ESTUDO RADIOLÓGICO DE MEGACÓLON EM RATOS INFECTADOS POR TRYPANOSOMA CRUZI

RESUMO

Racional:

Pesquisas para doença de Chagas ainda utilizam diversos animais e o rato por seu tamanho e sua suscetibilidade foi o preferido por muitos pesquisadores.

Objetivo:

Desenvolver um modelo experimental de megacólon em ratos inoculados com a cepa Y de Trypanosoma cruzi.

Métodos:

Utilizou-se 30 ratos, machos, distribuídos em três grupos inoculados com diferentes inóculos: Grupo A: 600000, Grupo B: 1000000 e Grupo C: 1500000 tripomastigotas sanguíneos da cepa Y de T. cruzi. Os animais foram sedados via intramuscular no tempo zero de inoculação (T₀) e aos 60 dias após a inoculação (T₆₀) para realização de enema opaco para avaliação da dilatação dos diferentes segmentos do cólon em estudo comparativo das medidas obtidas, com o auxílio de um paquímetro digital. A comprovação da infecção foi realizada com esfregaço de sangue coletado a partir da cauda do animal 18 dias após a inoculação com observação das formas sanguíneas.

Resultados:

Ao comparar o diâmetro intestinal dos animais inoculados com 60.0000 formas tripomastigotas no T₀ de infecção com T₆₀ dias após a inoculação, observou-se dilatação significativa entre os segmentos proximal, medial e distal (p<0,01), indicando o estabelecimento do modelo de megacólon. Além disso, ao comparar o diâmetro intestinal entre os diferentes segmentos, dentro do T₀ de infecção e do T₆₀ após a inoculação, observou-se alterações significantes (p<0,05).

Conclusões:

O modelo proposto mostrou-se factível para estudos in vivo das alterações decorrentes da infecção pelo T. cruzi e alterações funcionais do cólon. Além disso, as alterações manifestadas no cólon não são diretamente proporcionais ao tamanho do inóculo, mas sim ao tempo de infecção que os animais foram submetidos, visto que os inoculados com 600000 formas sanguíneas foram as que mais apresentaram alterações significantes.

DESCRITORES:
Doença de Chagas; Trypanosoma cruzi; Megacólon; Enema opaco.

ABSTRACT

Background:

Researches on Chagas disease still use several animals and rats, due to size and susceptibility were preferred by many authors.

Aim:

To develop an experimental model of megacolon in rats inoculated with the strain Y of Trypanosoma cruzi.

Methods:

Thirty male Wistar rats were distributed in three groups inoculated with different inoculants: Group A: 600000, Group B: 1000000 and Group C: 1500000 blood trypomastigotes of T. cruzi. Animals were sedated intramuscularly at zero inoculation time (T₀) and 60 days after inoculation (T₆₀), to perform the barium enema in order to evaluate the dilatation of the different segments of colon in a comparative study of the measurements obtained, using a digital caliper. Evidence of infection was performed by blood smear collected from the animal’s tail 18 days after inoculation with observation of blood forms.

Results:

Comparing the intestinal diameter of the inoculated animals with 60,0000 trypomastigotes in the T₀ of infection with T₆₀ days after the inoculation, significant dilatation was observed between the proximal, medial and distal segments (p<0.01), indicating the establishment of the megacolon model. In addition, comparing intestinal diameter between the different segments, with in the T₀ of infection and the T₆₀ after inoculation, significant alterations were observed (p<0.05).

Conclusion:

The proposed model was possible for in vivo studies of alterations due to infection by T. cruzi and functional alterations of the colon. In addition, the changes manifested in the colon are not directly proportional to the size of the inoculum, but to the time of infection that the animals were submitted, since the animals inoculated with 60,0000 blood forms were the ones which presented the most significant alterations.

HEADINGS:
Chagas disease; Trypanosoma cruzi; Megacolon; Barium Enema.

INTRODUÇÃO

A doença de Chagas (DC) ou tripanossomíase americana é importante antropozoonose que tem como agente etiológico o protozoário hemoflagelado Trypanosoma cruzi, como vetores insetos hematófagos da ordem Hemiptera, família Reduviidae e subfamília Triatominae^3,5. Estima-se que cerca de oito milhões de pessoas estão infectadas em todo o mundo, ocorrendo com maior frequência na América Latina, onde é endêmica²⁵.

No Brasil, a forma indeterminada ou assintomática é a mais comum (60-70%), seguida pelas formas cardíacas e digestivas (20-30% e 8-10%)¹. Entretanto, no Brasil Central e Chile, a forma digestiva da DC é predominante, porém não é relatado na Venezuela e América Central^8,6. Essas diferenças podem estar associadas a vários fatores, tais como linhagem genética do parasito, distribuição geográfica e estado imunológico do paciente⁹.

As manifestações clínicas da DC podem ser classificadas em fase aguda e crônica, fase aguda com elevada parasitemia podendo ser sintomática ou assintomática e duração de aproximadamente dois meses¹⁶. Em seguida, inicia-se a fase crônica com predomínio da forma indeterminada, na qual é caracterizada por um período latente longo e de baixa parasitemia, podendo durar de 10-30 anos. Após este período muitos pacientes infectados apresentam comprometimento de órgãos como coração, esôfago e cólon, caracterizando as formas cardíacas e digestivas¹⁶.

A forma digestiva é caracterizada pelo megaesôfago e/ou megacólon decorrente da inflamação e fibrose do esôfago e/ou cólon, levando a destruição do sistema nervoso autônomo e disfunção do órgão¹¹. O megacólon é causado pela desnervação plexular mioentérica na mucosa intestinal, causando distúrbios de motilidade associados à constipação e dilatação do colón^4,20. Tais complicações podem muitas vezes ser fatais resultando na perfuração do intestino e megacólon tóxico e óbito¹⁸.

Estudos sobre a DC vêm sendo realizados desde sua descoberta. Por conseguinte, diversos modelos experimentais têm sido utilizados^12,14,15. Nos primeiros trabalhos desenvolvidos por Oswaldo Cruz utilizou-se o macaco como modelo, ocasião em que foi inoculado Callithrix Penicillata parasitos isolados enviados por Carlos Chagas, encontrando-se tripomastigotas no sangue 30 dias após a inoculação^10,13,22,24.O macaco da espécie Cebus foi utilizado por Torres & Tavares (1958)²⁴ para o pesquisas da miocardite¹⁷, e o macaco Rhesus utilizado por Guimarães e Miranda para estudo do megaesôfago¹⁰. Pesquisas para DC ainda utilizaram diversos outros animais, tais como a cobaia para estudo em órgãos, o cão, pelo seu porte para estudo das lesões cardíacas; o camundongo por seu tamanho e sua suscetibilidade foi o preferido por muitos pesquisadores^7,12.

Diante deste contexto, faz-se necessário desenvolver e implantar uma proposta terapêutica para modelos experimentais através de animais de laboratório.

Assim, este trabalho teve como objetivo desenvolver um modelo experimental de megacólon em ratos inoculados com a cepa Y de T. cruzi para certificação do desenvolvimento da forma digestiva da doença.

MÉTODOS

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Conduta Ética no uso de Animais em Experimentação da Universidade Estadual de Maringá sob n^o 046/2009seguindo os princípios éticos em experimentação animal, adotados pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório.

Parasito

Foi utilizada a cepa Y (TcII)^19,26,27 proveniente de paciente da fase aguda, que se encontrava criopreservada em nitrogênio líquido na coleção de tripanosomatídeos do laboratório de DC da universidade.

Animais e inóculo

Foram utilizados 30 ratos (Rattus novegicus albinus) Wistar, machos, com idade de oito semanas e pesando entre 180-200g. Os animais foram obtidos a partir do biotério central da universidade e mantidos em gaiolas de polipropileno revestidas com serragem seca em condições ideais de temperatura (20-25°C), umidade (70%), ciclo claro-escuro, com água (clorada) e ração (Nuvilab Cr-1® da Nuvital®) disponíveis à vontade. Os animais foram separados em três grupos contendo 10 animais em cada, a inoculação foi via subcutânea com diferentes concentrações do parasito: Grupo A: 600000 tripomastigotas sanguíneos/0,1 ml de sangue; Grupo B: 1000000/0,1 ml de sangue; e Grupo C: 1500000/0,1 ml de sangue².

Enema opaco

Os animais foram sedados por administração de cloridrato de ketamina e cloridrato de xilazina na proporção de 1:1 administrado intramuscular, após a sedação foram colocados em mesa própria.Para realização do enema opaco foi introduzido um cateter de nelaton n°18, via retal e administrado 5ml de sulfato de bário com tempo de administração controlado e radiografados. A radiografia foi obtida com distância de foco de 1,5 m e tempo de exposição de 1s, em equipamento radiológico de 50000 Ma e com o auxílio de um paquímetro digital foi feita a avaliação da dilatação dos segmentos do cólon proximal, medial e distal, foi utilizada para se determinar o tempo zero (T₀).Após o exame radiológico os animais dos grupos A, B e C, foram inoculados como descrito anteriormente. Dezoito diasapós a inoculação foram coletados 5 µl de sangue para realização do exame a fresco².Sessenta dias após a inoculação (T₆₀) os animais foram submetidos a uma nova sedação e o enema foi repetido para avaliação da dilatação dos diferentes segmentos do cólon. Foram realizadas comparações entre as medidas obtidas no T₀ e no T₆₀.

Determinação das taxas de infecciosidade

A taxa de infecciosidade foi obtida pela razão entre o número de animais infectados e o número de animais submetidos ao exame a fresco X100. Foram considerados infectados os animais que apresentaram pelo menos uma forma sanguínea por campo.

Análise estatística

Os dados obtidos foram digitados em planilha do programa Microsoft Excel 2010 e analisados estatisticamente com o auxílio do BioEstat 5.0^®. A distribuição dos dados foi verificada com o teste Shapiro-Wilk. Uma vez que os dados apresentaram distribuição normal, os mesmos foram expressos como média ± desvio-padrão. Para a comparação entre os grupos foi utilizado o teste ANOVA-Tukey. O nível de significância adotado nos testes foi de 5%, ou seja, foram consideradas significativas as associações cujo p<0,05.

RESULTADOS

Os animais dos grupos A, B e C foram submetidos ao exame à fresco 18 dias após a inoculação, sendo possível determinar a taxa de infecciosidade que foi de 100%.Os animais do grupo A inoculados com 600000 tripomastigotas sanguíneos/0,1ml de sangue apresentaram no T₀ 11,5 mm de diâmetro intestinal. Já no T₆₀, observou-se dilatação significante de 50,4% (p<0,01) no cólon proximal, 36,1% (p<0,05) no cólon médio e 47,6% (p<0,05) no cólon distal, respectivamente (Tabela 1).

TABELA 1
Diâmetro médio e desvio-padrão dos segmentos proximal, médio e distal do cólon de ratos Wistar* inoculados com diferentes inóculos: 600000 (A), 1000000 (B) e 1500000 (C) tripomastigotas sanguíneos da cepa Y de T. cruzi

Diâmetro médio do segmento do cólon (mm)
		T0			T60
Grupo	Inóculo	Proximal	Médio	Distal	Proximal	Médio	Distal
A	600000	11,5a±1,6	7,0a ± 0,9	6,6a ± 0,8	17,3b±1,8	9,5b±1,1	9,7b±1,4
B	1000000	12,6±1,3	11,2±2,5	8,9a±1,91	16,8±2,3	11,0±1,9	10,5b±1,3
C	1500000	15,0±1,4	10,1±1,2	10,2a±1,3	18,9±1,8	11,5±1,2	11,7b±1,7

• *No tempo zero (T₀) e 60 dias (T₆₀). Letras diferentes numa mesma linha representam diferenças significantes (p<0,01).

Nos grupos B (1000000 tripomastigotas sanguíneos/0,1 ml de sangue) e C (150000 tripomastigotas sanguíneos/0,1 ml de sangue) as alterações se manifestaram somente no cólon distal com dilatação de 18,7% e 15,0% (p<0,01, Tabela 1, Figura1), respectivamente. Ao compararem-se os diferentes segmentos do cólon no T₀e no T₆₀para o grupo B e C observaram-se alterações significativas (p<0,05, Tabela 1, Figura1).

FIGURA 1
Exame radiológico (enema opaco) dos grupos A, B e C (T₀) à esquerda e A B e C (T₆₀) à direita, mostrando dilatação do cólon proximal e distal. O grupo A apresenta imagem de duplo contraste em delgado por incompetência da válvula ileocecal e, grupo C imagem de fezes no cólon, demonstrando dificuldade no esvaziamento colônico.

É possível observar que o surgimento do megacólon não está diretamente relacionado à quantidade do inóculo, mas sim ao tempo de infecção que os animais foram submetidos. Ao se comparar o diâmetro intestinal dos animais inoculados com 600000 formas tripomastigotas no T₀ de infecção com T₆₀dias após infecção, observou-se dilatação significativa entre os segmentos, proximal, medial e distal (p<0,01), indicando ser o rato da espécie Wistar bom modelo experimental para estudos de megacólon. Além disso, ao se comparar o diâmetro intestinal entre os diferentes segmentos dentro do T₀e o T₆₀observou-se variação entre eles (p<0,05).

DISCUSSÃO

No presente estudo utilizaram-se ratos da linhagem Wistar para desenvolver um modelo experimental para as alterações digestivas causadas pela DC. Foi optado por utilizar essa espécie por serem de fácil manuseio e por já existir protocolos para sua utilização como, por exemplo, anestesia e cuidados de bioterismo. No entanto, outro fator importante a ser analisado é a idade do animal, quanto mais jovem mais suscetível à doença^7,17. Foram utilizados somente machos para esse modelo experimental, para evitar alterações ligadas ao ciclo hormonal das fêmeas²². Segundo Soares et al. (2012)²¹ ao estudar fêmeas de camundongos infectadas com T. cruzi demostrou-se serem elas mais resistentes à doença que os machos.

Apesar de a literatura demonstrar que a quantidade do inóculo é diretamente proporcional à gravidade da doença^10,13,22,24, estes resultados demonstraram que as alterações observadas no diâmetro do cólon dos animais não estão diretamente relacionadas ao tamanho do inóculo, mas sim ao tempo de infecção que os animais foram submetidos.

De acordo com experiências obtidas no laboratório da universidade, existe grande diferença em relação aos mecanismos de resistência entre o rato e o camundongo infectados por T. cruzi. O camundongo inoculado com 1400 tripomastigotas sanguíneos em 0,1 ml de sangue da cepa Y apresenta alterações de pelagem e neurológicas. Já os ratos, embora os inóculos utilizados neste estudo sejam maiores que os utilizados em camundongos, não foi observada nenhuma alteração clínica nos grupos estudados no período de 60 dias; porém, estes achados são relatados em tempo de observações maiores.

A realização do enema opaco serviu para a avaliação da existência ou não de dilatação do cólon caracterizando a forma intestinal da DC que se dá pela dilatação alongamento e hipertrofia da parede do cólon, principalmente pela camada muscular circular em consequência às lesões da musculatura e dos neurônios do sistema nervoso entérico, especialmente dos plexos de Meissner e Auerbach. Esta dilatação esteve presente em todos os grupos avaliados em maior ou menor índice; porém, no grupo A foi observado as maiores alterações.

Houve dificuldade de administração do contraste por presença de fezes acumuladas por falta de esvaziamento completo do cólon no exame após 60 dias, o que fez alguns animais terem refluxo do bário pelo ânus; isto pode ser explicado por discinesia do cólon pela doença, sendo que este fato não foi observado nos animais no T₀ (antes da inoculação); esta dificuldade também foi relatada por Okumura, (1961)¹⁴. A utilização de paquímetro digital, permitiu mensuração precisa do diâmetro do órgão.

Durante os exames foi notada maior distensão do abdome ao ser injetado contraste após 60 dias (grupos B e C) e nas radiografias do grupo C foi observado progressão maior de ar, com formação de duplo contraste com dilatação do ceco e intestino delgado demonstrando incontinência da válvula ileocecal, achado semelhante ao descrito por Okumura & Correia (1953)¹³ em camundongos.

CONCLUSÃO

O modelo proposto mostrou-se factível para estudos in vivo das alterações decorrentes da infecção pelo T. cruzi e alterações funcionais do cólon. Além disso, as alterações manifestadas no cólon não são diretamente proporcionais ao tamanho do inóculo, mas sim ao tempo de infecção que os animais foram submetidos, visto que os inoculados com 600000 formas sanguíneas foram os que mais apresentaram alterações significantes. Os resultados obtidos demostraram a importância da continuidade da utilização do rato para se estudar as alterações funcionais do cólon .

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• Fonte de financiamento:

  não há

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  2018

Histórico

• Recebido
  28 Nov 2017
• Aceito
  06 Fev 2018