoras versus fuerzas vasodilatadoras, esos resultados demuestran que el NO es, por lo menos en parte, el modulador del fenotipo en cuestión.

Durante condiciones de estrés mental y ejercicio, es observado, juntamente con la respuesta taquicárdica y el aumento de la presión arterial, vasodilatación en lecho muscular esquelético como parte de las respuestas fisiológicas de ajuste del organismo. Fue postulado que parte de esa respuesta vasodilatadora muscular sería modulada por un componente neural, lo que quedó evidente posteriormente por la existencia de fibras simpáticas colinérgicas para la musculatura esquelética de algunas especies de mamíferos, con excepción de primates y humanos. Se verificó que la estimulación eléctrica del nervio simpático provocaba vasodilatación en lecho muscular humano cuando la liberación presináptica de noradrenalina era inhibida por la infusión intraarterial de fármacos. Mientras tanto, esa respuesta vasodilatadora se mostró atenuada cuando un antagonista muscarínico fue administrado52,53. Posteriormente, quedó evidente que el NO se constituye, por lo menos en parte, como el modulador de la respuesta vasodilatadora verificada cuando fibras simpáticas colinérgicas son estimuladas54. De hecho, Blair et al55 ya habían evidenciado que, en humanos, la vasodilatación en el antebrazo, durante maniobras fisiológicas, es mediada por un componente neural. Durante la aplicación del estrés mental, el flujo sanguíneo en el miembro simpatectomizado no se alteraba, cuando era comparado al flujo sanguíneo en el miembro control. Además de eso, la infusión intraarterial de atropina en el miembro control reducía en aproximadamente 50% el aumento en el flujo sanguíneo. En aquel momento, utilizando las evidencias indirectas, los autores sugirieron la existencia de inervación simpática colinérgica para la musculatura esquelética de humanos. Mimetizando los experimentos en animales, más tarde los estudios de Dietz et al56,57 dejaron evidente que parte de la respuesta vasodilatadora muscular, medida en el antebrazo, durante el estrés mental o el ejercicio es atenuada con la administración intraarterial del L-NMMA. Los mecanismos por los cuales la acetilcolina y el NO son sintetizados y liberados durante las reacciones de defensa del organismo no están completamente elucidados en humanos. Las evidencias alcanzadas con bloqueos farmacológicos permiten apenas sugerir la existencia de fibras simpáticas colinérgicas para la musculatura esquelética. En consecuencia de tales limitaciones, los autores no descartan la posibilidad de que la vasodilatación sea causada por una combinación entre factores circulantes y locales. Una pequeña parte de las células endoteliales podría sintetizar y liberar acetilcolina58. Además de eso, la activación de receptores β2-adrenérgicos ubicados en el músculo liso vascular resultaría en la relajación de ese tejido y, en consecuencia, en la vasodilatación. Mientras tanto, Majmudar et al59 verificaron que parte de la vasodilatación resultante de la activación de los β2-adrenoceptores es mediada por el NO. Aunque los autores no expliquen el mecanismo responsable por ese fenómeno, aproximadamente 25% de la vasodilatación observada en el antebrazo con la infusión de Ritodrine (agonista selectivo β2-adrenérgico) fue atenuada con la confusión de L-NMMA. Esos resultados sugieren la existencia de los β2-adrenoceptores en el endotelio vascular, contribuyendo al aumento de la actividad de la eNOS. Además de eso, el aumento de la estimulación mecánica del endotelio vascular resultaría en síntesis aumentada de EN EL, vía PI-3K-Akt quinasa, con subsecuente fosforilación del residuo de serina1177.

Polimorfismos de la eNOS y estudios funcionales de la variante G894T

Genotipada y secuenciada en 1993 por Marsden et al38 (GenBank D26607), la eNOS está ubicada en el cromosoma 7q35-36, y variaciones en su secuencia han sido descriptas en la región promotora, exones e intrones27. El gen (21-22 kbp) comprende 26 exones y 25 intrones con 133 kDa. La secuencia polipeptídica generada contiene 1.203 aminoácidos38. Ya está descripta en la literatura la existencia de tres polimorfismos de un único nucleótido (SNP) en la región promotora, en localizaciones de no ligazón de factores de transcripción39. En los intrones 2, 11, 12, 18, 22 y 23, fueron encontrados SNP60 y polimorfismos de secuencias repetidas en los intrones 2, 4, 8 y 1338,61. De los polimorfismos encontrados en los exones 6 y 7, la sustitución de la base nitrogenada guanina por timina (GT), en la posición 894 ubicada en el exón 7, resulta en la sustitución del aminoácido glutamato (GAG) por aspartato (GAT) en la posición 298 de la secuencia polipeptídica62. Se sugiere que los polimorfismos ubicados en la región promotora del gen desempeñan influencia en la transcripción del RNAm, mientras que los polimorfismos ubicados en regiones codificadoras pueden resultar en alteración de actividad enzimática63.

El residuo 298 está ubicado externamente en el dominio oxidasa de la enzima, sitios de ligazón para L-arginina o BH4. Estudios enzimáticos que utilizaron eNOS recombinante mostraron que no hay diferencia en la constante de Michaelis (km) ni en la Vmáx. entre las dos formas de la enzima63. Aunque la actividad enzimática parezca no ser afectada por la forma Asp298 de la enzima, Tesauro et al64 mostraron que esa variante presenta mayor susceptibilidad al clivaje proteolítico en fragmentos de 100 y 35 KDa, precisamente en la posición Asp298-Pro299, cuando es comparada a la variante Glu298. Mientras tanto, Fairchild et al65 demostraron que tal susceptibilidad proteolítica ocurría por causa de un artefacto de la preparación del experimento. La inconsistencia de esos resultados no excluye la posibilidad de que, in vivo, un desconocido mecanismo proteolítico, o hasta aun una alteración en la regulación post transcripcional, pueda estar siendo modulado por la variante Asp298 de la enzima.

Asociación de la variante G894T del gen de la eNOS con fenotipos cardiovasculares

Diversas enfermedades han sido asociadas a anormalidades en la biosíntesis del NO, y muchas de esas condiciones están relacionadas a la disfunción autonómica. Estudios en genética poblacional han demostrado importante asociación del polimorfismo G894T del gen de la eNOS con enfermedad arterial coronaria (EAC)66-68 y también con el espasmo coronario inducido por acetilcolina (Ach)69. Entre las disfunciones cardiovasculares, fue aun verificado que la variante G894T se encuentra asociada a la hipertensión arterial70,71, aunque esa asociación no haya sido verificada en otras poblaciones72,73.

La correlación entre genotipo y fenotipo clínico varía cuantitativa y cualitativamente, y la inconsistente asociación entre el polimorfismo de la eNOS y varios fenotipos clínicos es un fenómeno frecuentemente observado en otros genes asociados la fenótipos27. Esa inconsistencia ha sido atribuida a factores ambientales, alelos independientes, interacción entre genes y variabilidades en fenotipos clínicos. La importancia de los factores ambientales en la génesis de enfermedades se refleja en las diferencias de morbilidad y mortalidad entre grupos genéticamente homogéneos, aunque con estilos de vida diferentes.

Una variación genética puede no ser relevante a una determinada población, reflejando diferencias en la frecuencia de la distribución de los alelos. Un ejemplo de eso es la frecuencia del alelo 894T que es significativamente mayor en poblaciones blancas cuando es comparado a la población japonesa23. La inconsistente asociación entre el polimorfismo de la eNOS y las alteraciones vasculares aun ha sido atribuida a la variación en la distribución de la eNOS en diferentes órganos. Arterias de órganos específicos son sujetas a diferentes presiones hemodinámicas, determinando la respuesta de la pared del vaso y el consecuente grado de disfunción endotelial27.

Philip et al62 observaron, en pacientes sometidos a cirugía de revascularización, que la reactividad vascular a la infusión de fenilefrina (PE) es influenciada por la variante G894T del gen de la eNOS. La respuesta vasoconstrictora dosis-dependiente a la PE fue significativamente mayor para los alelos TT y GT, cuando fue comparada al grupo homocigoto GG, indicando que la reactividad vascular a las drogas vasoconstrictoras puede ser influenciada por el polimorfismo de la eNOS en humanos. La mayor respuesta dosis-dependiente de los pacientes con la variante 894T sugiere una reducida biosíntesis del NO. La administración sistémica de NG-nitro-L-arginina metil ester (L-NAME) provoca hipertensión en humanos74,75. Según Frandsenn et al76, la administración de 4 mg/kg de L-NAME en humanos reduce en 67% la actividad de la eNOS. La posible biodisponibilidad reducida del NO, en consecuencia de las variaciones en el gen de la eNOS, es un importante candidata para la susceptibilidad al desarrollo de la disfunción endotelial62,63 y a la alteración de la modulación de la actividad nerviosa simpática sobre el vaso77.

Las investigaciones que demostraron asociación de la variante G894T del gen de la eNOS con fenotipos cardiovasculares señalan una posible reducción de la biodisponibilidad del NO, sugiriendo que la eNOS transcripta del alelo mutante presenta actividad enzimática alterada. La falta de evidencias sobre este racional nos incentivó a testear la funcionalidad de la variante genética en el fenotipo de vasodilatación muscular78. Si la variante G894T del gen de la eNOS fuese capaz de disminuir la actividad enzimática, individuos portadores del alelo mutante (T) presentarían menor aumento del flujo sanguíneo muscular en respuesta al ejercicio isométrico de handgrip. Para testear tal hipótesis, 287 individuos fueron genotipados, y, entre ellos, se seleccionaron 33 sanos para representar tres genotipos: GG (wild-type), GT y TT. Como resultado, la atenuada vasodilatación muscular refleja al ejercicio ocurrió apenas en el genotipo TT, una vez que la vasodilatación entre los heterocigotos (genotipo GT) fue similar a aquella observada entre los individuos homocigotos para el alelo G (genotipo GG). Esos resultados sugieren que la presencia del alelo G es lo suficiente para superar la posible deficiencia del alelo T. Análisis subsecuentes in vivo comprobaron que la atenuada vasodilatación muscular observada en el genotipo TT es consecuencia de la reducida vasodilatación mediada por la eNOS, una vez que la infusión intraarterial de L-NMMA no alteró la respuesta vasodilatadora al ejercicio en ese genotipo. En contraste, el L-NMMA redujo de forma significativa la respuesta vasodilatadora al ejercicio en el genotipo GG, para valores similares a los del genotipo TT. Además de eso, nuestro estudio demostró que la atenuada vasodilatación muscular observada en el genotipo TT no puede ser acreditada a un posible tono simpático vasoconstrictor aumentado. De hecho, la actividad nerviosa simpática muscular, medida directamente en el nervio fibular por la técnica de microneurografía, aumentó de forma semejante entre los genotipos durante el ejercicio. Aunque esos resultados no confirmen la funcionalidad del alelo T en la alteración de la actividad enzimática (esa variante puede estar en desequilibrio de ligazón con otra variante funcional en el mismo gen o en un gen próximo en el mismo cromosoma), pueden ser utilizados como un marcador de la disfunción observada del fenotipo de vasodilatación muscular. Esta es la primera demostración de que la variante G894T del gen de la eNOS está funcionalmente asociado a la reducida vasodilatación mediada por la eNOS. Además de eso, tales resultados sugieren que la reducida vasodilatación endotelio-dependiente pueda anticipar una disfunción vascular en individuos portadores del genotipo TT.

Conclusión

La verificación de que las sintasas de NO son constitutivamente expresadas (eNOS y nNOS) y que el NO desempeña importante función en la regulación de las actividades cardiovasculares aumentó el interés por el entendimiento de los mecanismos celulares y moleculares que rigen su funcionalidad. Aunque esos mecanismos sean complejos y de difícil acceso, una parte de ellos ya fue elucidada, permitiendo parcial comprensión de la biología del NO. En ese contexto, los avances en las técnicas de biología molecular posibilitaron la identificación de variantes en el código genético humano que pudiesen explicar, por lo menos en parte, la variación de respuesta fenotípica entre individuos. Los estudios de asociación en genética no son fáciles de comprender. Un único gen puede desempeñar de media a moderada participación en la regulación de un fenotipo multigénico, y, en esa situación, una determinada variante genética funcional en ese gen podría explicar apenas una pequeña parte de la variación de respuesta del fenotipo. El rastreo de genes candidatos, o sea, la identificación de múltiples genes y sus respectivos polimorfismos desencadenantes de variaciones en la función cardiovascular, camina hacia el momento en que parte del diagnóstico y de la conducta adoptados para el tratamiento será basada en la medicina genómica.

Potencial Conflicto de Intereses

Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.

Fuentes de Financiamiento

El presente estudio fue financiado por la FAPESP.

Vinculación Académica

Este artículo es parte de tesis de Doctorado de Rodrigo Gonçalves Dias por la Universidad Estadual de Campinas e Instituto do Coração - InCor (HCFMUSP) de São Paulo.

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Artículo recibido en 12/02/09; revisado recibido en 26/06/09; aceptado en 14/08/09.

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  • Correspondencia:

    Rodrigo Gonçalves Dias
    Unidade de Hipertensão - Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular
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    05403-000 - São Paulo, SP - Brasil
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  • Fechas de Publicación

    • Publicación en esta colección
      04 Feb 2011
    • Fecha del número
      Ene 2011

    Histórico

    • Acepto
      14 Ago 2009
    • Revisado
      26 Jun 2009
    • Recibido
      12 Feb 2009
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